Original 表觀遺傳學(xué)習(xí)小組 Epigenetics表觀遺傳學(xué)
本文根據(jù) 2016 年 8 月復(fù)旦大學(xué)倪挺教授在「表觀基因組學(xué)暑期國(guó)際講習(xí)班」中的報(bào)告整理而成梁呈，本文采用第一人稱敘述暗赶，文中的“我”皆指倪挺教授朱监。報(bào)告原視頻詳見：表觀遺傳系列視頻13 | 復(fù)旦倪挺：表觀遺傳調(diào)控與基因剪接（附PPT）必指，視頻全長(zhǎng)約 2h34min萤厅，文字約 1.6 萬字阎毅。雖然是四年前的視頻目代，但內(nèi)容依然不過時(shí)屈梁，可幫助我們快速建立對(duì)轉(zhuǎn)錄水平表觀調(diào)控的認(rèn)識(shí)。
倪挺博士榛了，復(fù)旦大學(xué)博士生導(dǎo)師在讶。2000 年獲北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)系學(xué)士學(xué)位，2000-2006 年碩博連讀于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院霜大，并于 2006 年獲植物學(xué)博士學(xué)位构哺。2007-2010 年在美國(guó)杜克大學(xué)基因組科學(xué)與政策研究所從事博士后研究。2010-2012 年在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 (NIH) 擔(dān)任助理研究員 (Research Fellow)僧诚。2012 年受聘為復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員。以下為正文：大家好蝗碎，今天跟大家分享「表觀遺傳與基因剪接」湖笨。我此前的研究主要針對(duì)轉(zhuǎn)錄過程開發(fā)一些方法，探究轉(zhuǎn)錄如何起始蹦骑、中間調(diào)控機(jī)制以及 3’-端的加尾慈省，此外還包括 3’-UTR和反義 RNA 的調(diào)控等。2012 年來到復(fù)旦大學(xué)后眠菇，我主要選擇了兩個(gè)體系：細(xì)胞衰老和細(xì)胞活化边败，聚焦 RNA 水平的調(diào)控，特別關(guān)注內(nèi)含子保留這種可變剪接類型捎废，及其在 T 細(xì)胞活化過程中的功能排截；此外垦垂，還研究選擇性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation）差购，即決定 RNA 在哪個(gè)位置加上 Poly(A) 尾巴的機(jī)制彰居，從而對(duì) mRNA 的命運(yùn)產(chǎn)生影響溶握。研究手段主要采用干濕結(jié)合肉微，試圖觀察新現(xiàn)象并探討其生物學(xué)機(jī)制。
此前頡偉老師其實(shí)已經(jīng)把 DNA 甲基化和組蛋白修飾之間的關(guān)系講得比較清楚了琅摩，DNA 甲基化可以影響組蛋白修飾，反過來锭硼，組蛋白修飾也可以影響 DNA 甲基化房资。我們今天講的選擇性剪接，能否與 DNA 甲基化和組蛋白修飾聯(lián)系在一起呢檀头？
通過這個(gè)課程轰异，希望大家思考圖 2 中的這四個(gè)箭頭是否成立？如果成立暑始，證據(jù)是什么搭独？可能的機(jī)制是什么？這四個(gè)問題的內(nèi)容是: (1) 組蛋白修飾是否可以影響 RNA 剪接廊镜？(2) RNA 剪接是否可以影響組蛋白修飾牙肝？(3) DNA 甲基化是否會(huì)影響 RNA 剪接？(4) RNA 剪接本身對(duì) DNA 甲基化有沒有影響嗤朴？針對(duì)這幾個(gè)主要問題配椭，我的課分為以下六個(gè)部分: (1) 首先回顧可變剪接的生物學(xué)意義；(2) 有了意義之后雹姊，我們想要更好地去檢測(cè)它股缸，從單基因的層面如何檢測(cè)和驗(yàn)證，以及如何檢測(cè)整個(gè)基因組的變化容为；(3) 如果存在這樣的變化乓序，上游的調(diào)控機(jī)制是什么寺酪？是什么東西導(dǎo)致了它的改變坎背？(4) 組蛋白修飾和 (5) DNA 甲基化跟它之間的關(guān)系是怎樣的？(6) 染色質(zhì)修飾與基因轉(zhuǎn)錄終止的關(guān)系寄雀。選擇性剪接是中間的環(huán)節(jié)得滤，mRNA 的加工最后一個(gè)環(huán)節(jié)是加上 Poly(A) 尾巴，必須完成這個(gè)過程盒犹，mRNA 才能發(fā)揮它的作用懂更。
可變剪接的生物學(xué)意義
現(xiàn)代的遺傳學(xué)主要探究基因型和環(huán)境如何相互作用，從而決定生物的表型急膀。在這個(gè)框架下沮协，中心法則至關(guān)重要，也就是說卓嫂，基因型是如何通過表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)慷暂，從而對(duì)表型產(chǎn)生影響。在這個(gè)過程中晨雳，環(huán)境可以通過多種方式發(fā)揮作用行瑞，比如可能引起 DNA 的改變奸腺；除了引起 DNA 的改變，環(huán)境更多地只影響基因的表達(dá)血久，那么通過什么方式呢突照？我們認(rèn)為，DNA 甲基化和組蛋白修飾以及其他的因素在里面起到非常重要的作用氧吐，即可以通過影響中心法則的中間環(huán)節(jié)影響表型讹蘑。
中心法則看起來非常簡(jiǎn)單，DNA 通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 RNA副砍，RNA 通過翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)衔肢。但在這個(gè)簡(jiǎn)單的過程中，存在非常復(fù)雜的調(diào)控豁翎。在原核和真核生物中角骤，雖然執(zhí)行的都是中心法則，但調(diào)控不一樣心剥。在原核生物中邦尊，轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎是同時(shí)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)錄出來的 RNA 馬上有核糖體結(jié)合上去翻譯出蛋白質(zhì)优烧。但真核生物有細(xì)胞核蝉揍，轉(zhuǎn)錄出來的 mRNA 需要加工為成熟的 mRNA，被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中畦娄，才能發(fā)揮它的作用又沾；在這個(gè)過程中，存在位置的調(diào)控熙卡；另外杖刷，mRNA 還面臨著非常復(fù)雜的加工。因此驳癌，原核和真核生物在遺傳信息的流動(dòng)和調(diào)控上是非常不一樣的滑燃。
