【文獻(xiàn)】Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines
地址： https://www.nature.com/articles/s12276-018-0071-8
帶著問題讀文獻(xiàn)：
1屈扎，這篇文獻(xiàn)講了個(gè)啥紊搪？
2恤浪，這篇文章為什么能發(fā)表在這個(gè)雜志上甚牲？
3紧憾，作者信息：大學(xué)信息或者研究所信息？
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請(qǐng)快速通讀文章：
Abstract
近年來，下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)的快速發(fā)展為復(fù)雜的生物系統(tǒng)提供了許多有價(jià)值的見解厢岂，從癌癥基因組學(xué)到多種微生物群落光督。基于NGS的基因組學(xué)塔粒、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組學(xué)技術(shù)現(xiàn)在越來越關(guān)注單個(gè)細(xì)胞的特性结借。這些單細(xì)胞分析將使研究人員發(fā)現(xiàn)新的和潛在的意想不到的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于傳統(tǒng)的分析方法卒茬，評(píng)估群體船老。例如，單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)可以揭示復(fù)雜而罕見的細(xì)胞群圃酵，揭示基因之間的調(diào)控關(guān)系柳畔，并跟蹤不同細(xì)胞系發(fā)育的軌跡。在這篇綜述中郭赐，我們將重點(diǎn)介紹單細(xì)胞分離和文庫制備方面的技術(shù)挑戰(zhàn)薪韩，以及用于分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的計(jì)算分析流程。在分子和細(xì)胞生物學(xué)以及現(xiàn)有生物信息學(xué)工具方面的進(jìn)一步技術(shù)改進(jìn)將大大促進(jìn)這些測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)科學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用捌锭。
Introduction
將基因型映射到表現(xiàn)型是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中一個(gè)長(zhǎng)期存在的挑戰(zhàn)俘陷，解決這個(gè)問題的一個(gè)強(qiáng)有力的策略是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。然而观谦，盡管我們身體中的所有細(xì)胞都有幾乎相同的基因型拉盾，但任何一個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組信息都只反映了一個(gè)基因子集的活動(dòng)。此外豁状，由于我們身體中許多不同的細(xì)胞類型都表達(dá)一個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組捉偏，傳統(tǒng)的群體測(cè)序只能提供一個(gè)細(xì)胞群的平均表達(dá)信號(hào)。越來越多的證據(jù)進(jìn)一步表明泻红，基因表達(dá)是異質(zhì)性的告私，即使在相似的細(xì)胞類型;這種隨機(jī)表達(dá)反映了細(xì)胞的類型組成，也能觸發(fā)細(xì)胞的命運(yùn)決定承桥。然而，目前根悼，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄組分析實(shí)驗(yàn)仍然基于一個(gè)假設(shè)凶异，即來自給定組織的細(xì)胞是均勻的蜀撑，因此，這些研究很可能忽略了重要的細(xì)胞間變異剩彬。為了更好地理解隨機(jī)生物學(xué)過程酷麦，更精確地理解單個(gè)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組對(duì)于闡明它們?cè)诩?xì)胞功能中的作用以及理解基因表達(dá)如何促進(jìn)有益或有害狀態(tài)至關(guān)重要。
James Eberwine等人和Iscove及其同事率先在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序喉恋，他們分別使用體外轉(zhuǎn)錄的線性擴(kuò)增和PCR的指數(shù)擴(kuò)增來擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的cDNAs沃饶。這些技術(shù)最初應(yīng)用于商業(yè)上可用的高密度DNA芯片，隨后應(yīng)用于單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)轻黑『簦基于下一代測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的第一個(gè)描述發(fā)表于2009年，描述了細(xì)胞早期發(fā)育階段的特征氓鄙。自這項(xiàng)研究以來馆揉，獲得全球范圍內(nèi)單細(xì)胞異質(zhì)性的高分辨率視圖的興趣激增。至關(guān)重要的是抖拦，評(píng)估單個(gè)細(xì)胞間基因表達(dá)的差異升酣，有可能識(shí)別出無法通過分析匯集細(xì)胞檢測(cè)到的罕見群體。例如态罪，在人群中發(fā)現(xiàn)和描述離群細(xì)胞的能力對(duì)于進(jìn)一步理解癌癥治療中的耐藥性和復(fù)發(fā)具有潛在的意義噩茄。最近，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息學(xué)流程的重大進(jìn)展也使研究人員能夠在健康和疾病狀態(tài)下消除高度多樣化的免疫細(xì)胞群复颈。此外绩聘，scRNA-seq在早期發(fā)育、成肌細(xì)胞分化和淋巴細(xì)胞命運(yùn)測(cè)定中越來越多地被用來描述細(xì)胞譜系關(guān)系券膀。在這篇綜述中君纫，我們將討論各種scRNA-seq技術(shù)和計(jì)算工具的相對(duì)優(yōu)缺點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)scRNA-seq方法的潛在應(yīng)用芹彬。
