免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）是使用能夠特異性結(jié)合目的蛋白質(zhì)的抗體將目的蛋白從溶液中沉淀出來的技術(shù)妓雾。該方法可從含有數(shù)千種不同蛋白質(zhì)的樣品中分離和濃縮目的蛋白。
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）是指在合適的buffer條件下利用免疫沉淀的原理沉淀出目的蛋白和與目的蛋白相互作用的其他分子垒迂。這種分子可以是蛋白質(zhì)械姻，也可以是DNA（也稱Chromatin immunoprecipitation ，ChIP）机断，也可以是RNA（也稱RNP Immunoprecipitation楷拳，RIP）。沉淀下來相互作用蛋白可以通過western blot或者質(zhì)譜搜庫(kù)鑒定吏奸。而相互作用DNA和RNA可以通過測(cè)序鑒定欢揖。
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IP原理：細(xì)胞裂解后，目的蛋白抗體（Primary antibody）與樣品中的目的蛋白（Protein complex）形成免疫復(fù)合物奋蔚。 然后將免疫復(fù)合物捕獲或沉淀在固定有抗體結(jié)合蛋白的珠子上（Secondary antibody, Protein A, Protein G or Protein A/G ）她混，并且洗掉未沉淀在珠子上的任何蛋白質(zhì)。 最后泊碑，從珠子上洗脫抗原（如果抗體不與珠子共價(jià)連接或使用變性緩沖液時(shí)坤按，抗體也會(huì)被洗脫），并通過western blot或者質(zhì)譜鑒定相關(guān)蛋白馒过。
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Recipes:
lysis buffer:
20mM Tris/HCl, pH7.6, 150mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors
理想的裂解緩沖液應(yīng)最大限度地減少蛋白質(zhì)變性，同時(shí)從樣品中釋放出足夠量的蛋白質(zhì)沉桌。非離子型洗滌劑如NP-40和Triton X-100一般不會(huì)使蛋白質(zhì)變性谢鹊。離子洗滌劑如SDS和脫氧膽酸鈉會(huì)使蛋白質(zhì)變性。 影響免疫沉淀的其他變量包括鹽濃度留凭，二價(jià)陽(yáng)離子濃度和pH佃扼。可加入10-15%的甘油來降低水的活度蔼夜，降低可溶性的蛋白的降解兼耀，其粘性又可穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。
Wash buffers：
10mM Tris/HCl, pH 7.6, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 150mM NaCl, 0.1% NP-40
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影響co-IP結(jié)果的因素如下：
1. 去垢劑（detergent）
? ? NP-40、Triton X-100等去垢劑能夠削弱蛋白質(zhì)之間的非特異性結(jié)合瘤运。如果去垢劑在裂解緩沖液中的濃度偏高窍霞，可能會(huì)檢測(cè)不到蛋白質(zhì)間的相互作用。但是拯坟，如果去垢劑在裂解緩沖液中濃度偏低或者沒有但金，可能出現(xiàn)非特異性結(jié)合的假陽(yáng)性結(jié)果。co-IP時(shí)去垢劑的濃度盡量在0.2-0.5%郁季，若高于這個(gè)濃度可能使染色質(zhì)析出造成溶液的粘稠冷溃。如果co-IP過程中發(fā)現(xiàn)溶液粘稠，需要進(jìn)行超聲切斷DNA（超聲可能會(huì)打斷蛋白質(zhì)間的相互作用）梦裂∷普恚可以使用1% NP-40的裂解液細(xì)胞后再用不含NP-40的裂解液稀釋NP-40的濃度，這樣可以保證裂解充分的同時(shí)又利于co-IP年柠。膜蛋白對(duì)于去垢劑種類和構(gòu)想非常敏感凿歼，所以膜蛋白的co-IP需要嘗試不同種類和不同濃度的去垢劑世澜。
