原文地址：http://x2yline.gitee.io/microarray_data_analysis_note/notes/8%20Normalization%20and%20Affymetrix/8%20Normalization%20and%20Affymetrix.html

1. 什么是標(biāo)準(zhǔn)化

廣義：為了使不同芯片的數(shù)據(jù)具有可比性

狹義：使芯片的均值（中位數(shù)）相等

系統(tǒng)誤差來源

提取的RNA總量不同

RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄汗捡，熒光標(biāo)記淑际，PCR擴增等各個環(huán)節(jié)的效率

DNA的質(zhì)量

變異會掩蓋真正有差異的基因

2. 標(biāo)準(zhǔn)化方法

方法1：管家基因法

選擇一組認為表達量不會變化的基因，并根據(jù)這幾個基因?qū)π酒M行校正

缺點：不知道哪些是表達量不變的基因扇住，不能保證這些基因在處理過程或癌變過程中表達不發(fā)生變化

關(guān)于管家基因的定義：通常認為對細胞的生命功能具有重要作用春缕，表達恒定并且通常表達量比較高的基因；另一個不同的定義是不同情況下該基因的表達在不同芯片中的rank相同艘蹋，選出這些基因并以他們?yōu)閰⒖歼M行標(biāo)準(zhǔn)化锄贼。

方法2：spike-ins外加合成序列法

引入一些能控制相對密度的標(biāo)志序列及探針，并使用這些探針對剩余的探針進行標(biāo)準(zhǔn)化

缺點：不知道如何控制標(biāo)志序列與樣品的相對量

方法3：簡單縮放進行標(biāo)準(zhǔn)化

通過乘以一個標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)女阀，從而使不同芯片的數(shù)據(jù)的分布及均值大致相同宅荤，，從而使其具有可比性

缺點：不能保證MA plot為一條水平直線（可能有彎曲）浸策，如何確定標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)（是使用RNA總信號強度冯键，中位數(shù)還是其他的值？）

其他方法

同時使用spike-ins和簡單縮放進行標(biāo)準(zhǔn)化的榛，spike-ins包括很多不同強度的值琼了，并用它們來檢驗縮放后的值是否可信

基線

當(dāng)我談?wù)撟儺悤r，通常是以某個芯片作為基線即參考的，dChip算法是以表達值處于中位數(shù)的某個芯片為參考的

使用一組表達量不變的探針雕薪，并在不同信號強度區(qū)域使用不同的scale factor進行校正昧诱，該校正通是在兩個芯片之間進行的，該方法與在MA plot中擬和一條光滑曲線所袁，把M值與該曲線相減得到校正數(shù)據(jù)的方法相同盏档。

前提條件

通過縮放使90%的基因表達量具有可比性是否在當(dāng)兩個樣本的基因表達模式有很大差異時合理

縮放即百分位數(shù)法對芯片數(shù)據(jù)進行校正的前提條件是大多數(shù)基因的表達是沒有發(fā)生變化的，百分位數(shù)法對該假設(shè)的依賴性比縮放法更強燥爷，當(dāng)這個假設(shè)不成立時蜈亩，使用上述方法進行標(biāo)準(zhǔn)化是沒有意義的

大多數(shù)基因表達量不發(fā)生變化的情況有：

• 飽食/饑餓實驗
• 熱休克實驗
• 對比不同器官（？前翎？稚配？）

3. 如何評價不同的標(biāo)準(zhǔn)化方法

接下來的內(nèi)容基本上來自于Bolstad, Irizarry, Astrand 和 Speed（bekerley的文章 Bioinformatics, 2003, p.185-193

對于在生物學(xué)上認為表達相同的基因，在經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)后之后表達應(yīng)該是基本相等的

3.1 測試標(biāo)準(zhǔn)化方法的數(shù)據(jù)集

Affymetrix 拉丁方設(shè)計實驗數(shù)據(jù)

The Affymetrix Latin Square Experiment (Hu95Av2, repeated on Hu133A)港华，該數(shù)據(jù)集是合成的已知濃度序列道川，并按照拉丁方實驗設(shè)計進行芯片實驗。