我們仔細(xì)看一下真核生物的基因表達(dá)調(diào)控 （圖5），這是一個(gè)多步驟的調(diào)控颓鲜，分為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的調(diào)控表窘。在細(xì)胞核里面，DNA 甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄甜滨，還存在轉(zhuǎn)錄的起始和轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控乐严。最初轉(zhuǎn)錄出來的是初始轉(zhuǎn)錄本，里面包含內(nèi)含子衣摩，在此后的加工過程中昂验，5’-端需要加上帽子，內(nèi)含子需要切掉，還需要加上 Poly(A) 尾巴凛篙，才能變成成熟的 mRNA黍匾。在這個(gè)過程中，還有一系列的蛋白結(jié)合上去呛梆，最后輸出到細(xì)胞質(zhì)中锐涯。在細(xì)胞質(zhì)中，會(huì)面臨多重命運(yùn)填物，一開始會(huì)翻譯纹腌，翻譯到一定豐度后，還會(huì)面臨降解的命運(yùn)滞磺，不同 mRNA 降解的速率也不一樣升薯，這里面也存在一些調(diào)控。在蛋白質(zhì)水平击困，翻譯出來的多肽也面臨著蛋白質(zhì)的加工和折疊涎劈，以及蛋白質(zhì)激活（比如磷酸化或去磷酸化）和蛋白質(zhì)降解。真核生物的基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)多步驟的非常復(fù)雜的過程阅茶，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的失調(diào)都可能導(dǎo)致生理的失衡蛛枚，最終導(dǎo)致疾病。
舉幾個(gè)例子脸哀，第一個(gè)例子是早衰 (premature)蹦浦，核纖層蛋白基因 LMNA 的可變剪接的失衡是導(dǎo)致早衰最重要的原因。在早期對(duì)病理進(jìn)行檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)撞蜂，在父母中都沒有出現(xiàn)突變盲镶，但是在小孩中出現(xiàn)了突變，即這是一種新發(fā)突變 (de novo mutation)蝌诡，這種突變并不是由父代傳給子代的溉贿，但這種突變會(huì)導(dǎo)致很嚴(yán)重的問題，從基因的角度來看送漠，這種突變對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物造成很嚴(yán)重的影響顽照。在正常情況下由蘑，LMNA 有三個(gè)外顯子形成正常的剪接闽寡，翻譯出的蛋白含有 C-端結(jié)構(gòu)域；但是由于突變的存在尼酿，導(dǎo)致了剪接方式的改變爷狈，這種突變使它發(fā)生了 5’-可變剪接位點(diǎn) (alternative site) 的選擇，使得可翻譯的區(qū)域變短了裳擎，最后使得蛋白質(zhì)的 C-端完全不一樣涎永，失去定位的信號(hào)，蛋白在細(xì)胞核的分布變得紊亂。
特別要強(qiáng)調(diào)的是，剪接依賴于順式作用元件（DNA 上的序列）和反式作用因子（與這些序列結(jié)合的蛋白）胖替。而這兩個(gè)例子研儒，一個(gè)是可變剪接的順式作用元件的突變豫缨，另一個(gè)是反式作用因子剪接因子的改變，這兩者都可能導(dǎo)致剪接方式的改變端朵，最終引起疾病好芭。可變剪接是蛋白質(zhì)組豐富度的重要貢獻(xiàn)者冲呢，但近來的研究發(fā)現(xiàn)栓撞，很多基因也存在著很多 Poly(A) 位點(diǎn)的選擇 (alternative cleavage and polyadenylation, APA)，這種選擇也很大程度上貢獻(xiàn)了蛋白質(zhì)組的選擇性碗硬。在這個(gè)例子中瓤湘，并沒有改變編碼區(qū)的序列，翻譯出來的蛋白質(zhì)是一樣的恩尾，但是由于選擇了近端的 Poly(A)位點(diǎn)弛说，使得多出來的 3’-UTR 不僅被 miRNA 調(diào)控，同時(shí)也會(huì)被特殊的 RNA 結(jié)合蛋白調(diào)控翰意。miRNA 在 3’-UTR 的結(jié)合會(huì)切割 mRNA木人，或者抑制 mRNA 的翻譯，最終使得蛋白水平下降冀偶，有些 RNA 結(jié)合蛋白也會(huì)起到類似的效果醒第。有的是抑制，有的是促進(jìn)进鸠，效果迥異稠曼，取決于序列和蛋白本身。通過這種方式客年，逃脫 miRNA 的調(diào)控霞幅。
2009 年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)量瓜，相對(duì)于癌旁細(xì)胞司恳，癌細(xì)胞中有很多傾向于使用短的 3’-UTR 的轉(zhuǎn)錄本，即轉(zhuǎn)錄本是以短的形式存在的绍傲，比如 IGF2BP1/IMP-1 因?yàn)槭褂枚痰?Poly(A) 而逃脫了 miRNA 的調(diào)控[3]扔傅，使得蛋白質(zhì)水平急劇上升，導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖烫饼，是引起細(xì)胞癌變的重要因素猎塞。這個(gè)例子說明，RNA 加工過程（特別是可變剪接和末端的加工）的失衡也是引起疾病的重要因素枫弟。
可變剪接的檢測(cè)及生信分析策略
研究可變剪接和 3’-端的加工具有重要的意義邢享，可以幫我們理解很多重要的生物學(xué)事件鹏往。既然它們?nèi)绱酥匾敲慈绾胃玫匕l(fā)現(xiàn)和分析呢骇塘？這就涉及到可變剪接的檢測(cè)及生信分析策略。
可變剪接的類型
大部分基因含有內(nèi)含子韩容，在編碼的過程中款违，內(nèi)含子的信息不需要傳遞給蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄完成后形成的初始 mRNA 后群凶，所有的內(nèi)含子都切掉插爹，這是一種正常的剪接方式，即組成型剪接 (constitutive splicing)请梢≡玻可變剪接 (alternative splicing) 跟它有一定區(qū)別，例如在正常情況下毅弧，三個(gè)外顯子在一起气嫁；如果發(fā)生了可變剪接，由于某些原因中間的外顯子被跳過够坐，形成的 mRNA 不一樣寸宵，這種序列的不一樣可能使蛋白質(zhì)中間少了一段，或者中間的外顯子不是 3 的倍數(shù)的話元咙，那么它會(huì)使得后面的蛋白質(zhì)完全不一樣了梯影，改變了蛋白質(zhì)的組成。
可變剪接分為哪幾種類型呢庶香？復(fù)雜的話可分為 8 種甲棍，簡(jiǎn)單的看至少有 5 種比較重要。第一種叫外顯子跳躍 (exon skipping)赶掖，中間的外顯子可以被跳掉救军，取決于中間外顯子兩邊的順式作用元件是什么以及有哪些反式作用因子跟它結(jié)合。另一種類型倘零，5’-端的選擇唱遭，比如我們剛才舉的例子，RBM4 去調(diào)控基因剪接呈驶，實(shí)際上就是通過這種方式拷泽。5’-端是看具體選擇哪個(gè)位置，取決于位點(diǎn)的強(qiáng)弱袖瞻。3’-端面臨同樣的情況司致，到底選擇哪個(gè)3’-端，這也就是 alternative 3’ splice site聋迎；另一種比較有意思的是互斥外顯子 (mutually exclusive exons)脂矫，中間有兩個(gè)外顯子，但是細(xì)胞只會(huì)選擇中間的一個(gè)來發(fā)揮作用霉晕，在蛋白質(zhì)上的體現(xiàn)是庭再，蛋白質(zhì)的 domain 是換成這個(gè)還是那個(gè)捞奕，從而決定了蛋白質(zhì)的功能。另一個(gè)是內(nèi)含子保留拄轻，在很多時(shí)候颅围，那段序列被認(rèn)為是內(nèi)含子，被剪切掉了恨搓，但是在特殊的情況下院促，細(xì)胞認(rèn)為這可能是外顯子的信號(hào)，在這個(gè)過程中會(huì)被保留下來斧抱，即內(nèi)含子保留常拓。這幾種方式，從造成的效應(yīng)上來看辉浦，它們改變蛋白的“質(zhì)”和“量”墩邀。“質(zhì)”的話盏浙，在早衰癥的例子中眉睹，蛋白質(zhì)的 C-端完全不一樣，更多的是改變了蛋白質(zhì)的“質(zhì)”废膘；如何理解改變蛋白質(zhì)的“量”呢竹海，在這幾個(gè)例子中，好像都沒有體現(xiàn)丐黄。實(shí)際上斋配，一個(gè)基因可變剪接刹碾，并不是切掉或者完全保留粹污，而是有一部分是剪切掉坚嗜，有一部分是留著的窗市，如果說被剪切掉的 isoform（異構(gòu)體）沒有功能的話，與最后翻譯出來的另一種剪接形式的異構(gòu)體形成了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系哮洽，原來 100% 都剪接掉了凌节，現(xiàn)在分流給了另一個(gè)不翻譯的轉(zhuǎn)錄本洒擦，原來那個(gè)翻譯的蛋白的量就相對(duì)減少蕉斜，這就是改變了特定蛋白的量逾柿。所以，可變剪接至少可以通過改變蛋白的“質(zhì)”和“量”對(duì)下游產(chǎn)生影響宅此。
