動物組織樣品

第一步：剪碎去血

將樣品放入PBS緩沖溶液中剪碎耸峭，倒掉變色的溶液桩蓉，換入新的PBS，繼續(xù)剪劳闹，一遍一遍地重復(fù)院究，直到PBS溶液不變色為止洽瞬。比如肝臟組織，洗完后整個是一個偏黃色的組織业汰。在這個過程中伙窃，我們需要用剪刀和鑷子剝離血管組織和脂肪組織等，這些組織的存在會對我們對樣品蔬胯，比如肝臟組織的蛋白質(zhì)類型產(chǎn)生干擾对供。去血的過程中同時需要加入蛋白酶抑制劑。

第二步：稱重

為了稱量更精確氛濒，洗滌之后可以用濾紙將樣品吸干产场，然后再稱重，能比較準(zhǔn)確地知道我們大約使用了多少組織樣品舞竿。

第三步：碎裂

碎裂樣品的方法在上一篇推文里有詳細(xì)的介紹京景，包括液氮研磨、勻漿等機械破碎骗奖，溫差法确徙、壓力法等物理破碎，以及加入變性劑等化學(xué)處理法执桌。通常情況下呢鄙皇，用液氮研磨就夠了，研磨到完全變成粉狀仰挣。但如果用單一的方法破碎效果不好伴逸，或者操作起來工作量太大，也可以進(jìn)行多方法的組合膘壶。比如十幾個或幾十個樣品错蝴，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的運動量估計也差不多了颓芭，累成狗顷锰！這時候可以考慮使用組織破碎儀，一次可以做八個十個的亡问，一起震碎官紫，那就輕松多了。

第四步：裂解

破碎以后州藕，加入裂解液万矾，反復(fù)震蕩，讓樣品充分溶解慎框，裂解液的用量通常是

組織重量：裂解液的體積=1：5

也就是說灼伤，1克組織氛改，通常加入5ml的裂解液。

在裂解時汤善，眼睛不要只顧著看手機或者盯著天花板發(fā)呆，要好好觀察樣品的情況，如果發(fā)現(xiàn)仍然有大塊的組織，或者很多絮狀的組織，則說明上一步碎裂的工作做得還不夠粱檀。這時可以加入超聲的方法，或者用組織勻漿器進(jìn)一步碎裂漫玄，從而保證蛋白提取比較成功茄蚯。

有哪些裂解液可選呢？

4%SDS睦优，溶解性特別強渗常，很適合對膜蛋白或疏水性蛋白的提取汗盘；

常規(guī)的8M尿素皱碘，也不弱。

Tips

如果用的是4%SDS隐孽，千萬不要用超聲進(jìn)一步碎裂癌椿！因為SDS是一種強去污劑（十二烷基磺酸鈉，我們平常用的洗衣粉里就有）菱阵，如果進(jìn)行超聲踢俄，會產(chǎn)生大量的泡沫，既達(dá)不到很好地溶解樣品的目的晴及，又引來干擾褪贵，搞得我們很難控制提取蛋白的過程。

第五步：離心

裂解并震蕩以后抗俄，4℃ 12000rpm離心半小時，然后吸取上清液世舰。

特別注意：

有些樣品脂肪比較多动雹，比如小鼠肝臟樣品，可以看到提取時上面有很大一層浮油跟压，下面還有一堆沉淀胰蝠，如果是新手，又自我要求很高震蒋，通常會想要把所有清液都吸取出來茸塞，不浪費一點樣品。這其實很難做到查剖！弄得不好钾虐，就會帶入脂肪組織和沉淀組織，給后續(xù)的實驗引入污染笋庄，造成更多的損失效扫，得不償失熬蠹唷！推薦的做法是：吸取離上層浮油及下層沉淀都有一定距離的中間部分菌仁，這樣取出來的蛋白就純凈多了浩习。