2. 鹽離子濃度
? ? 150mM NaCl為生理?xiàng)l件下的鹽離子濃度音同。一般不用鉀鹽诈泼，鉀離子會(huì)與一些試劑形成沉淀蒲赂，例如SDS。一般來說涧郊，在生理鹽濃度下蛋白質(zhì)間如果有相互作用，則此蛋白質(zhì)復(fù)合體不會(huì)解體。不同的蛋白質(zhì)復(fù)合體對(duì)鹽離子濃度的敏感性不同渴丸，有的蛋白質(zhì)復(fù)合體甚至能夠耐受幾倍于生理鹽濃度的鹽離子濃度。裂解緩沖液中NaCl濃度低于150mM會(huì)大大增加假陽(yáng)性的幾率另凌，而且對(duì)染色體相關(guān)蛋白提取效果較差谱轨，并且此并非是一種檢測(cè)瞬間相互作用或弱相互作用的手段。
3. 蛋白濃度
? ? 蛋白濃度會(huì)影響蛋白質(zhì)之間的相互作用吠谢。蛋白質(zhì)濃度越高越容易檢測(cè)到相互作用土童，但是這種檢測(cè)到的相互作用可能是因?yàn)闈舛雀咚鶐淼募訇?yáng)性結(jié)果。所以工坊，在過表達(dá)檢測(cè)到相互作用后要做內(nèi)源的co-IP進(jìn)一步驗(yàn)證献汗。對(duì)于內(nèi)源蛋白，co-IP時(shí)蛋白濃度越高越容易檢測(cè)到相互作用王污。如果蛋白濃度較稀罢吃，某些相互作用就無法檢測(cè)到。因此昭齐，一般至少1個(gè)90%confluence以上的 6 cm dish的細(xì)胞量來做相互作用尿招。當(dāng)?shù)谝淮螜z測(cè)兩個(gè)蛋白質(zhì)間的相互作用，為了實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)和良好的穩(wěn)定性，推薦使用2個(gè)90%confluence以上的 10 cm dishes就谜。
4. lysis buffer 和 wash buffer 鹽離子濃度
? ? 一般lysis buffer 和 wash buffer 鹽離子濃度相同怪蔑。若lysis buffer 鹽離子濃度高，wash buffer 鹽離子濃度低丧荐，不利于雜蛋白去除缆瓣；若lysis buffer 鹽離子濃度低，wash buffer 鹽離子濃度高篮奄，會(huì)造成蛋白質(zhì)的損失捆愁。
5. 外源蛋白co-IP時(shí)標(biāo)簽的選擇
? ? His tag：HHHHHH? ? 該標(biāo)簽由羅氏發(fā)明（專利已過期）。有一定量的內(nèi)源蛋白質(zhì)含有HHHHHH的結(jié)構(gòu)域窟却，因此當(dāng)用Ni-NTA去IP目的蛋白時(shí)昼丑，會(huì)同時(shí)沉淀下來許多含HHHHHH的結(jié)構(gòu)域與實(shí)驗(yàn)體系無關(guān)的蛋白質(zhì)。His的優(yōu)點(diǎn)是Ni-NTA并非是抗體夸赫，十分廉價(jià)菩帝，并且用咪唑洗脫效果好價(jià)格低，并可用內(nèi)肽酶切除此標(biāo)簽茬腿，適合用于大量純化蛋白質(zhì)的研究呼奢，例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
? ? Flag tag：DYKDDDDK? ? Flag tag是理想化的人工設(shè)計(jì)的表位標(biāo)簽切平。其結(jié)構(gòu)經(jīng)過優(yōu)化握础，可與其附著的蛋白質(zhì)相容，因?yàn)樗哂泻軓?qiáng)的親水性悴品，因此不太可能使其附著的蛋白質(zhì)變性或失活禀综。Flag tag中的酪氨酸殘基可以被硫酸化，這會(huì)影響flag抗體識(shí)別苔严。腸肽酶可以切除此標(biāo)簽定枷。一般認(rèn)為，F(xiàn)lag抗體的效價(jià)普遍比HA抗體高届氢。因此欠窒，F(xiàn)lag tag是一個(gè)理想的co-IP標(biāo)簽。目前看來唯一的缺點(diǎn)是Flag抗體價(jià)格昂貴（sigma專利退子，未過期）岖妄。
