? ? 反向遺傳學(xué)是從病毒基因組的全長(zhǎng)cDNA拷貝中產(chǎn)生病毒顷帖，被稱(chēng)為“感染性克隆”渤滞，并且是現(xiàn)代病毒學(xué)中最強(qiáng)大的遺傳工具之一。 重組DNA技術(shù)使我們能夠在分子水平上分析和操作基因組妄呕。然而，對(duì)于非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，基因組在復(fù)制過(guò)程中不會(huì)進(jìn)入DNA階段论咏，直接操作脆弱的RNA基因是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。流感病毒的基因組分段且為負(fù)鏈蠢护，所以流感病毒的遺傳操作更加苛刻养涮。
? ? 為了作為啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的功能模板，流感病毒RNA（vRNA）必須通過(guò)聚合酶復(fù)合物轉(zhuǎn)錄為正義mRNA贯吓，其中包括三種病毒聚合酶（PB2，PB1和PA） 和核蛋白（NP）介评。流感病毒具有由8個(gè)RNA基因區(qū)段組成的基因組，必須對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和包裝以完成病毒復(fù)制周期们陆。
? ? 流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)于1999年由兩個(gè)不同的研究小組建立，依靠細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶I（PolⅠ）合成流感病毒RNA椅文。RNA聚合酶I是一種豐富的核酶，可轉(zhuǎn)錄核糖體RNA恤筛。RNA聚合酶I在確定的啟動(dòng)子和終止子序列處起始并終止轉(zhuǎn)錄芹橡，并且所得的轉(zhuǎn)錄物在5'或3'末端不含有額外的核苷酸。因此林说，這種酶非常適合在細(xì)胞核中產(chǎn)生流感病毒vRNA。雖然流感病毒拯救系統(tǒng)在不斷完善提高豪直，但使用RNA聚合酶I系統(tǒng)合成vRNA的基本概念仍然相同。
? ? 目前弓乙，流感病毒的重新合成主要通過(guò)用8-12個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)钧惧。其中，8質(zhì)粒系統(tǒng)拯救甲型流感病毒最為廣泛浓瞪。8種質(zhì)粒含有編碼RNA聚合酶I可識(shí)別的啟動(dòng)子和終止子，在啟動(dòng)子和終止子之間分別含有每條流感病毒分段基因組的cDNA涂乌。8質(zhì)粒系統(tǒng)的蛋白質(zhì)由PolⅡ轉(zhuǎn)錄翻譯英岭，且此系統(tǒng)至少需要表達(dá)4種蛋白（PA, PB1, PB2和NP）。一般的8質(zhì)粒系統(tǒng)可轉(zhuǎn)錄流感病毒的8個(gè)基因诅妹，翻譯流感病毒的10個(gè)蛋白。翻譯完整的流感病毒蛋白荧库，能夠提高流感病毒的拯救效率。
protocol：
克隆8質(zhì)粒：
使用含人類(lèi)polⅠ序列的載體作為拯救系統(tǒng)的表達(dá)載體场刑，構(gòu)建8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)蚪战。此載體為雙向雙表達(dá)載體，在polⅡ啟動(dòng)子(CMV)和終止序列(SV40)之間反向插入了人類(lèi)polⅠ啟動(dòng)子和鼠polⅠ終止序列邀桑。將流感病毒的8個(gè)cDNA（包括UTR和ORF）插入該載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后贼急，polⅠ負(fù)責(zé)合成流感病毒單股負(fù)鏈RNA捏萍，polⅡ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄流感病毒正鏈mRNA，隨后翻譯流感病毒蛋白令杈。該質(zhì)粒較特殊，在插入片段的前后均有polyA尾掉丽，無(wú)法用通用引物測(cè)序异雁，需要使用每個(gè)基因的特異性引物進(jìn)行測(cè)序捶障。
拯救甲型流感病毒：
1. 將HEK-293T接種到6孔板中片迅，培養(yǎng)24小時(shí)至少95% confluence皆辽。
? ? 注：因轉(zhuǎn)染會(huì)加入大量的有毒性轉(zhuǎn)染試劑，故細(xì)胞狀態(tài)需要良好耻台、數(shù)量需求較多空另。由于人類(lèi)polⅠ啟動(dòng)子的物種特異性，只能使用具有高轉(zhuǎn)染效率的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞（293T或Vero細(xì)胞）進(jìn)行流感病毒的包裝。一般來(lái)說(shuō)坝咐，293T拯救效果強(qiáng)于Vero析恢。由于MDCK細(xì)胞支持許多流感病毒的生長(zhǎng)，并且可以在與293T細(xì)胞相同的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)映挂，因此共培養(yǎng)的293T-MDCK細(xì)胞（1：1）可用于提高某些流感病毒株的拯救效率。
2. 在DMEM培養(yǎng)基（不含F(xiàn)BS）中帽撑，每個(gè)質(zhì)粒1μg鞍时，8個(gè)質(zhì)粒共計(jì)8μg，與轉(zhuǎn)染試劑混合寸癌，室溫下靜止15-30分鐘。
? ? 注：質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：3磷蛹；質(zhì)粒：PEI=1：4溪烤。DMEM可換成Opti-MEM。
3. 更換HEK-293T的DMEM培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）檬嘀，將質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體緩緩滴入6孔板中。
4. 將細(xì)胞放于含5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)掂铐。
? ? 注：35℃環(huán)境也可揍异。
5. 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過(guò)的胰酶衷掷，繼續(xù)培養(yǎng)。
? ? 注：TPCK胰酶用于切割流感病毒的HA蛋白雨涛，使病毒具有感染性。某些病毒株可不用此胰酶替久。
6. 轉(zhuǎn)染后48小時(shí)或72小時(shí)后，收集HEK-293T細(xì)胞上清液旧困。此時(shí)稼锅，流感病毒即在上清液中吼具，但是滴度極低。
? ? 注：反復(fù)凍融3次細(xì)胞有助于細(xì)胞內(nèi)的流感病毒釋放拗盒。
7. 將收集的上清液滴入MDCK細(xì)胞中锥债，流感病毒感染MDCK細(xì)胞以擴(kuò)增。
? ? 注：同樣需要加入終濃度為1μg/ml的TPCK處理過(guò)的胰酶登夫。用雞胚培養(yǎng)流感病毒效果極佳：接種到9-11天齡的SPF雞胚胎中允趟。孵育48小時(shí)后收獲羊膜尿囊液恼策。感染性病毒的存在可通過(guò)血凝素（HA）試驗(yàn)確認(rèn)。
8. 感染后48小時(shí)涣楷，收集MDCK細(xì)胞上清液抗碰，進(jìn)行plaque assay進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。
? ? 注：一般測(cè)出的滴度處于5x10^6Pfu/ml左右弧蝇。若想增加流感病毒滴度，繼續(xù)將病毒感染MDCK以進(jìn)行擴(kuò)增沙峻。
9. 應(yīng)通過(guò)對(duì)8個(gè)病毒基因片段中的每一個(gè)進(jìn)行測(cè)序來(lái)確認(rèn)拯救病毒的身份鹃觉。
10. 病毒液可在4℃存放數(shù)周睹逃。-80℃可長(zhǎng)期儲(chǔ)存祷肯。
參考資料：
1. 劉麗琦. HgN2 禽流感病毒致病性的初步研究及反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建[D]. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心, 2009.