可變剪接的鑒定及生信分析策略
如何發(fā)現(xiàn)可變剪接机错？可通過 RNA-seq 和 RT-PCR。最早的時(shí)候父腕，大家實(shí)際上是在單基因上進(jìn)行驗(yàn)證弱匪，可通過 RT-PCR 或 Northern Blot 來看；如果要從整個(gè)基因組水平來看的話璧亮，早期可通過 microarray萧诫，設(shè)計(jì)剪切特異性的探針就能夠達(dá)到這個(gè)目的斥难。但近年來，通過 RNA-seq 結(jié)合一些生信的辦法就可以實(shí)現(xiàn)财搁。
從原理性上講蘸炸，如果有幾個(gè)不同的外顯子躬络，可在不同的外顯子上設(shè)計(jì)引物尖奔，或者說跨外顯子的引物。如果發(fā)生了外顯子跳躍穷当，設(shè)計(jì)類似圖 10 中的引物提茁，兩個(gè)不同的 isoform 擴(kuò)增出來的產(chǎn)物是不一樣的，直接跑膠就可以看到差別馁菜。實(shí)際上并不是一個(gè)有或無茴扁，可能是強(qiáng)和弱的關(guān)系，這個(gè)只是個(gè)示意圖汪疮。對(duì)于 Northern Blot峭火，同樣也是設(shè)計(jì) jumping 特異性的探針，跳過外顯子區(qū)來設(shè)計(jì)智嚷，這是比較常規(guī)的思路卖丸。
對(duì)于整個(gè)基因組，也可以設(shè)計(jì)一些 jumping 特異的探針盏道，如果你看到有信號(hào)的話稍浆，說明這個(gè) isoform 存在，信號(hào)強(qiáng)弱可以初步反映這個(gè)異構(gòu)體豐度的高低猜嘱。對(duì)于 RNA-seq衅枫，它實(shí)際上測(cè)到的是一個(gè)短序列，通過這個(gè)短序列去比對(duì)到基因組和轉(zhuǎn)錄組上朗伶，其實(shí)可以區(qū)分弦撩。通過這樣一種方式，就可以知道幾個(gè)不同的 isoform 之間的比例變化孤钦。
目前 RNA-seq 是發(fā)現(xiàn)全基因組剪接變化最有效的方法偏形，當(dāng)然這里面還存在著諸多問題和挑戰(zhàn)觉鼻。RNA-seq 通常要做兩輪 Poly(A) 選擇坠陈，把這些短序列去 mapping捐康，通過分析計(jì)算有沒有出現(xiàn)外顯子的跳躍或者其他形式解总，還可以比較兩個(gè)不同組織或者處理前后的改變花枫，幫助你推斷它可能參與的生物學(xué)過程掏膏。我想強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是劳翰，數(shù)據(jù)產(chǎn)生的好壞對(duì)你后面的分析是非常重要的。如果實(shí)驗(yàn)有問題馒疹，后面的分析 pipeline 再靠譜也無濟(jì)于事佳簸。比如說處理正常和疾病的兩組樣本，今天做正常的颖变，明天做疾病的生均，這個(gè)時(shí)候再進(jìn)行比較就可能出問題，因?yàn)榇嬖谂涡?yīng)腥刹÷黼剩可變剪接分析涉及的過程很多，包括怎樣把這些位置 mapping 回去肛走，怎樣組裝轉(zhuǎn)錄本以及推測(cè)其表達(dá)量漓雅，這個(gè)表達(dá)量當(dāng)然是整體的表達(dá)量，還要根據(jù) junction 的位置去預(yù)測(cè)不同 isoform 的表達(dá)量朽色，雖然不一定那么準(zhǔn)邻吞，但可在基因表達(dá)比較高時(shí)給你一個(gè)還不錯(cuò)的參考，然后還可以進(jìn)行一些可視化。接下來還有一些對(duì)于剪接特異性的分析旺遮，有各種不同的軟件耿眉，都有它自己的優(yōu)缺點(diǎn)，一定要非常仔細(xì)的去看它的 manual 以及相關(guān)文章债鸡，還要和作者進(jìn)行密切的交流厌均。利用 RNA-seq 進(jìn)行初步的基因表達(dá)差異和轉(zhuǎn)錄本分析，TopHat 目前用的比較多镊屎。原理上是怎么區(qū)分不同的轉(zhuǎn)錄本的呢连锯？舉個(gè)例子拼弃，一個(gè)基因有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本，A盯孙、B 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)是一樣的，但另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本 C骑晶，用了不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（在內(nèi)含子區(qū)域），對(duì)于使用相同的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的話仔雷，它唯一的差別實(shí)際上是內(nèi)含子跳躍與否。對(duì)于這樣的三個(gè)基因喻频，如果基因表達(dá)比較高，測(cè)的短序列 reads 比較高姻蚓，你可以初步地對(duì)每個(gè)占多少比例進(jìn)行分析，用的策略是看它特有的 reads加叁。
比如對(duì)于 A、B豫柬，如果看到第一個(gè)外顯子，你至少可以知道 A、B 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的總量驰吓，那么在這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本中怎樣區(qū)分比例多少，就看中間外顯子信號(hào)的多少翁涤，實(shí)際上就是用 isoform 特有的區(qū)域來區(qū)分；對(duì)于轉(zhuǎn)錄本 C湖雹，你可以看到 C 中左邊的信號(hào)。通過這樣的比較瀑踢，你就可以區(qū)分不同的特征的比例多少楞遏，前提是基因的表達(dá)量比較高竣蹦，基因測(cè)序的 reads 分布比較均勻，可以給你大致的線索远寸，然后你再設(shè)計(jì)一些 isoform 特異性的引物來驗(yàn)證。有了這些之后灶芝，你可以進(jìn)行初步的推斷。你可以運(yùn)用一些工具畫出三個(gè)或者四個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本在不同細(xì)胞或者不同時(shí)期的變化女器。如果看到了差別，僅說明轉(zhuǎn)錄本存在與否丧诺，但對(duì)于生物學(xué)過程來說，這個(gè)存在與否的調(diào)控看不出來呵晚，它沒有動(dòng)態(tài)的改變，而如果特定的轉(zhuǎn)錄本存在動(dòng)態(tài)改變的話劫瞳，實(shí)際上是對(duì)它功能的暗示志于，在這個(gè)過程中，它有可能是參與了這個(gè)過程，當(dāng)然也有可能是一個(gè)伴隨的現(xiàn)象杖挣，但至少可以給你一些線索。
