2020年5月，gnomAD數(shù)據(jù)庫在Nature及其子刊上發(fā)了一個(gè)特刊肝箱，共7篇文章（不算評(píng)論和新聞）
特刊鏈接：https://www.nature.com/immersive/d42859-020-00002-x/index.html
????gnomAD的前身是Exome Aggregation Consortium (ExAC)机久，經(jīng)過這么幾年的積累叫挟，數(shù)據(jù)量已經(jīng)提升到了15,708人的全基因組測(cè)序（WGS）和125,748人的全外顯子組測(cè)序（WES）双炕，觀察到的小型遺傳變異(單核苷酸變異SNV和短插入/缺失變異Indel)也從7.4 million上升到了241 million踱蠢。
（我自己是很想全部看完并做好筆記分享出來的袖肥，但是精讀起來還是需要些時(shí)間精力的咪辱，所以借組會(huì)分享文獻(xiàn)的機(jī)會(huì)，先從最主要的這篇文章開始看起吧~以下根據(jù)自己的理解進(jìn)行了梳理椎组，有偏差和錯(cuò)誤的地方歡迎批評(píng)指正油狂！本文圖片來自文章、或自己制作、或網(wǎng)絡(luò)來源見水幼辍）
Flagship paper -- 《The mutational constraint spectrum quantified from variation in 141,456 humans》Nature
標(biāo)題直譯：從141,456人的突變中量化得到的突變約束譜
一弱贼、背景及概念整理
1、什么是LoF突變磷蛹？
LoF = loss-of-function 功能喪失吮旅，本文和以往的認(rèn)知主要將以下3種突變認(rèn)為成是LoF：
① Stop-gained：在外顯子區(qū)域內(nèi)引入提前的終止子（nonsense，無義突變的一種）
②?Frameshift：移碼突變味咳，使得轉(zhuǎn)錄閱讀框產(chǎn)生移位的突變庇勃，從而使得后續(xù)轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物產(chǎn)生大規(guī)模變化，一般是由微小的indel引起槽驶。
③?Splice：剪接突變责嚷，蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本中的每個(gè)外顯子的左右有兩個(gè)關(guān)鍵的剪接位點(diǎn)，該位置的核苷酸發(fā)生改變捺檬，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的剪接再层。（正常剪接見下圖）
2、為什么要關(guān)注LoF突變堡纬？
????一般我們想要了解一個(gè)基因的功能聂受，會(huì)將破壞性突變引入基因，或者對(duì)該基因進(jìn)行敲除烤镐，繼而觀察和測(cè)量突變后的模式生物或人類細(xì)胞系蛋济，分析突變對(duì)細(xì)胞或生物的生理表型存在怎樣的影響。因?yàn)榭蒲袀惱砗图夹g(shù)限制炮叶，我們不能直接對(duì)人類進(jìn)行功能缺失突變的實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模研究碗旅，即不能隨意在人類中進(jìn)行基因編輯。
? ? 所以镜悉，LoF突變作為天然存在于人類中的破壞性突變祟辟，通過對(duì)大規(guī)模的LoF突變及人類表型進(jìn)行觀察，也可以總結(jié)出基因的功能和特性侣肄。
3旧困、大規(guī)模評(píng)估LoF突變需要面臨的挑戰(zhàn)？
? ? 一般來說稼锅，LoF突變的頻率非常低吼具，而且絕大部分都是有害的；另外矩距，由于mapping拗盒、genotyping、嵌合體情況锥债、注釋錯(cuò)誤等等陡蝇，會(huì)增加LoF突變被發(fā)現(xiàn)的假陽性（Science 2012 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3299548/）