? ? Myc tag：EQKLISEED? ? myc tag是衍生自c-myc基因產(chǎn)物的多肽蛋白標(biāo)簽，但是仍然會(huì)被內(nèi)源蛋白質(zhì)干擾寂祥。
? ? HA tag：YPYDVPDYA? ? HA tag衍生自氨基酸98-106的流感病毒HA蛋白衣吠。HA tag不適合檢測(cè)或純化凋亡細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗谛蛄蠨VPD后被Caspase-3和/或Caspase-7切割壤靶，導(dǎo)致其失去免疫反應(yīng)性缚俏。
? ? GST tag? ? GST tag的大小為220個(gè)氨基酸（大約26 KDa）。GST蛋白對(duì)GSH具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力，所以可以通過GSH純化GST tag的蛋白質(zhì)忧换。co-IP后可用游離的GSH洗脫恬惯。因其成本低，適合用于大量純化蛋白質(zhì)的研究亚茬，例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)酪耳。許多商業(yè)上的GST標(biāo)記質(zhì)粒包括凝血酶結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可用于在蛋白質(zhì)純化過程中切割GST標(biāo)簽刹缝。
? ? Tandem mass tag（TMT）? ? 專為通過串聯(lián)質(zhì)譜（MS）對(duì)不同樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量而設(shè)計(jì)碗暗。其目的為使外源性蛋白的表達(dá)水平處于極低狀態(tài)用于模擬體內(nèi)環(huán)境。目前有五種TMT可供選擇：①TMTzero梢夯；②TMTduplex言疗；③TMTsixplex；④TMT 10-plex颂砸；⑤TMT11plex噪奄。其并且洗脫試劑價(jià)格低廉。用此標(biāo)簽純化的蛋白質(zhì)后質(zhì)譜分析結(jié)果更全面人乓、更精確勤篮、更高效。但是色罚，TMT會(huì)結(jié)合內(nèi)源的鈣調(diào)蛋白碰缔，因此不能分析鈣信號(hào)通路。
6. 添加標(biāo)簽的位置
? ? 將tag添加的蛋白的N端或C端可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能戳护，也會(huì)影響蛋白質(zhì)間的相互作用金抡。主要考慮信號(hào)肽的問題。例如姑尺，流感病毒HA蛋白的信號(hào)肽在N端竟终，如果將tag加在HA的N端蝠猬，那么HA的信號(hào)肽在被信號(hào)肽酶切割的時(shí)候會(huì)同時(shí)將tag切除切蟋，這將導(dǎo)致無法檢測(cè)和純化到HA蛋白。因此榆芦，在克隆基因時(shí)柄粹，建議同時(shí)做兩個(gè)克隆，一個(gè)標(biāo)簽在N端匆绣，一個(gè)標(biāo)簽在C端驻右。
7. 對(duì)照的選擇
? ? co-IP需要有嚴(yán)格的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白質(zhì)之間存在相互作用崎淳，用這兩個(gè)蛋白做co-IP稱為陽(yáng)性對(duì)照堪夭。陰性對(duì)照為：①lgG對(duì)照；②protein A/G對(duì)照；③珠子對(duì)照森爽。若為外源的co-IP恨豁，陰性對(duì)照還應(yīng)增加過表達(dá)一個(gè)蛋白質(zhì)時(shí)的對(duì)照。