說到這里，插一句济丘，以往的經(jīng)驗谱秽，常規(guī)小鼠和人的組織樣品，提取效率大約為0.7%摹迷，也就是說疟赊，如果有100mg的組織，能提到的蛋白大概是700 μg 泪掀。做常規(guī)的質(zhì)譜分析听绳，有100-200mg的蛋白就夠了。如果樣品充足异赫，我們可以分成幾份椅挣，先提取一部分做實驗試試，整個流程走下來沒問題的話塔拳，再提一部分鼠证，這樣也比較保險，不會出現(xiàn)全軍覆沒的慘劇靠抑。余下的樣本量九，還可以做做Western驗證或者酶活啥的。

如果樣品量特別少颂碧，例如小鼠卵巢荠列，一共也就黃豆那么大，這種情況下可不能用液氮研磨载城，因為大部分樣品都會被刮到研缽的壁上肌似，損失很大！可選的方案是：將小鼠卵巢放進(jìn)試管里诉瓦，直接在管子里剪碎去血川队，加入裂解液，用組織破碎儀或者超聲破碎睬澡，也可以用4%SDS提裙潭睢（ 95℃，5分鐘）煞聪。這種情況就不要弄太多的碎裂步驟了斗躏，步驟越少，樣品的損失就越少昔脯。

動物細(xì)胞樣品

針對動物細(xì)胞樣品的處理方法有很多瑟捣，我們來看看幾種常見的套路：

A． 最簡單的方法：

把細(xì)胞從培養(yǎng)皿里取出來馋艺，先加入PBS把培養(yǎng)基洗掉，再加入裂解液迈套，通常25mm的培養(yǎng)皿加入400-700μL裂解液捐祠。然后用細(xì)胞刮直接刮取培養(yǎng)皿表面，不停地刮桑李，相當(dāng)于是一個機械力的破裂踱蛀，而細(xì)胞表面是最容易進(jìn)行破裂的。刮完后收集裂解液和細(xì)胞樣品到EP管里贵白，然后進(jìn)行冰上裂解率拒。這是最快最直接有效的方法。

Tips:

通過測試發(fā)現(xiàn)禁荒，蛋白質(zhì)的保存比組織樣品或細(xì)胞樣品的保存來得更加穩(wěn)定猬膨，所以拿到細(xì)胞后直接提取出來蛋白進(jìn)行保存更好。

B．多組細(xì)胞平行實驗處理方法：

當(dāng)需要處理多組細(xì)胞呛伴，而每組細(xì)胞培養(yǎng)的時間有間隔時勃痴，如果希望后續(xù)的分析是平行的，那么可以先分別胰酶消化以后热康，收集每組細(xì)胞沛申，液氮或者-80℃保存。等各組細(xì)胞都收集好后姐军，加入裂解液铁材，不超過200W超聲，放在冰上操作奕锌。由于不能用SDS（超聲時會引起大量的泡泡）著觉，這種情況下，常用的是8M尿素或2M硫脲惊暴。超聲一定要在冰上進(jìn)行饼丘，因為溫度特別高，很容易超過37℃缴守，循環(huán)周期的時間通常會設(shè)定為：5秒超聲，停4-5秒镇辉，再5秒超聲屡穗，反復(fù)，整個過程持續(xù)5分鐘左右忽肛。

C．反復(fù)凍融法：

這種方法用得比較少村砂，因為殘留的細(xì)胞殘片還是比較多，我們認(rèn)為提取是不充分的屹逛。

D．化學(xué)處理法：

也是非常簡單粗暴的方法础废，直接加入4%SDS汛骂，95℃水浴，1-5分鐘即可评腺。

通常情況下帘瞭，我們要求細(xì)胞量需要達(dá)到1E6的數(shù)量級。當(dāng)然蒿讥，有一些新發(fā)展出來的方法蝶念，需要的細(xì)胞量會非常少，比較南方醫(yī)科大學(xué)田瑞軍老師課題組做過1000個細(xì)胞的蛋白提取芋绸，但這些新方法對操作的要求也很高媒殉，如果你還是個新手，沒有足夠的經(jīng)驗摔敛，直接拿新方法來做廷蓉，風(fēng)險就會比較高了。