? ? 為了在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)LoF突變痊臭，我們需要大量樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)（WES或WGS），以及仔細(xì)的篩選流程以去除假陽性毅整，來解決上述兩個(gè)問題趣兄。
4、什么是constraint（約束）悼嫉？
? ? 這個(gè)話題可以認(rèn)為是編碼區(qū)變異的自然選擇分析，約束可以認(rèn)為是某個(gè)區(qū)域的突變受到了限制拼窥，即突變數(shù)的減少戏蔑、突變頻率很低。
????這里的理論基礎(chǔ)主要是“幸存者偏倚”鲁纠。舉個(gè)我記不清國(guó)家和名字的例子总棵，二戰(zhàn)時(shí)期某國(guó)的戰(zhàn)斗機(jī)被頻頻擊中，為了提高戰(zhàn)斗機(jī)的抗擊打能力改含，軍隊(duì)對(duì)返航的戰(zhàn)斗機(jī)進(jìn)行了觀察和統(tǒng)計(jì)情龄，記錄了所有被擊中的彈痕位置，正在他們準(zhǔn)備加固被擊中位置的時(shí)候捍壤，一位數(shù)學(xué)家提出了：沒有發(fā)現(xiàn)彈痕的位置更需要被加固骤视，因?yàn)楸换厥盏娘w機(jī)受到擊打后還足以堅(jiān)持飛回軍營(yíng)，但是有的飛機(jī)是被就地?fù)袈浠驘o法返回鹃觉，這些彈痕位置是從返回飛機(jī)上看不到的专酗。經(jīng)此提醒，可以發(fā)現(xiàn)在返回飛機(jī)上觀察不到的彈痕位置更集中于駕駛艙和發(fā)動(dòng)機(jī)這些關(guān)鍵部位盗扇。類比一下祷肯，我們可以認(rèn)為駕駛艙和發(fā)動(dòng)機(jī)是戰(zhàn)斗機(jī)上的“受約束區(qū)域”。
? ? 在變異與自然選擇原則的關(guān)系中疗隶，一個(gè)重要假設(shè)就是：自然選擇清除有害變異佑笋。
????關(guān)于這個(gè)假設(shè)，我們已經(jīng)可以觀察到的是：有的基因或區(qū)域上受到了明顯的約束斑鼻，即變異數(shù)非常的少蒋纬；或者等位基因頻率有明顯的偏倚，如在不同群體間的SNP頻率有明顯差異卵沉。
? ? 評(píng)估約束程度或者受選擇程度的建模方法颠锉，現(xiàn)在比較常用的是比較“真實(shí)的觀察值observation”和“通過某些方法建模得到的期望值expectation”。同義突變 synonymous variation作為沒有功能變化的突變史汗，一般不受到選擇影響琼掠，所以同義突變相關(guān)的值某種程度上可以作為參考值或基線數(shù)據(jù)。
5停撞、過往研究及限制
? ? 眾所周知且適用度很廣的就是基于ExAC的60,706人全外數(shù)據(jù)建立的模型：pLI（The probability of intolerance to heterozygous pLoF variation）瓷蛙，pLI將足夠長(zhǎng)度的基因分為:pLI≥0.9悼瓮，LoF突變不耐受基因，共3230個(gè)基因艰猬；pLI ≤0.1横堡，LoF突變耐受基因，共10,374個(gè)基因冠桃。這些基因列表和評(píng)分結(jié)果可以在網(wǎng)上獲得命贴，很容易地注釋到需要用的數(shù)據(jù)中。（Nature 2016 原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5018207/#SD1）
? ? 另一篇文章也是利用了ExAC的數(shù)據(jù)食听，在罕見的蛋白質(zhì)截?cái)嘧儺?protein truncating variants胸蛛，PTVs)中估計(jì)了LoF變異的選擇系數(shù)，發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的選擇富集于敲除后小鼠胚胎致死的基因樱报、假定的細(xì)胞必需基因葬项、孟德爾疾病基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。(Nat Genet. 2017?https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5618255/?）
? ? 過去研究的限制在于：