在可視化的展示（圖14）中歌殃，對(duì) regucalcin基因來講，兩個(gè)不同狀態(tài)之間基因總體的表達(dá)量差了約兩倍匀泊，但如果這個(gè)基因有四種不同的 isoform抡医，那么是每個(gè) isoform 都增加了兩倍，還是說其中只有幾個(gè) isoform 發(fā)生了改變水孩？因?yàn)檠芯抗δ軙r(shí)要聚焦于不同的 isoform秤标，不同 isoform 翻譯的蛋白可能不一樣，這個(gè)時(shí)候能夠把不同 isoform 區(qū)分開的話衙猪，你可能就會(huì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上其中一個(gè) isoform 占的比例比較大饶号，可能是它增加了兩倍，所以后面的功能驗(yàn)證或分析就可以集中在這個(gè) isoform 上算谈。通過這樣的可視化，你也知道原來這個(gè) isoform 是真的存在的高每，通過這樣一個(gè)側(cè)面的證據(jù)可以幫助你更好地去鎖定研究對(duì)象。
這個(gè)實(shí)際上是一個(gè)很整體很籠統(tǒng)的分析，具體做的時(shí)候?qū)嶋H上存在很多的挑戰(zhàn)乔煞。相對(duì)于基因總體的表達(dá)量來說，分析它的可變剪接的難度是相對(duì)較高的空骚。以前測(cè)的序列比較短刻诊，現(xiàn)在雖然測(cè)的比較長(zhǎng)，但總體上來講仍然不是那么長(zhǎng)粟判，比如說能夠覆蓋兩個(gè) exon，但覆蓋不了整個(gè)轉(zhuǎn)錄本呻澜，你可能只能發(fā)現(xiàn)這個(gè)內(nèi)含子和這個(gè)外顯子包括與否，但如果說這邊有一個(gè)外顯子跳躍，后面還有一個(gè)外顯子跳躍屏镊，你無法判斷這兩個(gè)外顯子的跳躍是不是在一個(gè)轉(zhuǎn)錄本上，短的序列仍然不能回答蔚出。所以以后在讀長(zhǎng)上要有突破稀余，包括加強(qiáng)測(cè)序質(zhì)量盒蟆，測(cè)序的時(shí)候末端序列不是那么準(zhǔn)的讨惩，但我們?nèi)タ?junction reads，通常把它一劈為二处面，這邊多一點(diǎn)，這邊少一點(diǎn)野揪，mapping 回去；有的地方測(cè)序質(zhì)量比較差的話，mapping 回去也會(huì)差通熄，mapping 出來的基因可能也是錯(cuò)的，這是我們需要注意的赏枚。另一個(gè)我們需要注意的問題是讀長(zhǎng)分布的不均勻。測(cè)到的 reads 分布在轉(zhuǎn)錄本的不同區(qū)域栗恩，但你去看各種不同的 track 圖時(shí)乳乌，有的地方特別高，有的地方特別低磷瘤，原因多種多樣。比如有的地方 GC 含量特別高，就不容易測(cè)出來摔蓝，特別的低也不容易測(cè)出來，或者有重復(fù)序列猜谚。這樣的 reads mapping 回去的時(shí)候，它不知道是這個(gè)基因的览芳，所有我們就把它過濾掉了，因?yàn)闆]辦法告訴你是哪個(gè)地方來源的。這個(gè)時(shí)候 junction reads 比較高的地方魁袜，你就能夠判斷得比較準(zhǔn)，但有的 junction 根本沒有 reads 在這個(gè)地方 cover鞠呈，這時(shí)候也會(huì)對(duì)可變剪切的分析造成影響。這種基因內(nèi)部分布的不均勻可能是導(dǎo)致 RNA-seq 分析逐漸下降的一個(gè)很重要的原因窘茁。另外，有些剪切本本身表達(dá)量就比較低驼抹，意味著 reads 中能夠貢獻(xiàn)到這個(gè)地方的量就特別的小敏簿。對(duì)可變剪切分析而言温数，你可能只能分析表達(dá)量相對(duì)比較高的地方，至少可以給你得出一些線索猜煮。另外，不同的分析軟件得到的結(jié)果是不一樣的，原因多種多樣搞挣，可能只能根據(jù)技術(shù)不停的發(fā)展和認(rèn)識(shí)的深入去克服這個(gè)問題仓犬。但我認(rèn)為很重要的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是怎樣更好地和實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來，如果分析的好的話叽躯，可能 60-70% 可以驗(yàn)證；分析不好的話畔况，假陽性特別高，只有 20-30% 能夠驗(yàn)證吵瞻。在開始做的時(shí)候，我的建議是你寧愿讓標(biāo)準(zhǔn)設(shè)的嚴(yán)一點(diǎn)卿泽，發(fā)現(xiàn)的少一點(diǎn)，但讓假陽性低一點(diǎn)第租，可驗(yàn)證程度高一點(diǎn)丐吓，可能是一個(gè)更好的策略。剛才講了不均一性族操，簡(jiǎn)單來講可減少 PCR 的循環(huán)數(shù)等缀，因?yàn)?PCR 循環(huán)數(shù)減少的話，這種情況稍微得到改善噪裕，但最好的是你不做任何的擴(kuò)增，但除非起始的 RNA 的量特別多祭陷，一般 RNA 比較少，尤其像做少量細(xì)胞甚至單細(xì)胞 RNA-seq 的時(shí)候想罕，你必須進(jìn)行一些擴(kuò)增嵌纲，擴(kuò)增帶來的問題就是不均一性會(huì)更強(qiáng)鸠蚪，但實(shí)際上這是對(duì)你要研究這個(gè)問題的妥協(xié)盾舌，你為了研究它妖谴，你只能在目前技術(shù)不允許的前提下窑多，你只能用一個(gè)相對(duì)將就的辦法技潘，但至少可以給你拿到一些新的發(fā)現(xiàn)。另外，去開發(fā)更高效可靠的分析軟件颠毙。當(dāng)然說起來容易，做起來不一定。另外增加讀長(zhǎng)霎奢，如果說我們能夠做到一個(gè)全轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的話，實(shí)際上是一個(gè)比較好的策略悼潭。因?yàn)閯傞_始講的，如果不同的剪接事件在同一個(gè) isoform 上發(fā)生的話，存在一些短序列捎迫，實(shí)際上是沒有辦法解決的，這個(gè)可以用三代測(cè)序恼布，但這里面也存在著一些問題，因?yàn)樗m然能夠測(cè)全長(zhǎng)，但是錯(cuò)誤率比較高膏燃，價(jià)格也非常貴伶贰，而且同樣的價(jià)格覆蓋的轉(zhuǎn)錄本是比較少的，所以這個(gè)也有賴于技術(shù)的進(jìn)步琅翻。
基因可變剪接的調(diào)控——順式作用元件和反式作用因子