石蠟包埋樣品

對于這類樣品的處理马昙，去石蠟是比較麻煩的事情桃犬。在石蠟包埋過程中，樣品中的蛋白質(zhì)或脂肪會用福爾馬林或甲醇固定给猾，形成交聯(lián)狀的結(jié)構(gòu)疫萤，從中提取蛋白是非常困難的。難歸難敢伸，遇到了還是要迎難而上扯饶，咱們得想一些合適的辦法把蛋白有效地提取出來。通過很多次的摸索和實踐池颈，以下是比較可行的處理步驟：

第一步：去石蠟尾序，先用二甲苯室溫浸泡5分鐘，兩次躯砰，再換甲醇室溫浸泡5分鐘每币，兩次∽列看起來很簡單兰怠，但整個過程中會經(jīng)過混旋。

第二步：蛋白裂解李茫，因為蛋白被福爾馬林或甲醇固定得非常緊了揭保，有的人會選擇加入水，讓樣品泡漲魄宏，我們更推薦加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT）秸侣，充分水化被固定的蛋白樣品，然后勻漿和超聲。

第三步：水化之后味榛，加入4%SDS椭坚。對于4%SDS，通常的處理條件是95℃搏色，5分鐘善茎，但對于石蠟樣品，交聯(lián)特別厲害继榆，所以推薦95℃下處理60分鐘巾表，再冷卻到室溫。

Tips：

SDS并沒有在第二步裂解的時候就加入略吨，是因為這一步需要使用超聲集币，如果加入了會產(chǎn)生大量的泡沫。所以我們先讓樣品在一個緩沖體系里充分水化和擴(kuò)展翠忠，在第三步再加入SDS高溫孵育鞠苟，之后冷卻至室溫進(jìn)行提取。

第四步：離心秽之，參數(shù)為最大相對離心力16,000 g当娱，離心10分鐘，取上清考榨，就達(dá)到分離的目的了跨细。

石蠟包埋樣品提取的效率通常是，一平方毫米樣品可提取一微克蛋白河质，大家可以通過這個效率值對樣品中能提取的蛋白進(jìn)行估算冀惭。

植物組織樣品

對于植物組織樣品，難點就在于細(xì)胞壁及葉綠素的去除掀鹅。

第一步：充分再充分地研磨散休。由于細(xì)胞壁十分強壯，所以一定要好好地研磨乐尊，充分碎裂戚丸。一般的勻漿根本搞不定細(xì)胞壁，沒辦法碎得充分扔嵌。

第二步：去色素限府。可以通過有機溶劑多次反復(fù)沉淀樣品來去除色素痢缎，比如丙酮胁勺、TCA（三氯乙酸）、甲醇牺弄，一次一次地清洗前面研磨成粉的樣品姻几，這樣可以把葉綠素去掉。

第三步势告，離心取沉淀蛇捌，然后加入裂解液，讓蛋白充分地溶解咱台。

第四步：進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提络拌。在抽提的過程中，要看細(xì)胞的破碎程度或者樣品的類型回溺，葉片樣品相對來說比較簡單春贸，莖的樣品比較麻煩，它的纖維組織比較大遗遵，再加上植物細(xì)胞壁又比較厚萍恕，所以我們得用超聲、震蕩车要，以及各種方法組合允粤，進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提。

第五步：離心取上清翼岁，就得到了蛋白溶液类垫。

根據(jù)以往經(jīng)驗，像葉片這類的樣品琅坡，處理起來比較簡單悉患，例如水稻的葉片組織提取出來可以做到8000多個蛋白；根的樣品稍微麻煩一點榆俺，因為含水量特別多售躁，先得烘干，盡量去掉它的水份谴仙，干燥后再進(jìn)行研磨提取迂求。否則，我們可能會加入很多根晃跺，但其實能提取的樣品并沒有多少揩局。花的組織掀虎，比如桃花凌盯、梨花，也是水分太多的問題烹玉，需要先干燥驰怎。種子組織，例如花生二打，在破碎成粉后县忌，也需要多次使用有機溶劑去掉它的脂肪。