Single-cell isolation techniques
單細(xì)胞分離是從單個(gè)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)錄組信息的第一步蓄髓。限制稀釋(圖1a)是一種常用的技術(shù)，其中用吸管稀釋分離單個(gè)細(xì)胞舒帮。一般情況下会喝，當(dāng)稀釋到每層0.5個(gè)細(xì)胞的濃度時(shí)，在孔板中只能得到約三分之一的制備孔板玩郊。由于細(xì)胞的這種統(tǒng)計(jì)分布肢执，這種方法不是很有效。顯微操作(圖1b)是從早期胚胎或未培養(yǎng)的微生物中提取細(xì)胞的經(jīng)典方法译红。和顯微鏡引導(dǎo)的毛細(xì)管吸管已被用于從懸浮液中提取單個(gè)細(xì)胞预茄。但是，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)侦厚、通量低耻陕。最近拙徽，流式細(xì)胞分選(FACS，圖1c)已成為分離高度純化單細(xì)胞最常用的策略诗宣。當(dāng)目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)非常低水平的標(biāo)記時(shí)膘怕，F(xiàn)ACS也是首選的方法。在這種方法中召庞，首先用熒光單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞岛心，該抗體可以識(shí)別特定的表面標(biāo)記并對(duì)不同的群體進(jìn)行分類。另外篮灼，對(duì)于未染色的群體忘古，也可能出現(xiàn)陰性選擇。在這種情況下穿稳，根據(jù)預(yù)先確定的熒光參數(shù)存皂，使用靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)將電荷施加到感興趣的電池上，并對(duì)電池進(jìn)行磁隔離逢艘。這些技術(shù)的潛在限制包括需要大的起始量(難以從少于10,000的低輸入數(shù)中分離細(xì)胞)和需要針對(duì)感興趣的蛋白的單克隆抗體旦袋。激光捕獲顯微解剖(圖1d)利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)輔助的激光系統(tǒng)從固體樣品中分離細(xì)胞。
微流控技術(shù)(圖1e)由于其樣品消耗低它改、分析成本低以及能夠?qū)崿F(xiàn)精確的流體控制疤孕，使得用于單細(xì)胞分離的微流控技術(shù)(圖1e)得到了廣泛的應(yīng)用。重要的是央拖，這種技術(shù)所需的納米級(jí)體積大大降低了外部污染的風(fēng)險(xiǎn)祭阀。微流體最初被用于少量的生化分析，用于DNA和蛋白質(zhì)的分析。然而，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了復(fù)雜的陣列中捆，允許單獨(dú)控制閥門和開關(guān)，從而提高了它們的可伸縮性伦腐。值得注意的是，近年來微流體技術(shù)的迅速發(fā)展改變了基礎(chǔ)科學(xué)家和臨床醫(yī)生的研究能力失都。該技術(shù)的應(yīng)用包括在微流控生物反應(yīng)器中對(duì)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的長(zhǎng)期分析柏蘑，以及以高度并行的方式對(duì)單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行定量分析。
一個(gè)廣泛使用的商業(yè)平臺(tái)粹庞，F(xiàn)luidigm C1咳焚，可以在一個(gè)芯片上為多達(dá)800個(gè)細(xì)胞提供自動(dòng)單細(xì)胞裂解、RNA提取和cDNA合成庞溜。與基于管道的技術(shù)相比革半，該平臺(tái)提供了更低的誤報(bào)和更少的偏差。然而，它的主要缺點(diǎn)包括捕獲所需的細(xì)胞數(shù)量(>1000)和被分析細(xì)胞的均勻大小限制督惰。另一種很有前途的單細(xì)胞分離技術(shù)是基于微滴的微流體技術(shù)不傅，它允許水滴在連續(xù)油相中進(jìn)行單分散。與標(biāo)準(zhǔn)微流體室相比赏胚，該系統(tǒng)所需的體積更小，能夠以更低的成本操作和篩選成千上萬的細(xì)胞商虐。10X Genomics公司的商用Chromium系統(tǒng)提供了3' 末端的高通量分析觉阅，具有很高的捕獲效率。因此秘车，這種高通量處理方法能夠在充分多樣化的生物空間中分析罕見的細(xì)胞類型典勇。然而，臨床樣本必須謹(jǐn)慎處理叮趴，以建立一個(gè)適當(dāng)?shù)沫h(huán)境割笙，不干擾現(xiàn)有的細(xì)胞特征。
例如眯亦，為了分離罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)伤溉， CellSearch(第一個(gè)臨床驗(yàn)證的、食品和藥物管理局批準(zhǔn)的測(cè)試)開發(fā)了一個(gè)系統(tǒng)來枚舉患者血液樣本中的CTCs(圖1f)妻率。該系統(tǒng)使用與抗體偶聯(lián)的磁鐵來檢測(cè)上皮來源的CTCs (CD45和EpCAM)乱顾。
a)極限稀釋法分離單個(gè)細(xì)胞，利用稀釋細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分布宫静。b)微操作包括使用顯微鏡引導(dǎo)的毛細(xì)管吸管收集單個(gè)細(xì)胞走净。c) FACS通過熒光標(biāo)記蛋白標(biāo)記細(xì)胞分離高度純化的單細(xì)胞。d)激光捕獲顯微解剖(LCM)利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)輔助的激光系統(tǒng)從固體樣品中分離細(xì)胞孤里。e)用于單細(xì)胞分離的微流體技術(shù)需要納米級(jí)的體積伏伯。一個(gè)內(nèi)部基于微滴的微流體的例子(例如，Drop-Seq)捌袜。f)細(xì)胞搜索系統(tǒng)使用與CTC結(jié)合抗體偶聯(lián)的磁鐵從患者血液樣本中枚舉CTCs说搅。g)基于drop的庫生成的示意圖示例。scna -seq的文庫通常是通過細(xì)胞裂解琢蛤、逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA(使用獨(dú)特的條形碼珠子)蜓堕、第二鏈合成和cDNA擴(kuò)增生成的