接下來我們講一下可變剪接的調(diào)控，可變剪接的調(diào)控是非常復(fù)雜的，概括一下我個(gè)人認(rèn)為可以分為三點(diǎn)轿亮，一個(gè)是順式作用元件但骨，就是 DNA 的序列是什么；第二個(gè)是反式作用因子，哪些 RNA 結(jié)合蛋白在這個(gè)區(qū)域與它結(jié)合闷哆；這兩者之間的組合很大程度上決定了可變剪接是如何發(fā)生的野蝇；第三是一些表觀遺傳因子可以通過影響順式作用元件和反式作用因子對(duì)它整個(gè)進(jìn)行調(diào)控。我們對(duì)整個(gè)調(diào)控層面進(jìn)行理解也可分為三個(gè)層面，第一個(gè)是 RNA 層面浅蚪，反式作用因子和順式作用元件怎樣互作洽故，互作的網(wǎng)絡(luò)可能是比較復(fù)雜的。第二個(gè)是轉(zhuǎn)錄機(jī)器層面的調(diào)控盗誊，就是 RNA 聚合酶的快慢或者所反映出來的延伸速度實(shí)際上在很多時(shí)候決定了剪接位點(diǎn)时甚。第三個(gè)是表觀遺傳層面，不管是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)哈踱、DNA 甲基化、組蛋白修飾邪财，甚至 RNA 本身的修飾都會(huì)發(fā)揮作用。先來講順式作用元件和反式作用因子愤炸。順式作用元件里面很重要的一個(gè)因素就是剪接位點(diǎn)本身的強(qiáng)弱決定了在這個(gè)位置是否會(huì)跳掉，如果說它更愿意與后面外顯子結(jié)合的話谍婉，中間的外顯子就容易被跳掉，所以涉及到位置的競(jìng)爭(zhēng)规哪。另外努酸，除了序列本身，我們知道不同的 U1 和 U2 以及其他的一些 snRNP 實(shí)際上跟特定的序列結(jié)合挟冠，而這種結(jié)合的 pairing 非常重要。
這里有個(gè)概念叫 exon definition，它是怎樣定義呢钢颂？如圖 15 所示趾盐，如果 5’SS 結(jié)合了 U1，3’SS 結(jié)合了 U2锡凝，這個(gè)時(shí)候就告訴剪接機(jī)器這個(gè)位置是外顯子芍秆，如果有這樣的信息外顯子是被保留的。但如果是另外一種情況犁跪，前一個(gè)外顯子的 5’SS 與中間外顯子的 3’SS 形成一個(gè) cap凄硼，中間外顯子的 5’SS 與下一個(gè)外顯子的 3’SS 形成一個(gè) cap，這個(gè)剪切機(jī)器會(huì)更多地識(shí)別這兩個(gè) cap，造成外顯子的跳躍，所以在這個(gè)時(shí)候，順式作用元件和反式作用因子是一個(gè)相互的作用。
總的來看，可變剪接的調(diào)控有兩個(gè)特征：1.序列依賴性，2.位置依賴性师倔。我們?cè)撊绾卫斫饽孛妫亢芏嗾{(diào)控序列在外顯子內(nèi)或內(nèi)含子里面阵具，先看一下在外顯子內(nèi)部的這些序列，包括 ESE 和 ESS跛蛋，第一個(gè) E 代表 exon挂脑，第二個(gè)代表 splicing，第三個(gè)是 enhancer 或者 silencer腹躁，即促進(jìn)或抑制剪接涂圆。對(duì)不同的序列本身晶疼，有不同的 RNA 結(jié)合蛋白結(jié)合。通常來講牌里，兩類 RNA 結(jié)合蛋白或剪接因子是比較重要的，一個(gè)是 SR 蛋白履植，即絲氨酸和精氨酸富集的蛋白歉秫；另外一種是 hnRNP，它們識(shí)別的位點(diǎn)不一樣季惯，如果 SR 結(jié)合在剪接的 enhancer 上盐碱，那么告訴這個(gè)位點(diǎn)是需要選擇的，最終會(huì)造成圖 16 中上圖的跳躍；如果 hnRNP 結(jié)合在 ESS 上渡紫，那么告知這個(gè)位點(diǎn)不要剪接鸠项，這樣造成了外顯子跳躍诊赊。所以在 exon 上的序列秆撮，其實(shí)跟反式作用因子相互作用就能夠決定外顯子的保留與否四濒；當(dāng)然，問題沒有這么那么簡(jiǎn)單职辨，即便對(duì)同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的話盗蟆，這個(gè)時(shí)候涉及到位置效應(yīng)，它結(jié)合到不同地方舒裤，也能夠調(diào)控剪接方向喳资，比如說它結(jié)合在上游的 intron 或 exon 里面的話，起到抑制作用腾供；如果結(jié)合在下游的 intron 上面仆邓，對(duì)它產(chǎn)生促進(jìn)作用，所以這樣導(dǎo)致了即便有序列和剪接因子的話伴鳖，不同位置的結(jié)合节值，效應(yīng)是不一樣的。我們可以簡(jiǎn)單理解榜聂，第一種情況是序列依賴性搞疗，第二種情況是位置依賴性，讓調(diào)控變得異常復(fù)雜须肆。
剛才我們講到了 exon 里面的結(jié)合的效應(yīng)贴汪，intron 里面的結(jié)合也會(huì)有同樣的效應(yīng)，有的是促進(jìn)休吠，有的是抑制扳埂，即在內(nèi)含子和外顯子里面都有正向和負(fù)向的元件。既然存在這些元件瘤礁，怎樣才能更好地發(fā)現(xiàn)和鑒定這些 DNA 序列到底起到什么作用阳懂，這個(gè)時(shí)候涉及到用 mini 基因進(jìn)行篩選。
比如我們想要篩選 ESE，一個(gè)簡(jiǎn)單的辦法是岩调，把這個(gè)地方做成簡(jiǎn)單的隨機(jī)序列庫巷燥，如果說這個(gè)序列對(duì)于外顯子保留是有作用的話，就能夠看到相應(yīng)的 isoform号枕，通過隨機(jī)序列不停的選擇缰揪，最后細(xì)胞里面出現(xiàn)更多的保留形式 isoform 的話，那么中間的序列更多的是 ESE葱淳。對(duì)于外顯子里面的 silencer钝腺，用圖 18 右上圖的那個(gè)質(zhì)粒來鑒定，如果外顯子跳躍赞厕，兩端正好拼成一個(gè) GFP 序列艳狐，找到含有熒光的細(xì)胞，然后在細(xì)胞里面去看序列是什么皿桑，就能夠找到讓外顯子跳躍的序列毫目。如果要找到 intron 去除的序列，可以在圖 18 左下圖中藍(lán)色區(qū)域設(shè)計(jì)一個(gè)隨機(jī)的序列诲侮，如果出現(xiàn) GFP镀虐，說明 intron 被很好地切割掉了，那么這個(gè)序列就是促進(jìn)內(nèi)含子切割的序列沟绪。另一個(gè)是 exon skipping刮便，怎樣找到下游 intron 上的一些序列，能夠促進(jìn) exon 的 skipping近零，可以在圖 18 右下圖中藍(lán)色區(qū)域設(shè)計(jì)，如果出現(xiàn) GFP抄肖，證明確實(shí)出現(xiàn)了 exon skip久信。
除了順式作用元件和反式作用因子，其實(shí)剪接調(diào)控和剪接體本身也有密切聯(lián)系漓摩。如果 U1 和 U2 作為 tag 的話裙士，那么中間的序列就定義為 exon。如果說有一些因子能夠在那里進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)管毙，那么 U1 不跟它直接結(jié)合腿椎，這個(gè)時(shí)候 exon definition 其實(shí)就發(fā)生了一些改變，中間的外顯子可能被跳躍掉夭咬，這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系也是可以存在的啃炸。實(shí)際上，不光是外顯子的序列卓舵，exon enhancer 和蛋白本身就能夠?qū)艚舆M(jìn)行促進(jìn)南用，幾個(gè)因素結(jié)合在一起發(fā)揮作用。圖 19 中的 c 圖，U1 和 U2 形成 pair 以后裹虫，如果有一個(gè) ISS肿嘲，實(shí)際上會(huì)造成 intron retention，這樣的順式作用元件或招募反式作用因子 PTB筑公，就能夠影響 intron definition雳窟，讓它成為一個(gè) exon，剪接機(jī)器就不再把這個(gè) intron 給切割掉了匣屡，這是 intron retention 的一種機(jī)制封救。還可以對(duì) U1 本身的占位進(jìn)行調(diào)控，如果沒有 U1 的話耸采，intron definition 也就沒有了兴泥。通過這樣一種比較復(fù)雜的方式，決定了 intron 被切割與否虾宇，或外顯子被跳躍與否搓彻。這些所有講的都是在 RNA 層面進(jìn)行的調(diào)控，第二個(gè)層面是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄機(jī)器上嘱朽，具體來講旭贬，是 RNA 聚合酶 II 在這個(gè)地方跑的快還是慢，研究者在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一個(gè) RNA Pol II 變慢的突變體搪泳，發(fā)現(xiàn)在 RNA Pol II 快慢兩種情況下稀轨，一些基因的可變剪接是不一樣的。
