轉(zhuǎn)座因子 Transposon

一段DNA順序可以從原位上單獨(dú)復(fù)制或斷裂下來寥假，環(huán)化后插入另一位點(diǎn)，并對(duì)其后的基因起調(diào)控作用霞扬，此過程稱轉(zhuǎn)座糕韧。這段序列稱跳躍基因或轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位喻圃。

• I型轉(zhuǎn)座子（ 復(fù)制-粘貼 ）
  I型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座中間體是RNA兔沃。I型轉(zhuǎn)座子又被稱為逆元件（Retro element）。該型轉(zhuǎn)座子會(huì)先被轉(zhuǎn)錄為RNA级及，然后該RNA被逆轉(zhuǎn)錄，再次成為DNA额衙，才被插入到目標(biāo)位點(diǎn)中
• II型轉(zhuǎn)座子（ 剪切-粘貼 ）
  II型轉(zhuǎn)座中間體是DNA饮焦，轉(zhuǎn)座子序列的兩端是兩段直接重復(fù)序列（direct repeat，簡(jiǎn)稱dR）窍侧，與它們接壤的是反向重復(fù)序列（invert repeat县踢，簡(jiǎn)為iR），即“回文”序列伟件。然后才是中間的插入序列（Insert sequence硼啤，簡(jiǎn)為IS）。

轉(zhuǎn)座酶

執(zhí)行轉(zhuǎn)座功能的酶斧账，通常由轉(zhuǎn)座子編碼谴返，識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩端的特異序列煞肾，能把轉(zhuǎn)座子從相鄰序列中脫離出來，再插入到新的DNA靶位點(diǎn)嗓袱，無同源性要求籍救。

Tn5轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座子包括兩端的反向重復(fù)序列和中間的轉(zhuǎn)座基因。反向重復(fù)序列是轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的位置渠抹，中間的轉(zhuǎn)座基因就是基因間來回跳躍的基因片段蝙昙。

轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)

Tn5 全長(zhǎng)約5.8kb，由編碼三個(gè)抗生素（新霉素梧却、博萊霉素奇颠、鏈霉素）的核心序列和兩條倒置的IS50 序列組成，其中IS50R和IS50L的序列高度同源放航，只有IS50L的一個(gè)堿基存在突變烈拒。IS50具有19bp的倒置末端（外末端outsideend，OE和內(nèi)末端inside end三椿，IE）缺菌，兩倒置末端有7個(gè)bp不同，此倒置末端是轉(zhuǎn)座酶（Tnp）的作用位點(diǎn)搜锰。IS50L和IS50R均含有編碼轉(zhuǎn)座酶（TnP）以及轉(zhuǎn)座阻遏蛋白（lnh）的基因伴郁，但由于IS50L中的堿基突變，造成翻譯提前終止蛋叼，所以僅有IS50R可以產(chǎn)生正常的有活性的TnP和lnh焊傅。

Tn5作用機(jī)制

轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)，兩個(gè)轉(zhuǎn)座酶分子結(jié)合到Tn5轉(zhuǎn)座子的OE末端狈涮，形成兩個(gè)Tnp-OE復(fù)合體狐胎，隨后兩個(gè)復(fù)合體聯(lián)會(huì)，末端相互作用而二聚體化歌馍，形成由一個(gè)二聚體蛋白質(zhì)和兩分子DNA組成的聯(lián)會(huì)復(fù)合體握巢。形成該聯(lián)會(huì)復(fù)合體后，Tnp才具有切割DNA的活性松却。形成這種結(jié)構(gòu)有利于協(xié)同Tn5 DNA 鏈的切割和轉(zhuǎn)移暴浦，有利于防止Tnp只對(duì)轉(zhuǎn)座子DNA鏈的一端進(jìn)行切割。結(jié)合在左末端的Tnp負(fù)責(zé)催化右末端的磷酸二酯鍵水解晓锻，而結(jié)合在右末端的Tnp負(fù)責(zé)催化左末端的磷酸二酯鍵水解歌焦。活化Tn p水分子砚哆，此活化的水分子水解DNA鏈独撇，在Tn5的兩末端分別形成兩個(gè)3’-OH親核基團(tuán)，該親核基團(tuán)進(jìn)而攻擊互補(bǔ)鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。隨后另一活化的水分子水解該發(fā)夾結(jié)構(gòu), 形成平末端的Tn5纷铣，整個(gè)聯(lián)會(huì)復(fù)合體離開供體鏈卵史，并結(jié)合到靶DNA上。Tn5的3’-OH親核攻擊靶序列关炼，在轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)之間形成9bp的粘性末端程腹，轉(zhuǎn)座子的3’-OH同靶DNA的5’-P之間形成共價(jià)鍵，轉(zhuǎn)座子就插入到靶序列之中儒拂。在DNA 聚合酶的作用下補(bǔ)平缺口寸潦，轉(zhuǎn)座子的兩端形成9 bp的正向重復(fù)序列。整個(gè)轉(zhuǎn)座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA 的過程社痛，實(shí)現(xiàn)了基因的“跳躍”（如圖）见转。