? ? ① pLI是一個(gè)二分模型迹蛤∶裾洌可以大致認(rèn)為它能較好得將單倍劑量不足的基因（下圖左）和失活耐受的基因（下圖右）區(qū)分出來，但是中間程度的比較難被辨識(shí)出來盗飒。
? ? ② pLI的模型只適用于足夠長(zhǎng)度的基因嚷量。應(yīng)該是因?yàn)樵撃Ｐ褪褂玫乃惴ㄊ牵篹xpectation-maximization algorithm （我沒仔細(xì)看。箩兽。津肛。），可分析的基因須有一定長(zhǎng)度才可計(jì)算汗贫，對(duì)于長(zhǎng)度較短的基因可能會(huì)有遺漏和錯(cuò)誤評(píng)估（吧）身坐。
? ? ③ 關(guān)于選擇的研究，只在部分確定的PTVs上進(jìn)行了研究落包，并非所有LoF變異以及所有變異部蛇，突變種類有限。
二咐蝇、本文如何面對(duì)挑戰(zhàn)涯鲁、突破限制？（全文框架）
1有序、碩大的樣本量：在125,748人的WES和15,708人的WGS中識(shí)別出了可能的LoF變異（predicted LoF variants, pLoF）
2抹腿、仔細(xì)的篩選：嚴(yán)格的樣本質(zhì)控 + 自定義的隨機(jī)森林過程-突變QC + pLoF過濾包（LOFTEE） + 部分分析進(jìn)行了進(jìn)一步的過濾和人工校正
3、優(yōu)化的預(yù)測(cè)模型：loss-of-function observed/expected upper bound fraction(LOEUF)：連續(xù)模型旭寿，對(duì)基因長(zhǎng)度無特殊要求
4警绩、模型效果驗(yàn)證，生物學(xué)特性盅称，疾病病原學(xué)分析
三肩祥、文章具體展開
1后室、A high-quality catalogue of variation （就是樣本和突變質(zhì)控）
? ? 嚴(yán)格的樣本質(zhì)控主要?jiǎng)h除了：各種測(cè)序質(zhì)量指標(biāo)較低的樣品；二級(jí)或近親屬的樣本混狠；不充分同意發(fā)布數(shù)據(jù)的樣本岸霹；已知患有嚴(yán)重兒童期發(fā)病疾病的人以及他們的直系親屬。
? ? 突變質(zhì)控的亮點(diǎn)是隨機(jī)森林質(zhì)控過程将饺，這里具體不做解釋了贡避，有興趣的可以仔細(xì)研究。
? ? 最后保留了125,748人的WES予弧，15,708人的WGS贸桶，分別有14.9million和229.9million的小突變。人群分類結(jié)果用UMAP的形式展示了出來桌肴，可分為6個(gè)global+8個(gè)sub-continental ancestries，共14個(gè)祖源類型琉历。
突變分布及飽和度概覽：類似2016年ExAC的文章坠七，對(duì)不同類型突變的MAPS值、觀察到突變的預(yù)期比例旗笔、數(shù)量等進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析彪置。
單核苷酸可變調(diào)整比例(MAPS)值越高，表示較低頻率變體越豐富蝇恶，表明危害性越大拳魁。低頻率突變?cè)趐LoF類突變中富集，這表明其更高的危害性撮弧。
CpG的轉(zhuǎn)換比非CpG的轉(zhuǎn)換和顛換更趨于飽和（即可預(yù)測(cè)到的突變~60%及以上都被觀察到了）潘懊，除了受選擇的pLoF或低甲基化區(qū)域(5 ‘ UTR)較低。意味著還有很多突變是沒有被觀察到的贿衍，可能是受到選擇的
2授舟、Identifying loss-of-function variants （重點(diǎn)是LoF突變篩選的概念和流程）
? ? 文中定義了LoF突變（上文背景中提過了），對(duì)用一般注釋工具注釋完并篩選出的候選LoF突變贸辈，利用作者自己開發(fā)的 loss-of-function transcript effect estimator (LOFTEE)工具包進(jìn)行了進(jìn)一步篩選释树，這個(gè)工具主要是會(huì)移除可以避免無義衰變的突變，比如在轉(zhuǎn)錄終端截?cái)嗟耐蛔儯ㄎ也驴赡軐?duì)蛋白質(zhì)影響不大）或最后不影響剪接的剪接突變（rescued splice variants擎淤，我猜是這個(gè)意思）奢啥。