當(dāng) RNA 聚合酶 II 跑的很快時(shí)，中間是一個(gè)很弱的 3’SS褪测，根本沒有來得及去剪切诫欠，這個(gè)時(shí)候強(qiáng)的 3’SS 占了主導(dǎo)，原來比較弱的位點(diǎn)處發(fā)生了 exon skipping佣谐，這個(gè)過程中并沒有其他反式作用因子來參與。如果轉(zhuǎn)錄的時(shí)候相對(duì)比較慢方妖，這個(gè)時(shí)候剪切機(jī)器有足夠的時(shí)間來識(shí)別比較弱的剪切位點(diǎn)狭魂，這樣就可以發(fā)生正常的剪切，此時(shí) exon 包含党觅。在這個(gè)例子中雌澄，弱的剪切信號(hào)可以通過 RNA 聚合酶 II 跑的快慢決定包含與否，這是一個(gè)最簡(jiǎn)單直觀的例子杯瞻。這個(gè)方式聽起來很簡(jiǎn)單镐牺，也很合理，較慢的 Pol II 延伸速度一定導(dǎo)致外顯子的包含嗎魁莉？生物學(xué)里面總能找到例外任柜。這個(gè)時(shí)候卒废，可以把反式作用因子也引進(jìn)來。Pol II 跑的比較慢的時(shí)候宙地，雖然可能發(fā)生了正常的剪接摔认，但是 Pol II 上同時(shí)還結(jié)合了抑制性的反式作用因子的話，可以發(fā)生外顯子跳躍宅粥。你會(huì)發(fā)現(xiàn)参袱，后面的很多染色質(zhì)跟它的調(diào)控，無非都是通過這種套路來解釋秽梅，有了方向以后抹蚀，再去找，到底是哪個(gè)反式作用因子企垦，是不是真的能解釋這個(gè)現(xiàn)象环壤？從原理上，不難提出假說钞诡。
我們整個(gè)組織細(xì)胞是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程郑现，剪接如何發(fā)生以及被調(diào)控，可以通過細(xì)胞外的信號(hào)傳遞進(jìn)來荧降，這些通路發(fā)生改變后接箫，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可改變特定蛋白的磷酸化和其他修飾朵诫，而剪接因子也可以發(fā)生很多修飾辛友，這些修飾發(fā)生改變，也可以調(diào)控細(xì)胞核中的剪接事件發(fā)生的多少剪返，通過這種方式废累，就可以將剛才講的剪接方式與外界的因素聯(lián)系在一起，在生理或病理情況下脱盲，可能就是通過這種形式來體現(xiàn)的邑滨。
組蛋白修飾與基因可變剪接
既然我們已經(jīng)知道了比較基礎(chǔ)的調(diào)控方式，怎么樣解釋組蛋白和基因可變剪接的關(guān)系宾毒？在轉(zhuǎn)錄過程中驼修，之前我們的模式圖顯示殿遂，RNA 離開染色體后單獨(dú)加工诈铛；如果我們?nèi)タ磳?shí)際情況，轉(zhuǎn)錄出來的 RNA 和各種組蛋白修飾墨礁、RNA 聚合酶 II 還是連成了一個(gè)整體幢竹，在它還沒有從 DNA/染色質(zhì)中下來的時(shí)候，物理空間是相鄰的恩静，而這樣一種相鄰為兩者之間的相互關(guān)系提供了一種可能性——RNA 上可以結(jié)合一些組蛋白修飾的酶焕毫，組蛋白修飾的酶可以對(duì)特定的位點(diǎn)加上修飾蹲坷；反過來，這些修飾可以通過其他方式結(jié)合一些剪接因子邑飒，有可能作用在 RNA 上循签，這樣就存在剪接調(diào)控。當(dāng)然疙咸，具體是哪些分子參與县匠，哪些組蛋白修飾發(fā)揮作用，還需要具體鑒定撒轮。
我們從不同組蛋白修飾在基因區(qū)域上的分布來看乞旦，很多 marker 在啟動(dòng)子區(qū)域，標(biāo)記基因是否活躍题山；在活躍基因的內(nèi)部兰粉，還有各種不同的修飾，中間的一些組蛋白修飾與可變剪接關(guān)系可能比較緊密顶瞳。從位置上玖姑，我們可以猜測(cè)，如果發(fā)生修飾的話浊仆，中間的修飾對(duì)剪接的影響可能更大客峭。舉個(gè)例子，染色體中含有一個(gè)比較弱的剪接位點(diǎn)抡柿，中間有不同的核小體分布舔琅，以及組蛋白修飾，這些可以影響 RNA 聚合酶 II 的延伸速度洲劣。在比較弱的剪接位點(diǎn)备蚓，延伸速度比較快的話，就發(fā)生了跳躍囱稽；延伸速度比較慢的話郊尝，外顯子就能保留。所以战惊，下半部分的機(jī)制流昏，完全是借用了 RNA 聚合酶 II 的延伸速度的快慢，唯一需要證明的是吞获，特定組蛋白修飾和核小體分布是否會(huì)影響 RNA 聚合酶的快慢况凉。很多機(jī)制上的研究，只要把重要的一環(huán)證明各拷，這樣一種機(jī)制就可能成立刁绒。
另外一種調(diào)控方式烤黍，特定組蛋白修飾（比如 H3K36me3）的 reader知市，進(jìn)一步可以結(jié)合剪接因子傻盟，可以促進(jìn)也可以是抑制。如果修飾不存在嫂丙，或者換成其他修飾了娘赴，即便你有splicing factor，這種組蛋白修飾仍然不能對(duì)可變剪接進(jìn)行調(diào)控跟啤，這樣就造成了外顯子保留筝闹。要么在特定位點(diǎn)招募了一些特定蛋白，這個(gè)蛋白只要跟剪接調(diào)控因子結(jié)合在一起腥光，就能夠有效地調(diào)控剪接关顷。當(dāng)然，有個(gè)前提是武福，里面有個(gè)位點(diǎn)是比較弱的议双，因?yàn)槿绻容^強(qiáng)的話，可能根本就不需要調(diào)控捉片，或者也沒辦法調(diào)控平痰。
具體來講，文獻(xiàn)中還報(bào)道了其他組蛋白修飾的 reader伍纫，比如 H3ac宗雇、H3K4me3、H3K9me3莹规，也會(huì)招募其他剪接因子赔蒲，在特定的位點(diǎn)調(diào)控可變剪接。如何發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾對(duì)可變剪接的影響良漱？從轉(zhuǎn)錄組層面舞虱，如果你關(guān)心特定的組蛋白修飾，你可以看它改變前后一些組蛋白修飾酶的改變母市，可能會(huì)影響組蛋白修飾的改變矾兜，然后進(jìn)行 ChIP-seq，就知道組蛋白修飾分布的情況患久；再做 RNA-seq椅寺，看一下 splicing 的改變〗В看兩者之間的關(guān)聯(lián)返帕。進(jìn)行一些分析和驗(yàn)證。在單基因水平上驗(yàn)證高镐，采用 RT-PCR溉旋、Northern Blot畸冲、ChIP-PCR 等等嫉髓。這里我們舉一個(gè)例子观腊，是藍(lán)斐老師他們發(fā)現(xiàn)的 H3.3K36me3，通過 BS69 并招募剪接因子復(fù)合物算行，調(diào)控特定基因的 intron retention梧油。在正常細(xì)胞和 BS69 敲低細(xì)胞中做 RNA-seq，進(jìn)行生信分析州邢，發(fā)現(xiàn) BS69 影響內(nèi)含子保留儡陨。