總之，根症杏、莖装获、葉、果實等厉颤，根據(jù)不同的樣品類型穴豫，我們需要根據(jù)它的特點設(shè)計不用的處理步驟，簡單來說逼友，就是通過有機試劑去掉它的色素和脂肪組織精肃，水分太多的先烘干再提取，常規(guī)情況就是研磨和去色素帜乞。大家清楚了各種處理的用處之后司抱，就可以針對自己的樣品靈活地處理了。比如棉花樣品黎烈，因為它纖維特別多状植，你可能就會想到得通過研磨和反復(fù)沉淀來進(jìn)行純化，再進(jìn)行后續(xù)分析怨喘。

細(xì)菌樣品

與植物樣品類似津畸，細(xì)菌樣品的細(xì)胞壁也是我們提取蛋白的最大障礙，尤其是像革蘭氏陽性菌必怜，以及一些細(xì)菌的亞型肉拓，細(xì)胞壁特別厚，破碎的時候需要更強的參數(shù)梳庆，更長的時間暖途。

劉曉慧老師分享了兩個她遇到的例子：有一次做細(xì)菌樣品，不巧它就是一個細(xì)胞壁特別厚的亞類膏执，最開始采用急熱驟冷驻售，即從-80℃冰箱取出，95℃煮1分鐘更米，反復(fù)幾次欺栗，然后超聲，但是提出來的蛋白量特別少征峦。最后還是用了液氮研磨的方法迟几，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白栏笆。所以类腮，對于細(xì)菌的樣品，我們可以嘗試多種方法蛉加，測試一下蚜枢。

還有一次做酵母樣品缸逃，在做超聲的時候，因為有點事情離開了厂抽，所以超聲的時間就特別長察滑，并且?guī)状纬曋g做了急熱驟冷處理。另一位同事使用同樣的方法修肠，只是超聲時間比較短。最后發(fā)現(xiàn)超聲時間長的樣品户盯，破碎地非常好嵌施，顯微鏡下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多莽鸭，而超聲時間短的提取到的蛋白就少很多吗伤。所以我們在碎裂樣品時，也可以多嘗試幾種方法硫眨，幾種參數(shù)足淆。

體液樣品

體液樣品難點在于高豐度蛋白的去除。以血清為例礁阁，前14種高豐度蛋白占血清總蛋白的95%以上巧号。而質(zhì)譜是一種離子飽和性檢測器，低豐度離子的信號很容易被高豐度的抑制姥闭，從而無法檢測到丹鸿。

我們有很多辦法去掉高豐度蛋白。當(dāng)然棚品，有些情況下靠欢，為了保證樣品的完整性，也有人不去除高豐度蛋白铜跑，這個視具體情況而定门怪。另外，高豐度蛋白可能還會與一些低豐度蛋白相結(jié)合锅纺，當(dāng)我們?nèi)サ舾哓S度蛋白時掷空，往往就會將這些有意義的低豐度蛋白也去掉，無法保證分析的完整性囤锉。針對這種情況拣帽，用普通的shotgun方法是很難解決的，后面我們會介紹一種方法嚼锄，它在高豐度蛋白存在的情況下减拭，仍然可以穩(wěn)定地可重復(fù)地鑒定到很多中低豐度的蛋白。

要去除高豐度蛋白区丑，很多商業(yè)試劑盒都可以幫到我們拧粪。它們的原理各有不同修陡，我們來看幾個比較常用的。

第一種是Bio-Rad的Proteominer試劑盒可霎。

這類試劑盒的原理是：通過一個六肽配基與高豐度蛋白結(jié)合魄鸦，從而進(jìn)行去除。這種方法是非抗體型的癣朗，沒啥特異性拾因，它不受物種限制和樣品類型限制。當(dāng)樣品進(jìn)來時旷余，六肽配基會優(yōu)先結(jié)合豐度高的蛋白質(zhì)绢记，豐度低的嘛，結(jié)合的機會小很多正卧，于是就達(dá)到了分離去除的目的蠢熄。