? ? LOFTEE的效果評(píng)估：
????盡管沒有使用頻率信息，這種方法保留了罕見的嘴拢、可能有害的變異和報(bào)道過的致病變異（左）桩盲。
????該方法過濾了一些潛在功能變體(粉色)，顯示出與錯(cuò)義變體一致的頻譜炊汤。（右）
????經(jīng)過LOFTEE篩選后正驻，保留了443,769個(gè)高可信度變異弊攘，其中413,097屬于16,694個(gè)基因的規(guī)范轉(zhuǎn)錄本上，以及一組在基本剪接位點(diǎn)之外的假定剪接變異姑曙。作者還根據(jù)以下步驟做了一個(gè)gene level的pLoF度量襟交，確定了2636個(gè)高質(zhì)量突變@1815個(gè)純合雙等位型LoF耐受基因（這部分基因在后面有用）（更正：原來對(duì)biallelic理解有偏差，不是純合伤靠，是雙等位基因的意思捣域，就是這個(gè)突變只有A\T兩種等位基因型；另一個(gè)詞是multiallelic-多等位基因的宴合，就是這個(gè)突變有A\T\G\...等多種等位基因型）
3焕梅、The LoF intolerance of human genes （這段其實(shí)講了兩個(gè)模型。卦洽。贞言。）
第一個(gè)模型：優(yōu)化的突變預(yù)測(cè)模型
????在過去的研究中提供了預(yù)測(cè)基因上發(fā)生突變數(shù)量的模型（Nat Genet. 2014的《A framework for the interpretation of?de novo?mutation in human disease》鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4222185/），本文中作者加入了甲基化（CpG突變率）校正阀蒂、堿基水平覆蓋度校正该窗、LOFTEE這三個(gè)因素到模型中，對(duì)模型進(jìn)行了優(yōu)化蚤霞，用來預(yù)測(cè)在中性選擇下的突變預(yù)測(cè)值（expected）酗失。
????每個(gè)基因預(yù)期變異數(shù)的中位數(shù)為17.9，并發(fā)現(xiàn)72.1%的基因有超過10個(gè)變異數(shù)(可以歸類為最受限的基因)昧绣。另外可以看到樣本量對(duì)預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值都有很大的影響规肴，以ExAC的樣本量?jī)H可以預(yù)測(cè)到13.2（中位數(shù)）和 62.8%受限基因。
第二個(gè)模型：Loss-of-function Observed/Expected Upper bound Fraction (LOEUF)
? ? 利用第一個(gè)模型計(jì)算出的期望值作為Expected夜畴，可以發(fā)現(xiàn)拖刃，每個(gè)基因的O/E比值的分布不是二分的，而是連續(xù)的（左）斩启；LOEUF是該比值90%置信區(qū)間的上界（右）序调。（為什么是90%？我猜是這個(gè)值可以將基因數(shù)量分得更平均）這個(gè)方法的一大優(yōu)勢(shì)是也可以識(shí)別較短長(zhǎng)度的基因兔簇，舉個(gè)例子：一個(gè)短基因(observed?=?0, expected?=?2; LOEUF?=?1.34) 发绢，一個(gè)長(zhǎng)基因(observed?=?0, expected?=?100; LOEUF?=?0.03)，他們的LOEUF差別還是很大的垄琐。
? ? 后續(xù)分析中边酒，作者將19,197個(gè)基因分成十分位數(shù)，每十分位數(shù)大約有1,920個(gè)基因狸窘，按每個(gè)十分位數(shù)中的基因的均值/箱線圖來進(jìn)行分析墩朦，顏色和上圖的紅→灰對(duì)應(yīng)。首先簡(jiǎn)單的可以看到：
????在第一個(gè)LOEUF十分位數(shù)的基因中：pLoF突變十分罕見翻擒，即觀測(cè)到的概率很低（左）氓涣；聚集了以前表現(xiàn)為高pLI的基因（中）牛哺；
????在最后一個(gè)LOEUF十分位數(shù)的基因中：包含了最多的純合LoF耐受基因（右）。
