1. Author
Michael C. Lawrence團(tuán)隊(duì)研究胰島素和胰島素樣生長因子如何向細(xì)胞發(fā)出信號(hào)罐寨。胰島素是控制血液中糖攝取及代謝的主要激素星著。胰島素樣生長因子參與人體正常生長见剩。胰島素和胰島素樣生長因子的異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病墩剖，例如1型和2型糖尿病/癌癥和阿爾茨海默病减宣。Michael C. Lawrence試圖尋找和開發(fā)治療這些疾病的新療法萝招。
2. Background
副粘病毒科是負(fù)鏈 RNA 病毒家族反症，包括許多重要的人畜共患病原體辛块。 人類副流感病毒屬于副粘病毒亞科，包括 I 型和 III 型（呼吸道病毒屬）以及 II 型和 IV 型（風(fēng)疹病毒屬）铅碍。 副流感病毒具有兩種表面糖蛋白润绵； 即血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和融合蛋白（F）。? HN具有三種功能：(i) 受體結(jié)合（血凝素）活性胞谈；?(ii)受體破壞（神經(jīng)氨酸酶）活性尘盼，從糖綴合物中釋放末端唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸，Neu5Ac）殘基烦绳；? (iii)融合激活F蛋白卿捎。 相比之下，在流感病毒上径密，血凝素負(fù)責(zé)受體結(jié)合和膜融合午阵，而神經(jīng)氨酸酶活性則在單獨(dú)的蛋白亞基上。
3. Methods
1. PIV3 HN蛋白的純化表達(dá)
2. 神經(jīng)氨酸酶活性測定
3. PIV3 HN結(jié)晶
4. X-射線晶體衍射
神經(jīng)氨酸酶活性測定
將甲基傘形酮 N-乙酰神經(jīng)氨酸（MUNANA）以 0.2 mM 的濃度添加到 10 mM CaCl2 中100 mM 乙酸鈉 (pH 4.5) 的樣品中并在37±8°C 下孵育享扔。 兩小時(shí)后用 200 mM 碳酸鈉 (pH 9.5) 終止反應(yīng)底桂。 使用熒光計(jì)在 365 nm 激發(fā)波長和 450 nm 發(fā)射波長下對 MUNANA 的水解速率進(jìn)行定量。
4. Results
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)分離純化得到了HPIV3的HN結(jié)構(gòu)域惧眠，通過序列分析發(fā)現(xiàn)：相比于NDV的HN結(jié)構(gòu)域籽懦，PIV3的β3L23 環(huán)要短一些；PIV3 HN 缺乏 NDV HN 中觀察到的a 螺旋氛魁；PIV3 HN 含有七個(gè)二硫鍵暮顺。
在比較兩種不同晶型的無配體活性位點(diǎn)的構(gòu)象時(shí)發(fā)現(xiàn)：兩種晶型之間最顯著的差異在于 Y6 的側(cè)鏈方向，Y6 是一種關(guān)鍵的催化殘基呆盖，在迄今為止研究的所有神經(jīng)氨酸酶中都嚴(yán)格保守拖云。E4，在六邊形結(jié)構(gòu)和典型流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)中與 Y6 形成氫鍵应又，在兩種結(jié)構(gòu)中具有非常相似的構(gòu)象宙项。
在研究HN與Neu5Ac時(shí)發(fā)現(xiàn)：盡管所有三個(gè)精氨酰殘基都向羧酸根延伸，但只有 R1 和 R5 與其形成氫鍵 (,3.5 A°)株扛。 在 PIV3 HN 中尤筐，b-Neu5Ac 的糖苷羥基氧原子與 Y6 的羥基氧原子 (2.3 A°) 之間觀察到非常短的接觸。
Zanamivir結(jié)合的位置與 Neu5Ac2en 的位置非常接近地重疊洞就。?R1再次發(fā)生位移盆繁，但方向與 Neu5Ac2en 中看到的方向相反。? Y6與 4-胍基部分形成氫鍵旬蟋，并稍微遠(yuǎn)離引入的配體油昂。?T193還與Zanamivir的 4-胍基取代基形成氫鍵。 與 Neu5Ac 和 Neu5Ac2en 復(fù)合物一樣，在結(jié)合扎那米韋的活性位點(diǎn)之外沒有顯著的結(jié)構(gòu)變化冕碟。
5. Discussion
作者： Michael C. Lawrence
通訊作者：Michael C. Lawrence
單位：CSIRO Health Sciences and Nutrition拦惋，University
of Melbourne
年份：2003.11
期刊：JEM（Journal of Experimental Medicine）
科學(xué)問題 ：PIV3的HN結(jié)構(gòu)域是如何與底物結(jié)合發(fā)揮功能的
結(jié)論：這篇文章報(bào)道了pH 7.5（高鹽，六方晶系）和pH 6.5（低鹽安寺，斜方晶系）下的兩個(gè)非復(fù)合結(jié)構(gòu)和pH 7.5下的三個(gè)配體結(jié)構(gòu)厕妖，具有相似的二聚體締合。有人提出NDV HN 的“松散”二聚體（pH 4.6）代表蛋白質(zhì)的受體結(jié)合狀態(tài)挑庶，“緊密”二聚體（pH 6.5）代表催化狀態(tài)言秸。六方晶型和斜方晶型的 PIV3 HN 二聚體結(jié)構(gòu)存在微小差異。結(jié)合受體后 HN 結(jié)構(gòu)的變化被作為 HN控制融合蛋白的機(jī)制迎捺。有趣的是举畸，HN 與受體（α-連接唾液酸）的復(fù)合物尚未被捕獲。只有唾液酸的 b-端基異構(gòu)體破加，在 HN 活性位點(diǎn)中成像俱恶。 因此，尚不能排除 HN 與真實(shí)受體相互作用觸發(fā)二聚體重排的可能性范舀。
總之合是，人副流感病毒 III 型 HN 的神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)顯示出流感病毒神經(jīng)氨酸酶中沒有結(jié)構(gòu)變異性。Y6 和 R1 中的構(gòu)象變異很明顯锭环，這兩個(gè)殘基與酶活性有關(guān)聪全。酶活性可能通過消除Y6/R1周圍的作用喪失，這種構(gòu)象異構(gòu)體的形成可以產(chǎn)生受體結(jié)合位點(diǎn)辅辩。