Comparative analysis for scRNA-seq library preparation
構(gòu)建scRNA-seq文庫的常見步驟包括細(xì)胞裂解、逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA博其、第二鏈合成和cDNA擴(kuò)增套才。一般情況下，細(xì)胞在低滲透壓的buffer中裂解慕淡，poly(A)+選擇使用poly(dT)引物捕獲mRNA(圖1g)背伴。已經(jīng)確定，由于采樣符合泊松分布，只有10%-20%的轉(zhuǎn)錄本將在這個(gè)階段逆轉(zhuǎn)錄傻寂。這種低mRNA捕獲效率是現(xiàn)存scRNA-seq protocols中仍然存在的一個(gè)重要挑戰(zhàn)息尺，需要一種高效的細(xì)胞裂解策略。
對(duì)于cDNA的制備疾掰，一種具有低RNase H活性和高熱穩(wěn)定性的工程版莫羅尼小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶通常用于第一鏈合成搂誉。第二鏈可以使用poly(A)尾礦或template-switching（36,37）生成。與前者相比静檬，后一種方法確保了統(tǒng)一的覆蓋范圍炭懊，而不會(huì)丟失strand-specific。然后用常規(guī)PCR或體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步擴(kuò)增少量合成的cDNAs拂檩。體外轉(zhuǎn)錄方法可以線性擴(kuò)增模板侮腹，但耗時(shí)較長(zhǎng)，因?yàn)樗枰~外的逆轉(zhuǎn)錄稻励，這可能導(dǎo)致3'覆蓋偏差父阻。Smart-seq2 (Smart-seq的改進(jìn)版本)生成全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，因此適合于使用單核苷酸多態(tài)性發(fā)現(xiàn)選擇性剪接事件和等位基因特異性表達(dá)望抽。目前加矛，Illumina平臺(tái)被廣泛應(yīng)用于測(cè)序步驟(如HiSeq4000和NextSeq500)。特別是糠聪，MiSeq測(cè)序儀提供了快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間荒椭，一天可以產(chǎn)生約3000萬PE reads。
深入的轉(zhuǎn)錄組分析需要對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行分析舰蟆。為了應(yīng)對(duì)相關(guān)的測(cè)序成本趣惠，以前的方法只關(guān)注轉(zhuǎn)錄的5'或3'末端。最近身害，研究人員在逆轉(zhuǎn)錄步驟中加入了獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(UMIs)或條形碼(隨機(jī)的48bp序列)味悄。考慮到單個(gè)細(xì)胞中存在10^5 -10^6個(gè)mRNA分子塌鸯，> 10000個(gè)表達(dá)基因侍瑟，至少需要4-bp UMIs(區(qū)分4^4 = 256個(gè)分子)。利用該策略丙猬，可以有效去除PCR bise涨颜，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，從而將每個(gè)讀序列分配到原始細(xì)胞茧球。這些條形碼方法利用分子計(jì)數(shù)庭瑰，并顯示出比使用基于序列讀取的術(shù)語(如RPKM/FPKM(每千堿基每百萬映射讀取讀取/片段))間接量化分子更好的重現(xiàn)性。然而抢埋，目前基于UMI標(biāo)記的方法序列要么位于轉(zhuǎn)錄本的5' 端弹灭，要么位于轉(zhuǎn)錄本的3' 端督暂，因此不適合用于等位基因特異性表達(dá)或異構(gòu)體的使用。表1給出了典型的scRNA-seq建庫方法的比較穷吮。
Computational challenges in scRNA-seq
盡管許多實(shí)驗(yàn)室越來越容易使用scRNA-seq的實(shí)驗(yàn)方法逻翁，但處理原始數(shù)據(jù)文件的計(jì)算流程仍然有限。一些商業(yè)公司提供軟件工具捡鱼，如10×Genomics和Fluidigm八回，但這一領(lǐng)域仍處于起步階段，金標(biāo)準(zhǔn)的工具尚未開發(fā)堰汉。在下面的幾節(jié)中辽社，我們將討論當(dāng)前用于分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)工具。
Pre-processing the data
一旦從scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中獲得read數(shù)據(jù)翘鸭，就進(jìn)行質(zhì)量控制(QC)。在現(xiàn)有的QC工具中戳葵，F(xiàn)astQC是一種流行的工具就乓，用于檢查整個(gè)讀取過程中的質(zhì)量分布。低質(zhì)量的堿基(通常在3'端)和接頭序列（adapter）可以在這個(gè)預(yù)處理步驟中刪除拱烁。比對(duì)（Read alignment）是scRNA-seq分析的下一步生蚁，此過程中可用的工具，包括Burrows-Wheeler Aligner (BWA)和STAR戏自，與在bulk RNA-seq分析流程中使用的工具相同邦投。在實(shí)現(xiàn)UMIs時(shí)，應(yīng)該先將umi 截掉擅笔。RNA-seQC程序提供比對(duì)后的摘要統(tǒng)計(jì)信息志衣，例如唯一比對(duì)的read、比對(duì)到注釋的外顯子區(qū)域以及與特定文庫的覆蓋覆蓋度等猛们。當(dāng)添加已知數(shù)量和序列的轉(zhuǎn)錄本(外部spikein)進(jìn)行校準(zhǔn)和QC時(shí)念脯，內(nèi)源性RNA與spikein的低比對(duì)比將表明，RNA降解或細(xì)胞裂解效率低下導(dǎo)致的文庫質(zhì)量較低弯淘。圖2描述了單細(xì)胞分析流程的示意圖绿店。