8. IP對(duì)象的選擇
? ? 一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)室可用的材料選擇可行爬迟。如果材料充足的話橘蜜，建議IP分子量大的蛋白或豐度低的蛋白，檢測(cè)另一個(gè)蛋白付呕。
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Protocol：
細(xì)胞裂解物的準(zhǔn)備：
1. 將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞计福。
2. 去除PBS，然后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液徽职。
3. 使用預(yù)冷的細(xì)胞刮刀將粘附的細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下象颖，然后將細(xì)胞懸浮液輕輕轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的EP管中。
4. 加入lysis buffer后活箕，在4°C下保持靜止或者旋轉(zhuǎn)30分鐘力麸。
? ? 注：lysis buffer的體積需自行摸索。一般6 cm dish 100% confluence加150-400μL的lysis buffer育韩。
5. 在4℃條件下12000g離心20分鐘克蚂。
? ? 注：少數(shù)貼壁細(xì)胞離心的離心力和時(shí)間會(huì)有所不同，需自行摸索筋讨。
6. 輕輕地從離心機(jī)中取出EP管并置于冰上埃叭，取部分上清液為全細(xì)胞裂解液（whole cell lysate or input）。
7. 將剩下的上清液移至新的預(yù)冷EP管中悉罕，棄沉淀赤屋。
免疫共沉淀：
離心去除細(xì)胞碎片后的上清是一個(gè)剛好的溶解平衡體系，添加其他物質(zhì)如珠子這類可作為沉淀凝結(jié)核的物質(zhì)會(huì)破壞原本的溶解平衡壁袄，讓一些原本溶解完全的蛋白發(fā)生沉淀类早。那么，珠子翻轉(zhuǎn)越久蛋白會(huì)沉淀越多嗜逻，而這種沉淀無法靠漂洗去除干凈涩僻，最終可能檢測(cè)到任意蛋白的結(jié)合。因此栈顷，推薦先加抗體再加入珠子逆日。一般離心珠子3000-4000xg已經(jīng)足以，再高的離心力會(huì)使珠子破碎萄凤，不利于回收再生使用室抽。
1. 在上述步驟7中的EP管中加入適量的目的蛋白抗體。
? ? 注：抗體濃度根據(jù)說明書或者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果靡努，取決于抗體的效價(jià)坪圾。如果目的蛋白或相互作用蛋白在55KD和25KD左右晓折，應(yīng)選用不同種屬的抗體分別做IP和IB以避免重鏈和輕鏈的干擾。
2. 將EP管在4℃條件下孵育1-12小時(shí)兽泄，推薦在溫和攪拌或旋轉(zhuǎn)條件下孵育已维。
? ? 注：孵育時(shí)間取決于目的蛋白濃度和抗體的親和性。如果目的蛋白抗體已經(jīng)偶聯(lián)珠子已日，跳過步驟3和4垛耳。
3. 孵育結(jié)束后，向EP管中加入合適量的偶聯(lián)Protein A/G 的珠子飘千。
? ? 注：偶聯(lián)Protein A/G 的珠子可提前加入lysis buffer和whole cell lysate去除背景堂鲜。
4. 將EP管在4℃條件下旋轉(zhuǎn)攪拌孵育1-2小時(shí)。
? ? 注：珠子加入的量根據(jù)說明書或者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果护奈。限制珠子翻轉(zhuǎn)孵育時(shí)間非常關(guān)鍵缔莲；通常珠子孵育1-2小時(shí)已經(jīng)充分結(jié)合了。
