陳魏學(xué)基因系列視頻- 單細(xì)胞RNAseq測(cè)序原理2 筆記
- 該方法的優(yōu)勢(shì)是：利用轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)cDNA的擴(kuò)增（每一輪轉(zhuǎn)錄可以擴(kuò)大幾千倍，兩輪擴(kuò)增達(dá)到幾百萬倍）俊抵，避免使用PCR擴(kuò)增帶來的PCR偏差（不同擴(kuò)增子間擴(kuò)增效率差異隨著循環(huán)達(dá)到幾十次而達(dá)到指數(shù)級(jí)別）
具體流程如下
TargetAmp法流程圖
step 1：逆轉(zhuǎn)錄起始引物5'端是T7啟動(dòng)子序列幕随，3'端是Oligo dT(結(jié)合mRNA polyA尾巴)楞慈，用于得到cDNA的第一鏈
step 2: cDNA的第一鏈上引入T7啟動(dòng)子璧坟，并用RNase H消化mRNA鏈
step 3: 合成cDNA的第二鏈
step 4：用T7啟動(dòng)子和合成的雙鏈cDNA轉(zhuǎn)錄出大量anti-sense RNA嗡贺；再用純化過的aRNA和隨即引物通過逆轉(zhuǎn)錄合成新的cDNA
step 5: 用T7-Oligo dT引物進(jìn)行step 1～3
step 6: 用得到的雙鏈cDNA進(jìn)行step 4业舍，得到第二輪的aRNA(可以達(dá)到微克級(jí)別抖拦，再經(jīng)過一輪逆轉(zhuǎn)錄就可以得到幾微克的cDNA，用于建庫(kù)測(cè)序)
