文獻(xiàn)題目：Interrogation of Enhancer Function by Enhancer-Targeting CRISPR Epigenetic Editing
發(fā)表于2020年1月Nature Communication

這是一篇長文升敲，基本是把文獻(xiàn)翻譯了一遍袭艺，有些圖沒有放，有的段落也沒有逐字逐句的翻譯，但是這篇學(xué)習(xí)筆記還是一個字一個字碼起來的~有的地方翻譯的有些生澀，感興趣的同學(xué)可以下載全文去看。這篇文獻(xiàn)還是很不錯的，尤其是對于研究enhancer的童鞋們來說很值得一讀。

摘要
組織特異基因表達(dá)要求基因的近端以及遠(yuǎn)端的順式調(diào)節(jié)元件（CRE）的協(xié)同作用甘晤。其中，基因遠(yuǎn)端的CRE饲做，例如enhancer的功能分析還存在很大的挑戰(zhàn)线婚。這里作者描述了基于CRISPR/dCas9技術(shù)的靶向enhancer的表觀編輯系統(tǒng)，enCRISPRa 和enCRISPRi盆均，可以在體內(nèi)和體外有效的研究enhancer的功能塞弊。利用雙重effector，從而“重新編輯”enhancer相關(guān)的染色體修飾缀踪，作者展示了enCRISPRa 和 enCRISPRi通過重構(gòu)sgRNA靶向的enhancer和相關(guān)基因的表觀譜居砖，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。與現(xiàn)存的方法比較起來驴娃，這個系統(tǒng)展示了更強大奏候、脫靶率更低的的enhancer擾動活性和基因轉(zhuǎn)錄活性。作者利用enCRISPRa進(jìn)行等位基因特異性靶向TAL1 的super enhancer調(diào)節(jié)TAL1表達(dá)和腫瘤進(jìn)展唇敞。利用enCRISPRi 的knock-in小鼠蔗草，lineage特異的enhancer上單位點或者多位點擾動在體內(nèi)證明了在造血過程中發(fā)育的enhancer的lineage限制的重要性。因此疆柔，靶向enhancer的CRISPR的表觀編輯提供了研究在天然狀態(tài)下增強子的功能的機會咒精。

在閱讀文章之前，先簡單的說一下什么是CRISPRi和CRISPRa旷档，我的課題里有一部分內(nèi)容用到了CRISPRi這個技術(shù)模叙。簡單來說，CRISPRi鞋屈，稱為CRISPR干擾范咨，通過dCas9與阻遏結(jié)構(gòu)域（如KRAB）融合故觅，實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)錄沉默。而CRISPRa渠啊，稱為CRISPR激活输吏，與轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向promoter和enhancer區(qū)域，導(dǎo)致基因表達(dá)上調(diào)替蛉。為了增強激活效率贯溅，dCas9融合體需要招募多個激活結(jié)構(gòu)域。目前已經(jīng)有幾種系統(tǒng)躲查，包括多重融合體（VPR它浅，即VP64、p65和Rta5的三重融合體）镣煮、使用蛋白質(zhì)支架（如SunTag系統(tǒng)）罚缕，以及使用RNA支架（如Synergistic Activation Mediator complex）。

前言
哺乳動物基因表達(dá)要求基因近端的啟動子和遠(yuǎn)端的CRE（例如轉(zhuǎn)錄enhancer）來調(diào)節(jié)怎静。人類表觀組的系統(tǒng)的注釋已經(jīng)通過相關(guān)特點（例如染色體可接近性和組蛋白修飾）鑒定了百萬個假定的CRE。然而黔衡，這些元件在自然狀態(tài)下的體內(nèi)功能分析還是非常困難的蚓聘。這是由于現(xiàn)有的技術(shù)對enhancer活性的測定都沒有在天然狀態(tài)下的染色體結(jié)構(gòu)上分析，還有一部分原因是基于這些技術(shù)的發(fā)現(xiàn)并沒有與特異的靶基因或者發(fā)育過程中的細(xì)胞功能有因果聯(lián)系盟劫。enhancer是順式調(diào)節(jié)元件夜牡，它本身是一段DNA序列，它可以在特異的細(xì)胞類型或者暫時的細(xì)胞狀態(tài)下結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白調(diào)節(jié)因子侣签。