圖：
scRNA-seq數(shù)據(jù)具有固有的噪聲和混雜因素，如技術(shù)和生物變量庐橙。測(cè)序后假勿，進(jìn)行比對(duì)和去重，以量化一個(gè)初始基因表達(dá)譜矩陣态鳖。接下來转培，使用各種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)原始表達(dá)式數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。當(dāng)使用spikein時(shí)郁惜，通過檢查比對(duì)率來丟棄低質(zhì)量的細(xì)胞堡距，可以進(jìn)一步QC甲锡。最后，通過單元格聚類對(duì)歸一化矩陣進(jìn)行主分析羽戒，識(shí)別子類型缤沦。根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以推斷出細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)軌跡
比對(duì)后，使用一般轉(zhuǎn)錄本格式的轉(zhuǎn)錄注釋將讀序列分配給外顯子易稠、內(nèi)含子或基因間特征缸废。只有讀到高作圖質(zhì)量的外顯子位點(diǎn)的圖譜，才能考慮生成基因表達(dá)矩陣(N(細(xì)胞) x m(基因)驶社。scRNA-seq數(shù)據(jù)的一個(gè)顯著特征是由于信號(hào)丟失或短暫的基因表達(dá)等原因?qū)е碌挠?jì)數(shù)為零企量。為了解釋這個(gè)特性，必須執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化;為了消除可能影響下游應(yīng)用的細(xì)胞特異性偏差(例如亡电，差異基因表達(dá)的測(cè)定)届巩，標(biāo)準(zhǔn)化是必要的。
每個(gè)細(xì)胞中一個(gè)基因的read數(shù)預(yù)計(jì)與基因特異性表達(dá)水平和細(xì)胞特異性標(biāo)度因子(隨機(jī))成正比份乒。這些討厭的變量恕汇，包括捕獲和逆轉(zhuǎn)錄效率以及細(xì)胞內(nèi)在因素，通常很難估計(jì)或辖，因此通常被modeled（認(rèn)為是）為固定因素瘾英。雖然討厭的變量可以與表達(dá)量一起估算均一化，但只適合于特定的統(tǒng)計(jì)模型颂暇，而且該過程需要計(jì)算缺谴。在實(shí)踐中，假設(shè)大多數(shù)基因沒有差異表達(dá)耳鸯，原始表達(dá)計(jì)數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞間的比例因子估計(jì)來標(biāo)準(zhǔn)化湿蛔。最常用的方法包括RPKM、FPKM和每千堿基百萬(TPM)的轉(zhuǎn)錄本(圖3a, b)片拍。例如煌集，RPKM計(jì)算為(外顯子讀10^9)/(exon length * total mapped read)。RPKM和FPKM之間的唯一區(qū)別是捌省，F(xiàn)PKM考慮的是如果是PE read比對(duì)苫纤，那么read count的計(jì)算是指一個(gè)比對(duì)mates。TPM是RPKM的一個(gè)修改纲缓，其中每個(gè)樣本中所有TPMs的總和在樣本之間是一致的( exonic read×mean read length×106/exon length×total transcript)卷拘。這種方法比基于PKM/ fpkm的估計(jì)更容易比較每個(gè)基因的mapped reads，因?yàn)樵赥PM中祝高，每個(gè)樣本的歸一化read 之和是相同的(圖3c)【 This approach makes comparisons of mapped reads for each gene easier than PKM/FPKM-based estimates because the sum of normalized reads in each sample is the same in TPM】栗弟。然而，當(dāng)檢測(cè)差異表達(dá)基因時(shí)工闺，這些基于文庫大小的標(biāo)準(zhǔn)化方法可能還不夠好乍赫“曛考慮到這種情況，當(dāng)兩個(gè)基因在兩個(gè)條件(A和B)中表達(dá)雷厂。在條件A下,這兩個(gè)基因表達(dá)相同,而在條件B中, B基因表達(dá)雙倍高于基因A .如果我們把這個(gè)絕對(duì)表達(dá)式轉(zhuǎn)換成相對(duì)表達(dá)式,有人就可以得出這樣的結(jié)論:基因A差異表達(dá)了,雖然這種影響只是其與基因B的比較(圖3 d)惋增。正如以前所觀察到的，如果一組特定的mRNA在一種情況下高表達(dá)改鲫，而在另一種情況下沒有高表達(dá)诈皿，那么可能會(huì)錯(cuò)誤地認(rèn)為無差異基因識(shí)別為始終如一地下調(diào)。
圖3：
a)每千堿基讀(RPK)的定義是將一個(gè)isoform (i)的讀計(jì)數(shù)乘以1000像棘，再除以isoform長(zhǎng)度稽亏。每千堿基每百萬讀數(shù)(RPKM)的定義是為了比較實(shí)驗(yàn)或不同的樣本(細(xì)胞)，以便將總片段數(shù)的額外標(biāo)準(zhǔn)化集成到分母項(xiàng)中缕题，分母項(xiàng)以百萬為單位表示截歉。
b)TPM考慮了其他亞型，與RPKM形成對(duì)比烟零。這一指標(biāo)量化了豐富的異構(gòu)體(i)使用RPK分?jǐn)?shù)跨異構(gòu)體怎披。
c)一個(gè)示意圖示例說明了RPKM和TPM措施之間的區(qū)別。TPM對(duì)于測(cè)量相對(duì)豐度是有效的瓶摆，因?yàn)樵诓煌膯卧校偟臍w一化讀取是恒定的性宏。
d)然而群井，我們應(yīng)該小心地解釋這樣一個(gè)事實(shí):由于其他亞型的過度表達(dá)，差異表達(dá)的基因可能被錯(cuò)誤地標(biāo)注