其中U95Av2芯片共有14組合成的序列立宜，每組序列的濃度分別為： 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, and 1024 pM冒萄，至少重復(fù)三次后，每組合成序列的對應(yīng)濃度向前移位橙数，如第二個實驗中每組序列的濃度從 0.25 pM 開始并以 0 pM結(jié)尾尊流，共59個芯片。每組合成序列大多都是只含有一種序列灯帮，但組1含有2種序列崖技，組12是空白組。

Hu 133A芯片共42個芯片钟哥，有14組實驗响疚，每組實驗重復(fù)3次，共42個合成序列這些序列濃度范圍為0.125 pM 到 512 pM瞪醋，與U95 數(shù)據(jù)不同忿晕，該數(shù)據(jù)集包含更多合成序列，從更小的濃度開始银受，掃描儀器為GeneChip? Scanner 3000践盼，更少探針與序列交叉雜交的情況。

Gene Logic Dilution Data

75個Hu95Av2芯片宾巍，兩個組織來源：肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)咕幻，其中包括；

• 每種組織各自30個芯片
  • 5種不同濃度顶霞，每個濃度重復(fù)6次
• 剩下的15個芯片是兩種組織的混合樣本
  • 3中不同比例的樣品（27:75, 50:50, 75:25）锣吼，各自重復(fù)5次

4個·肝臟組織的芯片數(shù)據(jù)在Bioconductor的包affydata的內(nèi)置數(shù)據(jù)Dilution中

library(affydata)
data("Dilution")

pData(Dilution)
##     liver sn19 scanner
## 20A    20    0       1
## 20B    20    0       2
## 10A    10    0       1
## 10B    10    0       2

varMetadata(phenoData(Dilution))
##                                                               labelDescription
## liver                    amount of liver RNA hybridized to array in micrograms
## sn19    amount of central nervous system RNA hybridized to array in micrograms
## scanner                                              ID number of scanner used

A Gene Logic Spike In Dataset

98個 Hu95Av1芯片玄叠，共11 cRNA個合成序列拓提，其中26個芯片所有合成序列濃度相同，但不同芯片的濃度不同（芯片1濃度都為0代态，芯片2濃度都為0.5， 芯片3濃度都為0.75）西雀，剩下的芯片組成兩個拉丁方設(shè)計，每個水平3個重復(fù)判莉。

我們需要用到的數(shù)據(jù)是Dulition使用的5個肝臟樣本的數(shù)據(jù)（所有樣本都在同一個稀釋水平）

26個Gene Logic Spike In數(shù)據(jù)集的芯片，單個芯片上所有合成序列濃度相同

為什么Gene Logic公司做該實驗并提供數(shù)據(jù)锰镀，因為Gene Logic是最大的Affy芯片消費者之一，他們收集了非常多表達譜數(shù)據(jù)并進行銷售花鹅；他們想提高數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量并為他們自己的方法打廣告，該數(shù)據(jù)可以在官網(wǎng)申請真友。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)化驗證

標(biāo)準(zhǔn)化的方法共有：

library(affydata)
normalize.AffyBatch.methods()
## [1] "constant"         "contrasts"        "invariantset"     "loess"           
## [5] "methods"          "qspline"          "quantiles"        "quantiles.robust"

3.2.1 基線方法

• 選擇一個芯片作為基線（中位數(shù)）對所有芯片進行縮放（affy的算法是在匯總定量后使用該方法，但是這里我們使用探針?biāo)降臄?shù)據(jù)進行縮放）
• Nonlinear invariant rank方法進行標(biāo)準(zhǔn)化愈案，同樣選擇一個芯片作為基線

3.2.2 Complete Data方法（不需要選擇基線）

• Cyclic Loess（循環(huán)loess擬合）
• Contrasts
• Quantiles（分位數(shù)法）

Cyclic Loess方法

$$
M_{k} = log{2}(x{ki}/x{kj})
$$

i潦嘶，j代表芯片編號崇众，若$\hat{M_{k}}$為擬合的曲線锰蓬，校正后的M值應(yīng)該是
$$
M_{k}'=M_{k}-\hat{M_{k}}
$$
那么我們?nèi)绾蝸硇Ｕ總€芯片的值呢？該方法使用對稱校正的方法
$$
x'{ki} = 2^{A{k}+0.5\bullet M'_{k}}
$$