轉(zhuǎn)座酶作用機(jī)制

Tn5應(yīng)用

• Illumina Nextera DNA Library Preparation Kit
  研究人員發(fā)現(xiàn)整個(gè)轉(zhuǎn)座子序列并不是轉(zhuǎn)座必須的，只需轉(zhuǎn)座子的末端核心序列蒜哀，轉(zhuǎn)座酶便能將該部分序列插入并連接至基因組內(nèi)斩箫；根據(jù)這個(gè)原理，將測(cè)序接頭序列加入末端核心序列中撵儿，可簡(jiǎn)捷地引入測(cè)序接頭乘客，完成文庫構(gòu)建。
  由下圖可看到在tn5二聚體里面的雙鏈Oligo是Nextera Tn5 binding site淀歇，19個(gè)堿基易核，全部都是一樣的。伸出來的部分是單鏈的序列浪默，
  藍(lán)色：Nextera tn5 read1 (5'-TCGTCGGCAGCGTC-3')
  紅色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3')
  
  Tn5二聚體結(jié)構(gòu)
  
  將P5牡直、P7 端部分接頭序列（ Adapter 1/2 ）和轉(zhuǎn)座子末端序列形成包被接頭，與Tnp 形成Tn5 轉(zhuǎn)座復(fù)合體纳决。該復(fù)合體打斷受體DNA碰逸，會(huì)形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1，一端帶有P7 部分接頭Adapter 2的DNA阔加，之后通過PCR加上Barcode以及接頭其余部分饵史，形成含P5端與P7端完整接頭的DNA 文庫。
  
  Illumina Nextera 建庫流程
  
  Tn5 用于測(cè)序文庫構(gòu)建時(shí)胜榔，將DNA 片段化胳喷、末修加Ａ、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?步反應(yīng)苗分，極大縮短建庫時(shí)間，提高工作效率牵辣。但是這一步之后摔癣，接頭與插入片段之間有9bp 的gab 需要補(bǔ)平（如圖5），這就是為什么Tn5 建庫在PCR之前必須72 ℃反應(yīng)5min ，而且所用的PCR 酶需要是具有鏈置換功能的非熱啟動(dòng)酶择浊。
  
  image.png

Vazyme TruePrep? DNA Library Prep Kit

• 建庫原理
  TruePrep Tagment Enzyme Mix (TTE Mix)中包含轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2戴卜。將該預(yù)混液與DNA混合，55°C下孵育10 min琢岩，即可實(shí)現(xiàn)DNA片段化的同時(shí)末端接上接頭投剥。這種片段化產(chǎn)物經(jīng)N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及P5和P7 (PCR Primer Mix, PPM)兩對(duì)引物擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物大小分選和純化后即為可測(cè)序文庫担孔。

• 文庫結(jié)構(gòu)

  
  
  Vazyme Trueprep文庫分子結(jié)構(gòu)

• 建庫流程

  
  
  Vazyme Trueprep建庫流程

ATAC-seq

ATAC-seq也即Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing江锨，是利用轉(zhuǎn)座酶探究可接近性染色質(zhì)高通量測(cè)序技術(shù)。