為什么呢？植物中的 intron retention 是比較多的量淌，而動(dòng)物中一個(gè)因素改變后骗村，更多的是改變其他的可變剪接類型，比如 exon skipping呀枢，但他們發(fā)現(xiàn)的 intron retention 是改變最顯著的胚股，這樣就可以建立 BS69 與 intron retention 的聯(lián)系。而且發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)也出現(xiàn)改變裙秋，跟我們的結(jié)果也是比較吻合的琅拌，而且他們也在單基因水平上進(jìn)行了驗(yàn)證。通過這個(gè)例子摘刑，回答了中間一個(gè)環(huán)節(jié)进宝，組蛋白修飾至少可以通過兩種方式影響 RNA 剪接，那么反過來是不是成立的枷恕？RNA 剪接會(huì)不會(huì)影響組蛋白修飾呢党晋？
如果要驗(yàn)證可變剪接改變對(duì)組蛋白修飾的影響，首先要改變可變剪接徐块，研究者用了化學(xué)藥物隶校，抑制可變剪接的效率，后來進(jìn)一步證明蛹锰，這樣一種藥物模擬了剪接位點(diǎn)的突變深胳，這樣就改變了可變剪接，然后做 ChIP-seq铜犬，發(fā)現(xiàn) H3K36me3 分布顯著改變舞终，而且也發(fā)現(xiàn) RNA 聚合酶 II 的分布也發(fā)生了與 H3K36me3 類似的改變，這暗示剪接的改變很可能影響組蛋白修飾癣猾，而且很可能與 RNA 聚合酶 II 位置上的變動(dòng)有關(guān)敛劝。進(jìn)一步的機(jī)制還不是很清楚，只是提供了中間的線索纷宇。但至少證明了一點(diǎn)夸盟，可變剪接可能影響組蛋白修飾。
在植物中也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)上陕，RNA 結(jié)合蛋白會(huì)結(jié)合到不同的序列上桩砰，Hu 蛋白會(huì)招募 HDAC，由于這兩者物理位置上的接近释簿，會(huì)對(duì)鄰近的組蛋白的乙跹怯纾基去掉，通過這種方式對(duì)組蛋白修飾產(chǎn)生影響∈埽現(xiàn)在的研究還不是很多煮纵，目前的例子也就這些。但已經(jīng)說明了一點(diǎn)偏螺，組蛋白修飾可能影響剪接行疏，剪接也會(huì)影響組蛋白修飾。在有機(jī)體內(nèi)套像，這兩者可能會(huì)進(jìn)一步的相互作用隘擎，甚至反饋調(diào)控，可能是正反饋也可能是負(fù)反饋凉夯，從而使機(jī)體達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)货葬。生物體之間存在各種各樣的聯(lián)系，關(guān)鍵是找到證明其存在的證據(jù)以及其背后的邏輯劲够。
DNA 甲基化與基因可變剪接
既然 DNA 甲基化修飾與可變剪接相關(guān)震桶，一個(gè)簡(jiǎn)單的辦法就是對(duì)全基因組 DNA 甲基化進(jìn)行分析。怎么分析呢征绎？分組蹲姐，分為外顯子和內(nèi)含子，區(qū)別外顯子和內(nèi)含子數(shù)據(jù)哪些是一樣的人柿，哪些是不一樣的柴墩。有的 GC 含量一樣，有的不一樣凫岖。為了避免 GC 含量因素對(duì)結(jié)果的影響江咳，他們做了一個(gè)設(shè)定，只分析外顯子和內(nèi)含子內(nèi) GC 含量一樣的組別哥放，這樣得出來的結(jié)論消除 GC 含量的影響歼指，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外顯子上有更高的 DNA 甲基化。這個(gè)比較有意思甥雕，要看兩者之間是否有相互作用踩身，先看有無相關(guān)性，有相關(guān)性并不代表有因果關(guān)系社露。但通常如果有因果關(guān)系挟阻，相關(guān)性方面應(yīng)當(dāng)有些線索；如果什么都沒有，這個(gè)事情就變得更困難附鸽。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)脱拼，剪接位點(diǎn)附近的甲基化程度相對(duì)于內(nèi)含子里邊其他的更遠(yuǎn)的地方，水平明顯不一樣拒炎。這為我們提供了一個(gè)很好的線索，如果甲基化會(huì)影響 splicing 的話挨务，它在這兩個(gè)不同位置的甲基化程度給它的作用提供了一個(gè)基礎(chǔ)击你。進(jìn)一步再想，如果 DNA 甲基化可以影響選擇性剪接谎柄，那么通過什么樣的方式丁侄？
第一種方式，DNA 甲基化可以間接地通過影響組蛋白的修飾從而影響剪接朝巫。這在理論上是成立的鸿摇，但實(shí)際能不能找到這樣的例子還未知。另外一個(gè)辦法劈猿，我們可以去關(guān)注 DNA 甲基化的結(jié)合蛋白拙吉。大家知道，甲基化有專門的結(jié)合蛋白揪荣，類似于組蛋白修飾中的 reader筷黔，你也可以認(rèn)為這個(gè)結(jié)合蛋白是 DNA 甲基化的 reader。但與組蛋白修飾有點(diǎn)不一樣仗颈，DNA 甲基化之后佛舱，某些蛋白對(duì) DNA 的結(jié)合能力不同。有些蛋白質(zhì)不喜歡甲基化挨决，因此 DNA 甲基化之后蛋白質(zhì)不能結(jié)合请祖，有的必須要 DNA 甲基化之后蛋白才結(jié)合。那么一旦蛋白結(jié)合在這個(gè)地方脖祈，這些蛋白有沒有可能通過下游的因素影響剪接呢肆捕？這也許是個(gè)可能。很多研究發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)這一過程的因素盖高，是一些大家耳熟能詳?shù)囊蜃痈Ｑ梗热?CTCF，它與 DNA 甲基化的結(jié)合與它的一個(gè) domain 有關(guān)系或舞。但是大家發(fā)現(xiàn)荆姆，這個(gè)因子居然同樣可以影響它的剪接；另一個(gè)是 MeCP2映凳，它是一個(gè)甲基化結(jié)合蛋白胆筒。這兩個(gè)因子就是剛才講的，一個(gè)通過結(jié)合在非甲基化序列上影響剪接，一個(gè)通過結(jié)合在甲基化序列上影響剪接仆救。還有一個(gè)是 HP1抒和，它是組蛋白 H3K9 甲基化 reader。DNA 甲基化修飾影響剪接主要通過三種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的：一是改變速率彤蔽，一旦改變速率摧莽，后面的機(jī)制就容易解釋；二是招募剪接因子顿痪；三是通過 Pol II 的快慢來實(shí)現(xiàn)镊辕，基本是由這三種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。