為了克服樣本內(nèi)歸一化方法中固有的問題毫胜，提出了多種方法书斜。樣本間歸一化最常用的兩種方法是TMM（The trimmed mean of M-value）方法和DESeq方法。這些框架背后的基本思想是酵使，高度可變的基因控制著read count荐吉，從而扭曲了表達(dá)譜中的相對(duì)豐度（ thus skewing the relative abundance in expression profiles）。首先口渔，TMM選取參考樣本样屠，其他樣本作為測(cè)試樣本。每個(gè)基因的m值計(jì)算為測(cè)試與參考樣本之間的基因?qū)?shù)表達(dá)比缺脉。然后痪欲，剔除m值極值的基因后，對(duì)每個(gè)測(cè)試樣本設(shè)置這些m值的加權(quán)平均值攻礼。與TMM相似业踢，DESeq將比例因子計(jì)算為特定樣本中每個(gè)基因s的讀計(jì)數(shù)與所有樣本的幾何平均值之比的中位數(shù)。然而礁扮，當(dāng)存在大量的零計(jì)數(shù)時(shí)知举，這兩種方法(TMM和DESeq)的性能都很差瞬沦。為了避免隨機(jī)零計(jì)數(shù)，提出了一種基于匯聚表達(dá)值55的歸一化方法雇锡，該方法對(duì)數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因具有較強(qiáng)的魯棒性逛钻。高變異基因的選擇對(duì)歸一化方法很敏感，因此影響了數(shù)據(jù)異質(zhì)性的分析遮糖，因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究在聚類分析之前使用高變異基因來降低維度绣的。將樣本內(nèi)和樣本間歸一化方法結(jié)合起來的潛力很大程度上尚未探索，而且仍然是一個(gè)需要嚴(yán)格測(cè)試的活躍研究領(lǐng)域欲账。
歸一化后屡江，下一步是估計(jì)混雜因素。我們知道觀察到的讀計(jì)數(shù)受多種因素的影響赛不，包括生物變量和技術(shù)噪聲(圖4)惩嘉。關(guān)鍵是，scRNA-seq中使用的少量起始材料可能會(huì)放大技術(shù)噪聲的影響踢故。使用spikein可以有效地抑制這種放大文黎，例如Ambion的ERCC spikein組合，但是一些droplet-based 的應(yīng)用不能很容易地納入這個(gè)系統(tǒng)殿较。與傳統(tǒng)的RNA-seq不同耸峭，傳統(tǒng)的bulk RNA-seq是在多種條件下比較差異表達(dá)的基因，而在scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中淋纲，來自一種條件的細(xì)胞通常被捕獲并測(cè)序(圖4a)劳闹。因此，批次效應(yīng)洽瞬，即與任何生物變異無關(guān)的本涕、由樣品制備條件引起的系統(tǒng)差異，往往是顯著的伙窃。對(duì)一個(gè)條件下的多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)分析將有助于評(píng)估由于批次效應(yīng)而產(chǎn)生的技術(shù)可變性;然而菩颖，這種方法需要額外的成本和勞動(dòng)力。此外为障，除了技術(shù)噪音晦闰，生物變量(如狀態(tài)、周期产场、大小和凋亡)也可能影響基因表達(dá)譜鹅髓。最近，為了解決這個(gè)問題京景，開發(fā)了scLVM方法窿冯，并被證明對(duì)消除由潛在變量解釋的變化是有用的。這種方法被應(yīng)用于T細(xì)胞分化确徙，以發(fā)現(xiàn)未知的亞群醒串，并使識(shí)別對(duì)TH2細(xì)胞分化至關(guān)重要的相關(guān)基因成為可能执桌，否則，當(dāng)存在細(xì)胞周期協(xié)變量時(shí)芜赌，這是不可能的(圖4b)仰挣。對(duì)已知和未知變量的管理也可以使用包含隨機(jī)噪聲的線性組合的復(fù)雜統(tǒng)計(jì)模型(圖4c)來處理。
圖：
a) 在scRNA-seq中缠沈，當(dāng)實(shí)驗(yàn)(條件)在不同的板(環(huán)境)中進(jìn)行時(shí)膘壶，技術(shù)間歇效應(yīng)是一個(gè)眾所周知的問題。在歸一化步驟中洲愤，必須考慮細(xì)胞特異性的標(biāo)度因子颓芭，如捕獲和RT效率、dropout/擴(kuò)增偏差柬赐、稀釋因子和測(cè)序量亡问。
b) 單細(xì)胞潛在變量模型(scLVM)能有效去除細(xì)胞周期效應(yīng)解釋的變異。在使用PCA(參考文獻(xiàn)58的可視化)校正的scvm表達(dá)數(shù)據(jù)中肛宋，這種清晰的分離丟失了州藕。
c) 表達(dá)式值y可以用噪聲矩陣表示為r個(gè)技術(shù)和生物因素與k個(gè)潛在因素的線性組合
Cell type identification
對(duì)人體中眾多細(xì)胞的鑒定是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。正如Kacser和Waddington在他對(duì)細(xì)胞可塑性的比喻中指出的那樣酝陈，細(xì)胞具有巨大的潛在狀態(tài)床玻，它們可以在發(fā)育過程和疾病進(jìn)展中采用這些狀態(tài)。然而沉帮，對(duì)于任何特定的細(xì)胞類型笨枯，幾乎沒有可靠的標(biāo)記存在，即使有成熟的標(biāo)記(如免疫細(xì)胞中的分化簇(CD)標(biāo)記)遇西，隱藏的多樣性仍然存在。在scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中严嗜，為了避免維數(shù)的詛咒粱檀，通常在讀取計(jì)數(shù)歸一化后進(jìn)行降維。主成分分析(PCA)是一種廣泛應(yīng)用的無監(jiān)督線性降維方法漫玄。通過將細(xì)胞投影到二維空間中茄蚯，我們可以很容易地可視化樣本，提高了解釋能力(圖5)睦优。此外渗常，還可以利用其他非線性降維方法，如t-distributed random neighbor embedded (t-SNE)60汗盘、多維尺度皱碘、局部線性嵌入(local linear embedded, LLE)和Isomap。t-SNE在流行的Cell Ranger pipeline(10 Genomics)和Seurat的R包中實(shí)現(xiàn)隐孽。盡管LLE和Isomap對(duì)微陣列data顯示出優(yōu)越的性能癌椿，但是這些方法應(yīng)該在scRNA-seq數(shù)據(jù)集上進(jìn)一步的評(píng)估健蕊。我們進(jìn)一步警告說，降維可能導(dǎo)致重要的生物學(xué)信息的丟失踢俄。