????由此可推測(cè)劳吠，LOEUF十分位數(shù)的基因分組引润，從左至右，由“不耐失活”→“相對(duì)耐失活”痒玩。
4淳附、Validation of the LoF-intolerance score （和經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的知識(shí)庫進(jìn)行比較驗(yàn)證，反正效果好就對(duì)了~）
????a. 發(fā)現(xiàn)LOEUF符合已知基因集的預(yù)期分布：已知的單倍劑量不足基因中pLoF突變是非常少的蠢古；而嗅覺受體是相對(duì)不受約束的奴曙；具有已知常染色體隱性遺傳機(jī)制的基因位于分布的中間，對(duì)雜合破壞變異的選擇往往存在但較弱草讶。
????b. LOEUF與另一篇系列文章中發(fā)現(xiàn)的6735個(gè)罕見的常染色體缺失結(jié)構(gòu)變異重疊蛋白編碼外顯子的發(fā)生呈正相關(guān)
????c. 在小鼠雜合缺失后具有胚胎致死同源基因的389個(gè)基因中洽糟，我們發(fā)現(xiàn)與剩余的18808個(gè)基因相比，LOEUF得分更低堕战。
????d. CRISPR篩選所鑒定的對(duì)人類細(xì)胞存活至關(guān)重要的678個(gè)基因（與18,519個(gè)背景基因相比）在一般人群中缺少LoF變異脊框，而777個(gè)非至關(guān)重要的基因則更有可能不受限制
5 & 6、Biological properties of constraint &?Constraint informs disease aetiologies?
左a. LOEUF與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的基因連接程度和功能表征相關(guān)践啄。
左b. 在基因型-組織表達(dá)(GTEx)項(xiàng)目中，受限基因更有可能在38個(gè)組織中廣泛表達(dá)沉御，且平均表達(dá)量較高员串，與之前的結(jié)果一致毡惜。
右a.?5305 case - 2179 control 的智力殘疾或發(fā)育障礙患者研究，在LOEUF最constrained的第一個(gè)十分位基因組中，case中的denovo pLoF的突變率比control高出了15倍蚪黑；第二個(gè)十分位組中稍微增高了2.9倍。
右b.?盡管pLoF變異非常罕見柳弄，但約束基因中其他頻率更高的變異也可能是有害的疯潭，包括其他編碼或調(diào)控變異的影響。在對(duì)UK Biobank和其他大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)中658個(gè)性狀關(guān)聯(lián)結(jié)果的遺傳力劃分分析中祝旷，我們發(fā)現(xiàn)基因附近有大量的常見變異關(guān)聯(lián)履澳，這些關(guān)聯(lián)與許多性狀的LOEUF十分位數(shù)線性相關(guān)。
? 另外怀跛，F(xiàn)ig 4c 和 Fig 5c其實(shí)在其他的Companion papers中有具體的分析和結(jié)論距贷，這里就先不具體展開了。
四吻谋、研究意義與展望
? ? gnomAD這個(gè)數(shù)據(jù)集中大量的發(fā)現(xiàn)忠蝗，表明了human ‘knockout’ project在不久將來的可行性和可觀的價(jià)值。這個(gè)project就是指系統(tǒng)地嘗試發(fā)現(xiàn)所有人類蛋白編碼基因在雜合子或純合子狀態(tài)下功能性破壞突變的表型變化漓拾。
? ? 而且在現(xiàn)有的樣本量下阁最，我們還沒有觀察到人類外顯子組中所有可能的變體戒祠，即這些突變遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到飽和。更大的樣本量和祖先多樣性的增加速种，將有利于繪制一個(gè)全面的人類基因組突變地圖姜盈，直接聯(lián)系基因破壞變異與人類生物學(xué)。
（原文的討論部分主要都是文字哟旗，懶得具體翻譯了贩据，提取出了幾句我自己覺得比較畫大餅的話總結(jié)一下 0.0）