第一個(gè)例子中的 CTCF蚁袭，它的結(jié)合具有序列特異性征懈，CTCF 與特定 DNA 序列結(jié)合后，會(huì)讓 RNA 聚合酶 II 變慢揩悄。RNA 聚合酶 II 變慢之后卖哎，弱的剪接性號(hào)也能作為外顯子，因此外顯子包含删性，這個(gè)時(shí)候形成一個(gè)三個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄本亏娜。如果這個(gè)地方發(fā)生甲基化，那么 CTCF就沒有辦法結(jié)合在這個(gè) DNA 序列上蹬挺。如果 RNA 聚合酶 II 跑的快照藻，由于這個(gè)位點(diǎn)比較弱被剪接掉，實(shí)際上會(huì)造成外顯子跳躍汗侵。從原理上來講幸缕，這種作用方式解釋的相對(duì)比較清楚，但卻沒能解釋在什么情況下這個(gè)位置的 RNA 聚合酶跑的快或慢晰韵。那么作為一個(gè) DNA 甲基化結(jié)合蛋白发乔，MeCP2 如何影響 splicing？正好相反雪猪。DNA 發(fā)生甲基化栏尚，會(huì)促進(jìn) MeCP2 結(jié)合上去，而且 MeCP2 還會(huì)招募一些特定的組蛋白修飾酶只恨，如 HDAC译仗，在下游的因子的作用下，它會(huì)讓 RNA 聚合酶 II 變慢官觅。如何變慢纵菌，沒有解釋清楚，至少給出了一個(gè)線索休涤，就是 MeCP2 結(jié)合上去會(huì)讓 RNA 聚合酶 II 會(huì)變得慢咱圆，變慢之后會(huì)造成外顯子正常的切割包含笛辟，如果 DNA 沒有甲基化，MeCP2 不會(huì)與之結(jié)合序苏，RNA 聚合酶 II 快速移動(dòng)手幢，造成外顯子跳躍。這兩個(gè)例子都是蛋白結(jié)合在這里造成 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄或延伸速率忱详，決定外顯子跳躍與否围来。第三個(gè)例子是通過組蛋白修飾影響剪接⌒僬觯可以看到监透，如果 DNA 發(fā)生甲基化，會(huì)進(jìn)一步使組蛋白上發(fā)生 H3K9me3软舌，這種修飾會(huì)招募 HP1才漆。HP1 是一個(gè)識(shí)別 H3K9me3 的蛋白牛曹，有了這個(gè)蛋白之后佛点，它會(huì)再去招募 splicing factor。如果這個(gè) splicing factor 是促進(jìn) exon skipping 的黎比，在這個(gè)過程中超营，兩個(gè) splicing factor 的位置比較近，促使外顯子發(fā)生跳躍阅虫。這個(gè)假設(shè)走了一條很長(zhǎng)的路演闭，很奇怪，從 DNA 修飾到組蛋白修飾颓帝，再到 reader米碰，然后再 splicing factor，解釋起來比較麻煩购城。這個(gè)機(jī)制給大家的研究造成很大的困難吕座，如果你要證明這個(gè)方式確實(shí)存在，首先要證明是 H3K9 甲基化而不是其他的瘪板，接下來解釋轉(zhuǎn)到 splicing factor吴趴，到底結(jié)合哪個(gè) splicing factor，這個(gè)還得去找侮攀，這個(gè)給研究帶來了更大的難度锣枝。剛剛講了這三種機(jī)制，大家覺得從原理上講哪種更普遍兰英，哪種更特異性?從原理上來講撇叁，CTCF 識(shí)別特定序列，只有某些特定基因才有這樣的序列畦贸，這樣它可能特異性更強(qiáng)税朴；對(duì)于 MeCP2，只要是基因發(fā)生甲基化，它就能與之結(jié)合正林，對(duì)基因的序列要求沒有那么高泡一，從而調(diào)控更多基因的剪接；HP1 與它的作用方式類似觅廓，因?yàn)樗梢宰R(shí)別 H3K9me3鼻忠，H3K9me3 在很多核小體上都能存在，因此它對(duì)基因選擇性沒有那么強(qiáng)杈绸。初步的猜想就是 CTCF 調(diào)控的基因更少帖蔓，后兩者更多一點(diǎn)。好像一切看上去都很完美瞳脓，很好地解釋了 DNA 甲基化確實(shí)會(huì)影響 splicing塑娇，但你仔細(xì)看一下我們之前說的關(guān)聯(lián)研究和后面的機(jī)制研究，存在一個(gè)讓人想不通的事情劫侧。你看一下被跳掉的 alternative exons埋酬，它含有的 DNA 甲基化水平實(shí)際上比其他外顯子的甲基化水平低。但之前我們說外顯子上的 DNA 甲基化比較高烧栋，我們之前認(rèn)為外顯子高的甲基化水平跟它的剪接是相關(guān)的写妥，DNA 甲基化是 promote 外顯子的定義。但實(shí)際上我們?nèi)タ蠢锩娴臄?shù)據(jù)审姓，去推廣這個(gè)假說珍特，其實(shí)是不成立的。因?yàn)樵谔囟ǖ呐咛ジ杉?xì)胞中看到的現(xiàn)象是 DNA 甲基化可以促進(jìn)或抑制特定 alternative exons inclusion [14]魔吐。原來認(rèn)為簡(jiǎn)單的 DNA 甲基化決定外顯子扎筒，實(shí)際上是有的時(shí)候甲基化高的區(qū)域作為外顯子保留，有的時(shí)候又作為內(nèi)含子被切掉酬姆，這與假說中的情況不完全一樣嗜桌。
除了我們講的 alternative exon，其實(shí)還存在一種組成型外顯子 constitute exon轴踱。我們看到的甲基化水平高可能只是在組成型外顯子顯示的甲基化水平高症脂，但是如果將組成型和可變的外顯子放在一起比較，與原來的假設(shè)相矛盾了淫僻。實(shí)際上對(duì)于 constitute exon诱篷，它更多的是由這個(gè)強(qiáng)的剪接信號(hào)來決定，這時(shí)甲基化水平高低只是一種伴隨現(xiàn)象雳灵，不管甲基化水平高或低棕所，旁邊的 intron 都會(huì)被剪掉。alternative exon 一直都被認(rèn)為是一個(gè)外顯子悯辙，甲基化水平可能對(duì)這個(gè)可變外顯子的影響更大琳省，這樣可以更好解釋為什么全基因組水平和單基因水平機(jī)制驗(yàn)證有可能存在矛盾迎吵。以上這些分析可以得出一個(gè)初步的結(jié)論，DNA 甲基化通過多種方式影響 RNA 剪接针贬，那么反過來會(huì)不會(huì)成立击费，根據(jù)前面一個(gè)猜想肯定也是成立，遺憾的是并沒有這方面證據(jù)桦他。
染色質(zhì)修飾與基因轉(zhuǎn)錄終止
最后稍微再講一點(diǎn)蔫巩，RNA 加工不僅是一個(gè)可變剪接的過程，還有加 Poly(A) 尾快压。Poly(A) 尾在哪個(gè)地方加也是非常重要的圆仔，很多剪接因子影響加 Poly(A) 尾，兩者關(guān)系密切蔫劣。表觀遺傳修飾與轉(zhuǎn)錄終止之間有什么關(guān)系坪郭？轉(zhuǎn)錄終止提示在哪個(gè)位置加 Poly(A) 尾巴。如圖 31 所示脉幢，gene body 有不同修飾歪沃，尤其是在 3’-端存在很多組蛋白修飾。那這種特異修飾有沒有可能與 3’-端的 Poly(A) 尾存在聯(lián)系鸵隧，答案是肯定的绸罗。這樣在中心法則下面 RNA 作為一個(gè)中間傳遞者，在它的水平上發(fā)生一個(gè)很多的調(diào)控朗若，這些調(diào)控不僅對(duì)下面的蛋白質(zhì)造成影響恼五，可能反過來影響上游的遺傳物質(zhì)，起到一個(gè)很重要的承上啟下的作用哭懈，甚至是一個(gè)很中心的位置灾馒。RNA 加工過程中存在很多未知因素，從不同角度去看遣总，會(huì)有很多新的發(fā)現(xiàn)睬罗，如果能夠把這些新的發(fā)現(xiàn)的一個(gè)上游因素闡述的相對(duì)比較清楚，對(duì)過程理解會(huì)更深刻旭斥。
整理：復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院徐鵬容达、重慶醫(yī)科大學(xué)蔡瑩、中科院上海藥物所徐曉偉
責(zé)編：復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院徐鵬
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