細(xì)胞生活在與周圍環(huán)境相互作用的動(dòng)態(tài)context中缩功。PCA可用于識(shí)別已知和未知的細(xì)胞簇。正扯及欤基因表達(dá)譜二維投影后可進(jìn)行細(xì)胞層次重建嫡锌。解碼調(diào)控網(wǎng)絡(luò)融合了偽時(shí)間推斷軌跡和二維空間聚類基因表達(dá)信息
聚類是另一種檢測(cè)低質(zhì)量細(xì)胞的有效方法，方法是通過特異性地識(shí)別富含線粒體(mt)基因的聚類琳钉。該方法基于一項(xiàng)研究势木，該研究表明，當(dāng)細(xì)胞膜破裂時(shí)槽卫，mtDNA基因上調(diào)跟压，細(xì)胞質(zhì)RNA丟失。一旦劃分完成歼培，下一步就是識(shí)別不同簇間差異表達(dá)的標(biāo)記基因震蒋。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)最簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)模型是泊松模型，它只使用一個(gè)參數(shù)(方差=平均值)躲庄。然而查剖，對(duì)于單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的各種噪聲源，使用負(fù)二項(xiàng)模型(方差=均值+離散度X均值的平方;對(duì)于大多數(shù)基因噪窘，離散度是>0)笋庄。另一種選擇是，誤差模型可以用來解釋技術(shù)噪音(例如倔监，dropout)直砂。單細(xì)胞差異表達(dá)分析平臺(tái)使用了兩個(gè)概率過程的混合物:一個(gè)用于適當(dāng)放大并與其豐度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，另一個(gè)用于未放大或檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本浩习。值得注意的是静暂，盡管混合模型比單峰模型具有優(yōu)勢(shì)，但是異構(gòu)細(xì)胞分布常常產(chǎn)生雙峰分布谱秽。
Inferring regulatory networks
推斷監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)
基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRNs)的闡明可以增強(qiáng)我們對(duì)活細(xì)胞復(fù)雜細(xì)胞過程的理解洽蛀，這些網(wǎng)絡(luò)通常揭示基因和蛋白質(zhì)之間的調(diào)控相互作用(圖5)。值得注意的是疟赊，GRN的測(cè)定并不是生物學(xué)研究的最終結(jié)果郊供，而是連接基因型和表型的中間橋梁。以前近哟，基于微陣列的批量RNA-seq被用來揭示這些網(wǎng)絡(luò)驮审，盡管最近scna -seq被用于這一目的。單細(xì)胞基因組學(xué)使推斷GRNs變得更容易，因?yàn)榈湫偷膶?shí)驗(yàn)允許在一種條件下捕獲數(shù)千個(gè)細(xì)胞头岔，這增加了統(tǒng)計(jì)能力塔拳。然而，由于細(xì)胞內(nèi)的異質(zhì)性和大量的基因相互作用峡竣，GRN的測(cè)定仍然具有挑戰(zhàn)性靠抑。
已經(jīng)開發(fā)了許多計(jì)算算法來處理大量的基因表達(dá)數(shù)據(jù)產(chǎn)生的批量群體分析和揭示GRNs。這些方法可以分為基于機(jī)器學(xué)習(xí)的适掰，基于共同表達(dá)的颂碧、基于模型的，和基于信息理論的方法类浪≡爻牵基于共表達(dá)的方法可能是識(shí)別假定關(guān)系的最簡(jiǎn)單方法，但這些方法無法對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)的精確動(dòng)力學(xué)建模费就∷咄撸基于模型的推理，如貝葉斯網(wǎng)絡(luò)力细，使用了許多參數(shù)睬澡，且耗時(shí)。此外眠蚂，概率圖形模型需要為許多基因?qū)ふ宜锌赡艿穆窂缴反希@是一個(gè)np難題。近年來逝慧，利用互信息和條件互信息的基于信息論的方法得到了廣泛的應(yīng)用昔脯，因?yàn)樗鼈儧]有假設(shè)，可以測(cè)量基因之間的非線性關(guān)聯(lián)笛臣。
從單細(xì)胞的角度來看云稚，必須將單細(xì)胞的隨機(jī)特征適當(dāng)?shù)丶傻紾RN模型中。如上所述沈堡，技術(shù)噪音很難與真正的生物變異性區(qū)別開來碱鳞，而剩余的變異性仍然知之甚少。然而踱蛀，單細(xì)胞數(shù)據(jù)的異步性以及多個(gè)細(xì)胞子類型的存在，可能提供了檢測(cè)假定的調(diào)控關(guān)系所需的固有統(tǒng)計(jì)可變性贵白。近年來率拒，從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中識(shí)別GRNs的方法得到了廣泛的應(yīng)用，并成功地應(yīng)用于T細(xì)胞生物學(xué)中禁荒，為共表達(dá)分析數(shù)據(jù)提供了新的思路猬膨。
值得強(qiáng)調(diào)的是，檢測(cè)調(diào)控關(guān)系應(yīng)該在合理的時(shí)間尺度內(nèi)是可能的，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄變化不會(huì)永遠(yuǎn)持續(xù)勃痴。此外谒所，為了推斷因果關(guān)系，必須通過微擾研究或時(shí)間數(shù)據(jù)來驗(yàn)證和細(xì)化已識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中基因之間的方向性沛申。
Cell hierarchy reconstruction
細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)的重構(gòu)