• 染色質(zhì)開放性
  染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)糕篇，在結(jié)構(gòu)上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低啄育，處于伸展?fàn)顟B(tài)，DNA復(fù)制拌消，基因轉(zhuǎn)錄都發(fā)生在DNA的致密高級(jí)結(jié)構(gòu)變?yōu)樗缮⒌臓顟B(tài)挑豌；這部分打開的染色質(zhì)，就叫開放染色質(zhì)（open chromatin）墩崩。而打開的染色質(zhì)氓英，就有足夠的區(qū)域允許一些調(diào)控蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子）過來與之相結(jié)合。而染色質(zhì)的這種特性鹦筹，就叫做染色質(zhì)的可接近性（chromatin accessibility）铝阐。通過研究細(xì)胞特定狀態(tài)下開放的染色質(zhì)區(qū)域可以在DNA水平上了解其轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
• 染色質(zhì)區(qū)域開放性研究方法
  傳統(tǒng)使用的的實(shí)驗(yàn)方法主要是有MNase-seq和DNase-seq盛龄，這兩種實(shí)驗(yàn)方法的主要思路是：染色質(zhì)變得開放饰迹，就意味著DNA和組蛋白的聚集程度降低，就會(huì)有一部分DNA暴露出來余舶。而一旦失去了蛋白質(zhì)的保護(hù)啊鸭，這部分DNA就可以被DNA酶（MNase或DNase I）所切割。然后匿值，我們?cè)侔亚懈钔甑腄NA拿來測(cè)序赠制，和已知的全基因組序列相比較，就能發(fā)現(xiàn)被切割的是哪些序列挟憔，沒有被切掉的基因序列又在哪里钟些，就知道開放的染色質(zhì)區(qū)域在哪里了。不過绊谭，這兩個(gè)方法有明顯的缺陷政恍，即耗時(shí)費(fèi)力與重復(fù)性差。雖然FAIRE-seq 不依賴酶和抗體达传，但其檢測(cè)背景較高篙耗，測(cè)序信噪比低迫筑，甲醛交聯(lián)時(shí)間不好把握等缺陷，限制其使用范圍宗弯。

• 染色體的結(jié)構(gòu)脯燃。
  染色體主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，每一條染色單體由單個(gè)線性DNA分子組成蒙保，細(xì)胞核中的DNA是經(jīng)過高度有序的包裝辕棚，包裝分為多個(gè)水平，核小體核心顆粒(nucleosome core particle)邓厕、染色小體(chromatosome)逝嚎、 30 nm水平染色質(zhì)纖絲(30 nm fibre)和高于30 nm水平的染色體包裝

  
  
  染色體逐級(jí)結(jié)構(gòu)

• 研究開放染色質(zhì)的方法對(duì)比
  ATAC-seq利用Tn5轉(zhuǎn)座酶人為將將攜帶已知DNA序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物，加入到細(xì)胞核中邑狸，再利用已知序列的標(biāo)簽進(jìn)行PCR建庫測(cè)序懈糯，就知道哪些區(qū)域是開放染色質(zhì)了。ATAC-seq出來的結(jié)果单雾，和傳統(tǒng)方法出來的結(jié)果具有很強(qiáng)的一致性赚哗，同時(shí)也和ChIP-seq有較高的吻合程度。而相比較而言硅堆，ATAC-seq的重復(fù)性屿储，比MNase-seq和DNase-seq的更強(qiáng)，操作起來也更加簡(jiǎn)便渐逃，而且只需要很少的細(xì)胞/組織量够掠，同時(shí)測(cè)序信號(hào)更加好。目前已經(jīng)成為研究染色質(zhì)開放性首選的技術(shù)方法

  
  
  不同實(shí)驗(yàn)方法獲得開放性染色質(zhì)分析的示意圖

ATAC-seq優(yōu)勢(shì)：

1. 靈敏性高：低細(xì)胞起始量（500-50000個(gè)）茄菊；
2. 操作簡(jiǎn)單疯潭，耗時(shí)短；
3. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好
4. 能同時(shí)揭示開放染色質(zhì)的基因組位置面殖，DNA結(jié)合蛋白竖哩，轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的相互作用

ATAC-seq缺點(diǎn)：

轉(zhuǎn)座酶文庫分子三種結(jié)構(gòu)

1. Tn5通過插入剪斷DNA并將測(cè)序接頭連接到剪斷的兩個(gè)DNA片段的末端，因此對(duì)于一個(gè)DNA片段而言脊僚，其兩端的接頭連接是隨機(jī)的相叁，這便導(dǎo)致同一片段兩端的接頭有50%的概率是同一接頭。而只有連接不同接頭的片段才可用于富集擴(kuò)增及測(cè)序辽幌，因此增淹，有一半的片段無法利用；
2. 大量剪斷的DNA由于片段過大乌企，無法進(jìn)行PCR富集;
3. Tn5 的活性受反應(yīng)溶液的組成及反應(yīng)條件影響虑润，仍然需要優(yōu)化以便提高剪切效果；
4. ATAC-seq在植物細(xì)胞中存在以下難點(diǎn)：細(xì)胞壁的存在加酵，葉綠體拳喻、線粒體等細(xì)胞器的污染梁剔，缺少穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系;