$$
x'{ki} = 2^{A{k}-0.5\bullet M'_{k}}
$$

對所有芯片都進行校正舱卡，通常需要重復(fù)2~3次轮锥，但是該方法運行速度較慢（n個芯片計算的時間復(fù)雜度至少是O(n^2)）

Contrast Based Normalization

詳細算法可見該文章：Contrast Normalization of Oligonucleotide Arrays

• 最開始的輸入是一個n*k的矩陣，n代表features數(shù)，k代表芯片編號饲握，該矩陣已經(jīng)經(jīng)過log2轉(zhuǎn)化
• 乘以正交對比矩陣（線性代數(shù)的知識）后互拾，轉(zhuǎn)化后的第一列是所有芯片表達矩陣的均值（相當(dāng)MA plot相對于x-y plot的旋轉(zhuǎn)使曲線水平化）
• 再對除第一列以外的其他列進行曲線擬合，并校正除第一列以外的其他列（使均值為0）田篇，再進行矩陣逆運算得到校正后的表達矩陣

點評：該算法最主要的思想是對log密度值根據(jù)均值進行縮放（幾何均值）

比Cyclic Loess方法快泊柬，但計算速度仍較慢

Quantile分位數(shù)法

該方法的前提假設(shè)為每個芯片的表達數(shù)據(jù)分布都是完全相同的

• n個芯片p個探針組成一個p * n的矩陣X
• 對矩陣X的每一列分別進行排序冷守，使每一行的表達量值在相應(yīng)每一列的分位數(shù)都相同
• 計算每一行的均值亮钦，并替代原值，使得該矩陣同一行的數(shù)據(jù)完全相同
• 把每一列的數(shù)據(jù)位置還原，形成校正后的表達矩陣

該方法值涉及排序和做均值蚁滋，計算速度極快

為什么選擇均值作為新的表達量值澄阳？

當(dāng)我們以兩個芯片的表達量值分別作為x和y軸即做y-x plot時低剔，如果兩個樣本所有基因的分位數(shù)都相同，則形成一條完美的對角直線（y=x）

實際上，我們做的y-x plot越靠近y=x說明標(biāo)準(zhǔn)化效果越好开皿，而需要對n個芯片兩兩作圖笋妥，這提示使用均值作為新的表達量值

使用均值作為新的表達量春宣，我們不需要考慮縮放的問題，并且結(jié)果顯示對于對數(shù)化的數(shù)據(jù)和原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化效果都比較好，但是二者計算出來的新表達量值不同

我們更傾向于使用中位數(shù)而不是均值潦蝇，是否進行對數(shù)轉(zhuǎn)化不影響最終的標(biāo)準(zhǔn)化的值，雖然取均值和中位數(shù)時大部分差異并不的

3.2.3 選擇不同基線的影響

不同基線的選擇最后得出的表達值差異可能非常大

3.2.4 如何定義標(biāo)準(zhǔn)化是否成功

我們想要的結(jié)果是各個芯片數(shù)據(jù)的分布大致相同则酝，從而具有可比性，評價標(biāo)準(zhǔn)化是否成功最常用的就是MA plot

為了使之前的預(yù)處理相同爽雄，所有芯片的預(yù)處理均使用同一種方法挚瘟，如RMA方法處理背景信號

文章的一些結(jié)果

• 通常MA plot在標(biāo)準(zhǔn)化之前的直線有一定的曲率，這提示標(biāo)準(zhǔn)化過程需用曲線進行擬合订框，否則不使用非線性方法進行標(biāo)準(zhǔn)化
• 所有結(jié)果均顯示標(biāo)準(zhǔn)化之后的原始數(shù)據(jù)顯示出更小的變異性
• 使用complete data方法比baseline chip方法結(jié)果更好藤违，對于simple constant scaling比非線性方法如invariant rank set更好
• 三種complete data方法中，結(jié)果相差不大璧榄，quantile方法結(jié)果稍微更好，并且因為quantile方法的速度明顯比其他的快，因此他們推薦使用quantile方法

4. 如何進行標(biāo)準(zhǔn)化

首選要確認是否大部分基因的表達量沒有發(fā)生很大的改變

接著我們可以檢驗一下MA plot是否是水平的妒潭，如果是水平的我們就不需要使用quantiles方法進行標(biāo)準(zhǔn)化

如果MA plot不是水平的，我們再檢驗一下芯片的質(zhì)量（圖片）是否有人為的異常，如果沒有異常則可以使用quantiles方法處理

4.1 一次Bioconductor的冒險

我們的目標(biāo)：重復(fù)文獻Bolstad et al. (2003)的研究，使用Bioconductor提供的數(shù)據(jù)