個(gè)體細(xì)胞不斷經(jīng)歷動(dòng)態(tài)過程劣领，并對(duì)各種環(huán)境刺激作出反應(yīng)。其中一些反應(yīng)是快速的铁材，而另一些反應(yīng)可能要慢得多尖淘，并且可以在多年的過程中發(fā)生(例如，發(fā)病機(jī)制)著觉。這一動(dòng)態(tài)過程特別反映在細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)中村生，包括RNA和蛋白質(zhì)的含量。要研究體細(xì)胞中的基因組尺度動(dòng)態(tài)過程饼丘，細(xì)胞必須使用復(fù)雜的技術(shù)來同步趁桃。然而，在單細(xì)胞系統(tǒng)中肄鸽，細(xì)胞是不同步的卫病，這使得捕獲沿著整個(gè)軌跡的不同瞬時(shí)時(shí)間點(diǎn)成為可能。然后贴捡，我們可以應(yīng)用算法來重建與細(xì)胞分化或細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞軌跡(表2)忽肛。
scRNA單細(xì)胞RNA測(cè)序，水肺單細(xì)胞分岔聚類烂斋，t-SNE t分布隨機(jī)鄰接嵌入屹逛，ICA獨(dú)立分量分析，MST最小生成樹汛骂，PCA主成分分析罕模，k-NNG k近鄰圖
在Monocle16算法中引入了偽時(shí)間的概念，該算法測(cè)量細(xì)胞的生物進(jìn)程(圖5)帘瞭。在這里淑掌，偽時(shí)間的概念與實(shí)時(shí)不同，因?yàn)榧?xì)胞是一次性采樣的蝶念。最大吝嗇是推斷細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的基本原理抛腕，在進(jìn)化生物學(xué)中已廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育樹的重建。Monocle最初構(gòu)建的圖形中媒殉，節(jié)點(diǎn)表示單元格担敌，而邊緣對(duì)應(yīng)于每對(duì)單元格。利用獨(dú)立分量分析(ICA)廷蓉，根據(jù)降維后矩陣中單元間的距離計(jì)算邊緣權(quán)值全封。然后應(yīng)用最小生成樹(MST)算法搜索最長(zhǎng)的主鏈。這些方法的主要限制是構(gòu)造的樹非常復(fù)雜，因此用戶必須指定k個(gè)分支才能搜索刹悴。最近提出了一個(gè)更高級(jí)的版本Monocle2;這個(gè)版本比Monocle更快行楞、更健壯，并結(jié)合了使用反向圖嵌入技術(shù)的非監(jiān)督數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)方法土匀。對(duì)于時(shí)間信息可用的情況子房，基于監(jiān)督學(xué)習(xí)的方法可以更加準(zhǔn)確。例如恒削，使用分支分析的單細(xì)胞聚類(SCUBA)89實(shí)現(xiàn)了分支分析池颈，并已被用于從多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的基因表達(dá)譜中恢復(fù)小鼠胚胎早期發(fā)育階段的譜系。
scna -seq還被成功地應(yīng)用于在體神經(jīng)遺傳學(xué)中重建譜系钓丰。這種技術(shù)的一種適應(yīng)性躯砰，Div-Seq，通過直接測(cè)序分離的細(xì)胞核携丁，繞過了組織分離的需要琢歇。眾所周知，酶解會(huì)破壞RNA的組成梦鉴，破壞完整性李茫，因此，如果沒有這種修飾肥橙，研究復(fù)雜組織(如大腦)中的細(xì)胞是不可能的魄宏。軌跡推斷的初始方法是基于線性路徑的;然而，最近的工作已經(jīng)整合了分支92的概念存筏，這對(duì)于理解動(dòng)態(tài)細(xì)胞系統(tǒng)可能是至關(guān)重要的宠互。Lander和他的同事們最近提出了一個(gè)更加靈活的概率框架，并利用這種方法在成纖維細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重新編程的過程中重建已知和未知的細(xì)胞命運(yùn)圖椭坚。我們希望予跌，從細(xì)胞譜系確定或涉及到在分支點(diǎn)擾動(dòng)調(diào)控器的實(shí)驗(yàn)中收集到的額外生物學(xué)見解，將對(duì)增強(qiáng)我們對(duì)復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)的理解有價(jià)值善茎。盡管本文的主要關(guān)注點(diǎn)是基于rna -seq的方法券册，但我們也注意到，細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)也可以通過proteomic94垂涯、95或表觀基因組測(cè)量重建烁焙。
Potential applications and future prospects
潛在的應(yīng)用前景
scna -seq正在徹底改變我們對(duì)生物學(xué)的基本理解，這項(xiàng)技術(shù)開辟了超越細(xì)胞狀態(tài)描述研究的新研究領(lǐng)域耕赘。人們可以想象許多令人興奮的醫(yī)學(xué)應(yīng)用可以利用這項(xiàng)技術(shù)骄蝇。腫瘤異質(zhì)性是一種常見的現(xiàn)象，可以發(fā)生在腫瘤內(nèi)部和之間鞠苟，我們希望scRNA-seq可以用于闡明未知的腫瘤特征，不能從傳統(tǒng)的批量轉(zhuǎn)錄組研究中識(shí)別。例如当娱，該技術(shù)可用于評(píng)估癌癥細(xì)胞藥物耐受發(fā)展過程中的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性吃既，并分析特定通路的表達(dá)譜(圖6a)。通過這種方式跨细，scna -seq可能有助于生成癌癥進(jìn)化的模型鹦倚。此外，該技術(shù)還可以通過建立轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)模型來重建細(xì)胞間的克隆和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系冀惭。
圖6
瘤內(nèi)異質(zhì)性對(duì)癌癥基因組學(xué)提出了挑戰(zhàn)震叙。scna -seq可以通過在各種上下文中根據(jù)響應(yīng)性有效地標(biāo)識(shí)子組來解決這個(gè)問題。b液活檢提供了令人興奮的機(jī)會(huì)散休，CTCs的scna -seq可以為生物標(biāo)志物的表征提供新的見解媒楼。c scna -seq能從早期發(fā)育階段推斷譜系信息，并能識(shí)別新的差異標(biāo)記