洗滌：
1. 沉淀上述步驟4的EP管中的珠子霉旗。如果珠子為Agarose痴奏，通過離心將珠子沉淀（建議4℃, 1000-3000xg離心2分鐘；也可4℃, 12000xg點(diǎn)離厌秒，但可能會(huì)損壞珠子）读拆。如果珠子為magnetic beads，通過磁力架將珠子沉淀鸵闪。
2. 取部分上清液作為flowthrough檐晕，去除剩下上清。
3. 使用洗滌緩沖液洗滌珠子三次（前兩次為0.1%NP-40的wash buffer蚌讼，最后一次為不含NP-40的wash buffer）以除去非特異性結(jié)合辟灰。每次洗滌，4℃條件下沉淀后棄去上清液篡石。
? ? 注：洗滌時(shí)間和次數(shù)根據(jù)相互作用強(qiáng)弱和非特異性結(jié)合強(qiáng)弱有所差異芥喇。較弱的相互作用，可以洗滌一次凰萨。
洗脫：
目前有四種方法洗脫目的蛋白復(fù)合物：①甘氨酸緩沖液洗脫继控；②SDS緩沖液洗脫；③尿素緩沖液洗脫沟蔑；④抗體的peptide湿诊。
①甘氨酸緩沖液洗脫：
在該方法中狱杰，使用含有0.1-0.2M甘氨酸瘦材，pH2.0-3.0的緩沖液通過酸化從珠子上洗脫目的蛋白復(fù)合物。甘氨酸的低pH會(huì)削弱抗體和珠子之間的相互作用仿畸。洗脫的樣品應(yīng)立即用pH值8.0-8.5的Tris中和食棕。此法優(yōu)點(diǎn)在于去除甘氨酸緩沖液后可以重復(fù)使用珠子朗和。交聯(lián)了抗體的珠子非常昂貴，再生珠子可以節(jié)約經(jīng)費(fèi)簿晓，一般珠子可以用塑料層析柱再生使用20-30次眶拉。一般，囤積了比較可觀的珠子后（大于 1ml）憔儿，高轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)過夜忆植，再用酸（0.1-0.2M Glycine-HCl）和高鹽（3M NaCl）洗去除珠子上殘留的蛋白，然后加入至少50%甘油含疊氮鈉的緩沖液保存在4℃谒臼。但是朝刊，高鹽和酸洗無法徹底清除珠子上的十分粘稠的蛋白。再生后的珠子有利于減少重鏈和輕鏈的背景蜈缤，用于銀染可以得到較為純凈的背景拾氓。
1. 于EP管中加入3倍珠子體積的0.1-0.2M, pH2.0-3.0的甘氨酸緩沖液，頻繁攪拌下將樣品孵育10分鐘底哥。
2. 孵育結(jié)束后離心咙鞍，用合適體積的Tris pH 8.0中和洗脫液。
②SDS緩沖液洗脫：
通過在SDS loading buffer加熱或煮沸樣品趾徽，從珠子上洗脫目的蛋白復(fù)合物续滋。此法優(yōu)點(diǎn)在于樣品濃度可以更高。
1. EP管中加入與珠子體積相等的2x SDS上樣緩沖液后孵奶，在95°C加熱3-10分鐘洗脫目的蛋白復(fù)合物吃粒。
? ? 注：缺少DTT的2x SDS上樣緩沖液洗脫可減少IgG背景。
③尿素緩沖液洗脫：
此法優(yōu)點(diǎn)在于樣品可以被蛋白水解酶消化拒课，利于質(zhì)譜分析徐勃。
1. 加入2-5被珠子體積的尿素洗脫緩沖液并在室溫下旋轉(zhuǎn)或頻繁攪拌30分鐘，然后離心取上清液早像。
④抗體的peptide洗脫：
抗體的peptide通過與目的蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體洗脫目的蛋白復(fù)合物僻肖。最常見的為Flag等標(biāo)簽的peptide。但His標(biāo)簽比較特殊卢鹦，一般用咪唑洗脫臀脏。此法優(yōu)點(diǎn)在于所得的目的蛋白復(fù)合物具有生理活性，但是洗脫效果較低冀自。
在任何一種情況下揉稚，應(yīng)仔細(xì)評(píng)估細(xì)胞裂解方法和洗滌條件，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)復(fù)合物中的蛋白分子通常通過弱相互作用保持在適當(dāng)位置熬粗。
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參考資料：
1. Abcam