首選載入數(shù)據(jù)和函數(shù)

library(affy)
library(affydata)
data(Dilution)

以一個AffyBatch對象即Dilution數(shù)據(jù)開始（把CEL文件讀入創(chuàng)建的數(shù)據(jù)）阱持，我們想測試不同標(biāo)準(zhǔn)化方法的效率及準(zhǔn)確性

預(yù)測處理步驟包括：

• Background correction
• Normalization
• PM correction
• Summary Quantification

4.2 是否需要標(biāo)準(zhǔn)化

# shows log intensities!
boxplot(Dilution, col=rainbow(4))

dev.copy(png,file="boxplot1.png")
dev.off()

分布密度圖

hist(Dilution,lty=1,col=rainbow(4),lwd=3, main="intensity distribution")

dev.copy(png,file="hist1.png", res=108)
dev.off()

[]http://x2yline.gitee.io/microarray_data_analysis_note/notes/8%20Normalization%20and%20Affymetrix/assets/hist1.png)

MA plot（有參考基線）

par(mfrow=c(2,2))
MAplot(Dilution)
par(mfrow=c(1,1))

dev.copy(png,file="MAplot1.png", res=72)
dev.off()

MA plot（相互比較）

mva.pairs(Dilution)
## Error in log(new("AffyBatch", cdfName = "HG_U95Av2", nrow = 640L, ncol = 640L,  :  unused argument (2)

help(mva.pairs)
# a matrix containing the chip data in the columns.

提取AffyBatch對象為矩陣之后才能使用mva.pairs函數(shù)，如果記不住證明提取數(shù)據(jù)矩陣滓窍，可以查看AffyBatch的slot

slotNames(Dilution)
##  [1] "cdfName"           "nrow"              "ncol"              "assayData"        
##  [5] "phenoData"         "featureData"       "experimentData"    "annotation"       
##  [9] "protocolData"      ".__classVersion__"

Dilution@cdfName
## [1] "HG_U95Av2"

Dilution@nrow
## [1] 640

Dilution@ncol
## [1] 640

Dilution@phenoData
## An object of class 'AnnotatedDataFrame'
##   sampleNames: 20A 20B 10A 10B
##   varLabels: liver sn19 scanner
##   varMetadata: labelDescription

Dilution@experimentData
## Experiment data
##   Experimenter name: Gene Logic 
##   Laboratory: Gene Logic 
##   Contact information: 708 Quince Orchard Road
## Gaithersburg, MD 20878
## Telephone: 1.301.987.1700
## Toll Free: 1.800.GENELOGIC (US and Canada)
## Facsimile: 1.301.987.1701
##  
##   Title: Small part of dilution study 
##   URL: http://qolotus02.genelogic.com/datasets.nsf/ 
##   PMIDs:  
## 
##   Abstract: A 68 word abstract is available. Use 'abstract' method.
##   notes:
##    :     
## 

Dilution@annotation
## [1] "hgu95av2"

Dilution@.__classVersion__
##         R   Biobase      eSet AffyBatch 
##  "2.10.0"   "2.5.5"   "1.3.0"   "1.2.0"

而其中的assayData和phenoData可以用了提取數(shù)據(jù)矩陣和樣本信息

Dilution@assayData
## $exprs
##            20A     20B     10A     10B
## 1        149.0   112.0   129.0    60.0
## 2       1153.5   575.3  1262.3   564.8
## ...
## 250      118.0    93.0   117.8    69.0
##  [ reached getOption("max.print") -- omitted 409350 rows ]

class(Dilution@assayData)
## [1] "list"

length(Dilution@assayData)
## [1] 1

names(Dilution@assayData)
## [1] "exprs"

class(Dilution@assayData[[1]])
## [1] "matrix"

dim(Dilution@assayData[[1]])
## [1] 409600      4

樣本信息可以用以下命令

Dilution@phenoData
## An object of class 'AnnotatedDataFrame'
##   sampleNames: 20A 20B 10A 10B
##   varLabels: liver sn19 scanner
##   varMetadata: labelDescription

class(Dilution@phenoData)
## [1] "AnnotatedDataFrame"
## attr(,"package")
## [1] "Biobase"

slotNames(Dilution@phenoData)
## [1] "varMetadata"       "data"              "dimLabels"         ".__classVersion__"