通過這個辦法處理后，最終能鑒定到的蛋白也是比較多的炉旷，從鑒定的數(shù)量上看签孔，與安捷倫的特異性試劑盒差不多。但如果要發(fā)高分的文章窘行，用這種方法容易受到質(zhì)疑饥追，也是因為它的特異性不強，去高豐度有一定的隨機性罐盔，高分雜志不太接受這種隨機的方法判耕。但如果你的樣品體積特別大，可以先試著用Proteominer做一次翘骂，接下來再使用一些特異性的去高豐度蛋白的方法壁熄。或者你的樣品沒有特異性抗體柱可以用的話碳竟，也可以考慮這種方法草丧。

第二種是安捷倫的MARS柱。它含有14種蛋白抗體莹桅，針對血清中的高豐度蛋白能很有針對性地去除昌执，需要的樣品量通常為20μL-40μL，20μL的血清樣品可以得到約100微克的蛋白樣品诈泼，40μL的量足夠我們做一次iTRAQ或label free實驗了懂拾。

第三種試劑盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的試劑盒，可以去兩個高豐度蛋白☆泶铮現(xiàn)在出了一個去20個高豐度蛋白的試劑盒岖赋，這是基于抗體方法，針對性很強瓮孙，是比較公認(rèn)的方法唐断。

第四種是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns选脊，2015年MCP上發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，里面用到這個試劑盒脸甘，先是用特異性柱子去掉14個高豐度蛋白恳啥，然后再特異性去掉50個中豐度的蛋白，最后可以鑒定到5300多個血清蛋白質(zhì)丹诀。對比現(xiàn)在常規(guī)的方法钝的，通常只能鑒定到500-600個血清蛋白，如果高豐度蛋白去除得比較好铆遭，用QE的方法做硝桩，也只能鑒定到1000個左右蛋白。這篇文章鑒定出了5300個蛋白質(zhì)疚脐，在血清樣品的蛋白鑒定中確實是一個相當(dāng)outstanding的結(jié)果了。

以上是四種比較常用的去高豐度的試用盒邢疙」髋總的來說，針對像尿液這類體積很大的樣品疟游，可以用Proteominer的方法呼畸，因為其余的基于抗體的方法都對蛋白含量有所要求。去掉高豐度蛋白后颁虐，我們可以對尿液先進(jìn)行濃縮蛮原，使它的濃度達(dá)到50μg/μL或更高，再進(jìn)行后續(xù)的蛋白提取另绩，效果會更好儒陨。另外，尿液樣品也可以通過沉淀的方法對蛋白進(jìn)行提取笋籽。

另外蹦漠，像腦脊液樣品，也可以通過Proteominer方法進(jìn)行提取车海，它的蛋白含量也比較低笛园。劉曉慧老師組嘗試過用安捷倫的特異性去除14個高豐度蛋白的試劑盒與Proteominer的隨機去除6個高豐度蛋白試劑盒進(jìn)行比較，最后能檢測到的蛋白結(jié)果都差不多侍芝。

亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取

針對亞細(xì)胞器的提取研铆，我們分幾步來完成：

第一步：對組織或細(xì)胞進(jìn)行勻漿，不需要勻得非常碎州叠，通常勻個10-20下就可以了棵红；

第二步：初步分離，使用差速離心的方法咧栗，具體說明見上圖窄赋。

第三步：用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行再分離哟冬。蔗糖密度梯度是連續(xù)的，那么相應(yīng)的亞細(xì)胞器會在等密度的蔗糖密度區(qū)間內(nèi)沉積忆绰。于是浩峡，可以將溶酶體、線粒體错敢，以及其它微體分開翰灾。然后取出對應(yīng)的細(xì)胞器，再進(jìn)行裂解和提取稚茅。

Tips:

蔗糖密度梯度離心需要使用超速離心機纸淮，平衡及各方面控制都需要比較精準(zhǔn)，所以操作時特別需要小心亚享。

第四步：對亞細(xì)胞器進(jìn)行驗證咽块。這一步需要引入Western，比如用到一些線粒體特異的抗體欺税，或者細(xì)胞膜侈沪、細(xì)胞核特異的抗體，進(jìn)行樣品純度的確證晚凿，之后再進(jìn)行后續(xù)的實驗亭罪。否則，如果樣品中有污染歼秽，會給后續(xù)的實驗帶來很難解釋的問題应役。