最近戚丸，血液中CTCs的分析預(yù)示了液體活檢的黃金時(shí)代划址，強(qiáng)調(diào)了利用這種DNA作為臨床診斷標(biāo)記的潛力(圖6b)。scna -seq可能被用于發(fā)現(xiàn)CTCs的編碼突變和融合基因限府。我們進(jìn)一步預(yù)測(cè)夺颤，RNA可以作為常規(guī)臨床評(píng)估的一部分，在同一細(xì)胞中對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的并行測(cè)量可以闡明DNA和RNA變異的表型后果胁勺。
譜系追蹤是生物學(xué)中一個(gè)長(zhǎng)期存在的基本問題世澜，旨在了解單細(xì)胞胚胎如何產(chǎn)生各種細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型被組織成復(fù)雜的組織和器官(圖6c)署穗。作為概念驗(yàn)證寥裂，加州理工學(xué)院的研究人員最近開發(fā)了一種方法，利用單個(gè)細(xì)胞中mRNA水平的序列讀出來重建多個(gè)世代的譜系系統(tǒng)發(fā)育蛇捌。scna -seq的另一個(gè)有趣的潛在應(yīng)用包括鑒定參與干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因抚恒。我們現(xiàn)在才剛剛開始了解干細(xì)胞是如何被觸發(fā)成為功能細(xì)胞的，這是了解人類健康和疾病的基本生物學(xué)過程所必需的信息络拌。
隨著測(cè)序成本的降低俭驮，在未來5年內(nèi)，將有可能對(duì)100多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)分析春贸。人類細(xì)胞Atlas101的目標(biāo)是繪制出人體35萬億細(xì)胞的圖譜混萝，它已經(jīng)開始了一些試點(diǎn)研究。最初的計(jì)劃是對(duì)3000萬到1億個(gè)細(xì)胞中的所有RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序萍恕，然后使用基因表達(dá)譜對(duì)新的細(xì)胞類型進(jìn)行分類和識(shí)別逸嘀。例如，預(yù)計(jì)高度多樣化的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的scRNA-seq將加深我們對(duì)其固有異質(zhì)性的理解允粤，特別是在淋巴細(xì)胞行為方面崭倘。布羅德研究所(Broad Institute)的一項(xiàng)研究進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了scRNA-seq的效用翼岁，該研究揭示了18個(gè)看似相同的免疫細(xì)胞的子集，這些細(xì)胞之間的基因表達(dá)模式存在明顯差異司光。一些新興的scna -seq研究集中于加深我們對(duì)大腦細(xì)胞102,103的理解琅坡。從這些分析中收集的信息很可能被用來識(shí)別與神經(jīng)相關(guān)疾病相關(guān)的新途徑，為生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供新的治療靶點(diǎn)残家。我們展望scna -seq在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的未來應(yīng)用榆俺，也將為各種組織和器官的生理結(jié)構(gòu)功能關(guān)系提供新的見解。最終坞淮，隨著標(biāo)準(zhǔn)化生物信息學(xué)流程的可用性的改善茴晋，這項(xiàng)工作將揭示對(duì)生物系統(tǒng)的新見解，并為治療開發(fā)創(chuàng)造新的機(jī)會(huì)回窘。
個(gè)人比較感興趣的部分是分析的方法
總結(jié)一下分析方法
1诺擅，數(shù)據(jù)的預(yù)處理，fastqc看數(shù)據(jù)質(zhì)量毫玖，過濾掀虎，使用bwa，STAR比對(duì)付枫，
2烹玉，得到表達(dá)矩陣（expression matrix），使用RPKM或TPM
3阐滩，標(biāo)準(zhǔn)化（TMM二打，或DESeq）
4，細(xì)胞類型鑒定（聚類掂榔，PCA继效，t-SNE等）
5，推斷監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)（有基于機(jī)器學(xué)習(xí)的装获，基于共同表達(dá)的瑞信、基于模型的，和基于信息理論的方法）
6穴豫，細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)重構(gòu)（Monocle2）
拓展：
2012年凡简，有一款名為Fluidigm C1的單細(xì)胞建庫儀器風(fēng)靡業(yè)界，它首次將微流控技術(shù)和單細(xì)胞建庫技術(shù)結(jié)合精肃，實(shí)現(xiàn)了在納升體系內(nèi)完成單細(xì)胞建庫秤涩，并且同時(shí)能完成96個(gè)單細(xì)胞建庫。方案降低了單個(gè)細(xì)胞的建庫成本司抱，但儀器價(jià)格十分昂貴】鹁欤現(xiàn)在來看，這款儀器壽命并不長(zhǎng)习柠，正在被新技術(shù)替代匀谣。
2015年出現(xiàn)了一個(gè)革命性的技術(shù)——基于液滴微流控的單細(xì)胞建庫技術(shù)照棋，實(shí)現(xiàn)了將細(xì)胞包裹在一個(gè)個(gè)很小的油包水的液滴（droplet）里面，液滴體積只有納升級(jí)別武翎，由于短時(shí)間內(nèi)可以生產(chǎn)百萬數(shù)量的液滴必怜，使得單細(xì)胞建庫的通量提高到了1000以上。該技術(shù)的出現(xiàn)使得單細(xì)胞大數(shù)據(jù)研究成為可能后频。與此同時(shí)，現(xiàn)在已經(jīng)涌現(xiàn)了一批同等通量的單細(xì)胞技術(shù)暖途，包括基于微孔芯片（microwell）以及組合分子標(biāo)簽（combinatorial indexing）的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)卑惜。