Dilution@phenoData@data
##     liver sn19 scanner
## 20A    20    0       1
## 20B    20    0       2
## 10A    10    0       1
## 10B    10    0       2

Dilution@phenoData@varMetadata
##                                                               labelDescription
## liver                    amount of liver RNA hybridized to array in micrograms
## sn19    amount of central nervous system RNA hybridized to array in micrograms
## scanner 

我們也可以使用exprs提取AffyBatch對象中的數(shù)據(jù)矩陣

length(exprs(Dilution))
## [1] 1638400

dim(exprs(Dilution))
## [1] 409600      4

mva.pairs(exprs(Dilution))
dev.copy(png,file="MAplot2.png", res=72)
dev.off()

image(Dilution[,1],transfo=log2)

放大可以看到芯片頂部有特殊標(biāo)記（說明芯片沒有放反）

par(mfrow=c(1,2))
image(matrix(exprs(Dilution[,1]),
             nrow=nrow(Dilution),
             ncol=ncol(Dilution)),
      main="raw intensity")

image(log2(matrix(exprs(Dilution[,1]),
             nrow=nrow(Dilution),
             ncol=ncol(Dilution))),
      main="log intensity")

par(mfrow=c(1,1))

可以看出MA plot的線并不是非常水平，并且圖像沒有明顯認為誤差，可以使用quantiles進步標(biāo)準(zhǔn)化

4.3 背景校正

4.3.1 使用RMA校正背景

Dilution.bg <- bg.correct.rma(Dilution)

par(mfrow=c(1, 2))
hist(Dilution, lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
     main="raw data")
hist(Dilution.bg, lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
     main="background corrected")

## hist對AffyBatch對象默認進行l(wèi)og2處理植兰，并繪制PM的密度分布
## 下面的代碼與上面的代碼等價
plotDensity(log2(pm(Dilution)),
            lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
            main="raw data")
plotDensity(log2(pm(Dilution.bg)),
            lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
            main="background corrected")

log2處理后的分布如下圖

plotDensity(log2(exprs(Dilution)),
            lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
            main="raw data")
plotDensity(log2(exprs(Dilution.bg)),
            lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
            main="background corrected")

4.3.2 使用MAS校正背景

par(mfrow=c(1, 2))
Dilution.bg.rma <- bg.correct.rma(Dilution)
hist(Dilution.bg.rma, lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
     main="RMA background corrected")

Dilution.bg.mas <- bg.correct.mas(Dilution)
hist(Dilution.bg.mas, lty=1, col=rainbow(4), lwd=3,
     main="MAS background corrected")

par(mfrow=c(1, 1))

[圖片上傳失敗...(image-57c667-1525937569283)]

這說明不同的背景校正方法有比較大的差異筒繁，比較不同的標(biāo)準(zhǔn)化方法時膝晾，應(yīng)在相同背景校正方法的情況下進行比較

4.4 標(biāo)準(zhǔn)化

標(biāo)準(zhǔn)化的方法有：

normalize.AffyBatch.constant
normalize.AffyBatch.contrasts
normalize.AffyBatch.invariantset
normalize.AffyBatch.quantiles

首選不進行標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果：

eset0 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method="rma",
                  normalize=FALSE,
                  pmcorrect.method="pmonly",
                  summary.method="medianpolish")

eset0是一個ExpressionSet對象禀忆，用exprs提取的矩陣維度變小了箩退，有原來的features(probes)變成了probesets

slotNames(eset0)
## [1] "experimentData"    "assayData"         "phenoData"         "featureData"   
## [5] "annotation"        "protocolData"      ".__classVersion__"

rownames(eset0@featureData@data)[10]
## [1] "1008_f_at"

eset0@assayData
## <environment: 0x286adb60>

ls(eset0@assayData)
## [1] "exprs"    "se.exprs"

dim(get("exprs", eset0@assayData))
## [1] 12625     4

R中的環(huán)境：可以把R中的“pass by value”模式轉(zhuǎn)化為“pass by reference”模式

myEnv <- new("environment")
frogs <- rnorm(5)
assign("frogs",frogs,envir=myEnv)
ls(myEnv)
## [1] "frogs"

得到未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)每個probset的均值和方差

dim(exprs(eset0))
## [1] 12625 4

eset0.mu <- apply(exprs(eset0),1,"mean")
eset0.var <- apply(exprs(eset0),1,"var")

尋找middle behavior芯片

apply(exprs(Dilution), 2, "median")
## 20A 20B 10A 10B 
## 188 127 149  94

constant方法與未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的樣本間差異比較

第三個為參考基線，用constant方法進行標(biāo)準(zhǔn)化

eset1 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method = "rma",
                  normalize.method = "constant",
                  normalize.param = list(refindex=3),
                  pmcorrect.method = "pmonly",
                  summary.method = "medianpolish")

eset1.mu <- apply(exprs(eset1),1,"mean")
eset1.var <- apply(exprs(eset1),1,"var")

MA plot對不同方法進行比較

A1 <- (eset0.mu + eset1.mu)/2

## M1是兩種方法對探針均值的影響比較，不能描述哪種方法比較好
M1 <- (eset0.mu - eset1.mu)/2

## M2是兩種方法對探針方差的影響比較娄涩，通常越好的方法越能減少樣本之間的差異
M2 <- (eset0.var / eset1.var)
M3 <- log2(eset0.var / eset1.var)

d0 <- 0.0001;
M4 <- log2((eset0.var + d0)/(eset1.var + d0))

plot(A1, M4, 
     xlab="(eset0.mu + eset1.mu)/2",
     ylab="log2((eset0.var + 1e-04)/(eset1.var + 1e-04))",
     main="Dilution: none against scaling")
# 大部分點都大于0扬虚，說明constant縮放標(biāo)準(zhǔn)化減少了方差

quantiles標(biāo)準(zhǔn)化方法與constant方法對樣本間差異性的影響比較

eset2 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method="rma",
                  normalize.method="quantiles",
                  pmcorrect.method="pmonly",
                  summary.method="medianpolish")
eset2.mu <- apply(exprs(eset2),1,"mean")
eset2.var <- apply(exprs(eset2),1,"var")

plot((eset1.mu+eset2.mu)/2,
     log2((eset1.var + 1e-04)/(eset2.var + 1e-04)),
     main="Dilution: scaling against quantiles")
# 大部分點都大于0咽斧，均值為0.98晋柱，說明quantiles方法比constant方法更能縮小樣本間的差異

改變背景校正方法為mas

以上我們比較的是不同標(biāo)準(zhǔn)化方法對樣本之間的差異性的影響拧额，通常該差異性也受不同背景校正方法和匯總法的影響侥锦，在上述比較中快毛，我們使用的是rma進行背景校正，匯總方法是median polish方法襟衰，接下來我們使用mas進行背景校正，median polish進行匯總苔悦，得到的比較結(jié)果如下

eset0 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method="mas",
                  normalize=FALSE,
                  pmcorrect.method="pmonly",
                  summary.method="medianpolish")

eset0.mu <- apply(exprs(eset0),1,"mean")
eset0.var <- apply(exprs(eset0),1,"var")

eset1 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method = "mas",
                  normalize.method = "constant",
                  normalize.param = list(refindex=3),
                  pmcorrect.method = "pmonly",
                  summary.method = "medianpolish")

eset1.mu <- apply(exprs(eset1),1,"mean")
eset1.var <- apply(exprs(eset1),1,"var")

eset2 <- expresso(Dilution,
                  bgcorrect.method="mas",
                  normalize.method="quantiles",
                  pmcorrect.method="pmonly",
                  summary.method="medianpolish")
eset2.mu <- apply(exprs(eset2),1,"mean")
eset2.var <- apply(exprs(eset2),1,"var")

plot((eset1.mu+eset0.mu)/2,
     log2((eset0.var + 1e-04)/(eset1.var + 1e-04)),
     main="Dilution: none against constant")
# 大部分點都大于0邑退，說明constant縮放標(biāo)準(zhǔn)化減少了方差

plot((eset1.mu+eset2.mu)/2,
     log2((eset1.var + 1e-04)/(eset2.var + 1e-04)),
     main="Dilution: scaling against quantiles")
# 大部分點都大于0蜈七，均值為0.265，說明quantiles方法比constant方法更能縮小樣本間的差異

Bioconductor還有一個R包affycomp能很方便對不同方法進行比較