一般來說利用表觀特征（例如DNase I超敏或者 ATAC-seq）和組蛋白marks（H3K4me1/2 和 H3K27ac）來推斷enhancer塘装。與基因的近端啟動子不同的是，enhancer可以在離基因很遠(yuǎn)的地方調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄影所，而且與基因的方向沒有關(guān)系蹦肴。Reporter分析是用來檢測不同細(xì)胞模型里enhancer活性的傳統(tǒng)方法。與高通量測序結(jié)合起來猴娩，reporter分析可以同時定量分析上千個enhancer的轉(zhuǎn)錄活性阴幌。與轉(zhuǎn)基因結(jié)合起來，體內(nèi)reporter分析可以評估在發(fā)育過程中enhancer的功能卷中。這些方法分析轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性是非常強大的矛双，但是這些也有一些限制性，這些方法通常使用SV40啟動子蟆豫，而不是enhancer的內(nèi)源啟動子议忽，從而無法鑒定enhancer的靶向基因，也無法研究天然染色質(zhì)上多個enhancer的組合調(diào)控十减。另外栈幸，傳統(tǒng)的基因靶向或者基因組編輯方法已經(jīng)用于在細(xì)胞系里或者動物模型里KO或者突變特異的enhancer愤估。然而，這些方法都是低通量并且耗費人力侦镇。

近日灵疮，通過改變CRISPR/Cas9系統(tǒng)調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)的方法有了很大的進(jìn)步。通過結(jié)合dCas9(deactivated Cas9）和多種活化因子（例如VP64和p300）或者抑制因子（KRAB壳繁，LSD126和DNMT3A/3L）的結(jié)構(gòu)域震捣，在轉(zhuǎn)錄水平干擾特異基因。而第一代dCas9的activator或repressor復(fù)合物（例如dCas9-VP64和dCas9-KRAB）與基因近端啟動子結(jié)合時闹炉，可以有效地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄蒿赢，從而發(fā)揮作用。而當(dāng)其目標(biāo)區(qū)域遠(yuǎn)離近端啟動子時渣触，效率迅速下降羡棵。第二代dcas9的activator通過dacas9融合和（或）MS2-MCP，利用效應(yīng)蛋白的結(jié)合提高靶向的基因調(diào)節(jié)效率嗅钻。然而皂冰，這個策略并沒有涉及到enhancer靶向的表觀修飾。這篇文章里养篓，作者描述了enhancer靶向的CRISPR表觀編輯系統(tǒng)秃流，enCRISPRa和enCRISPRi，利用dcas9雙效應(yīng)分子來研究enhancer的功能柳弄。利用人類β-globin位點控制區(qū)域（LCR）舶胀，癌基因TAL1超級enhancer(SE)，和造血譜系特異性enhancer為例子碧注，闡述enCRISPRa和enCRISPRi在體外和體內(nèi)enhancer功能嚣伐。

Results
（一）enCRISPRa系統(tǒng)的構(gòu)建，激活enhancer的活性
為了評估基因遠(yuǎn)端的enhancer的功能萍丐，作者設(shè)計了基于dcas9的enhancer靶向的表觀干擾系統(tǒng)轩端，來驗證enhancer的調(diào)節(jié)作用。作者在sgRNA載體上加了兩個MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)逝变，這個結(jié)構(gòu)可以被MCP RNA結(jié)合蛋白識別船万。

圖1a：enCRISPRa結(jié)構(gòu)示意圖，包含3個成分：一個dCas9-p300融合蛋白, 含有2個MS2發(fā)夾結(jié)構(gòu)的sgRNA-MS2和MCP-VP64融合蛋白

為了enhancer的活性 （enCRISPRa骨田；圖1a）耿导，作者用組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300的核心區(qū)域（可以催化組蛋白H3的Lys27乙酰化）融合dcas9态贤；與MS2-sgRNA序列與MCP-VP64一起招募轉(zhuǎn)錄復(fù)合體至promoter區(qū)域舱呻。作者之后又構(gòu)建了第二版的enCRISPRa，這個新版的結(jié)構(gòu)是dcas9-VP64+MCP-p300的結(jié)合。因為H3K27ac是活化的enhancer的標(biāo)志箱吕，利用doxycycline (Dox)誘導(dǎo)表達(dá)的dcas9-p300芥驳，sgRNA-MS2或MCP-VP64 ，作者構(gòu)建了enhancer靶向的雙activator系統(tǒng)（圖S1a）（這里稱雙效應(yīng)系統(tǒng)是因為茬高，以往的CRISPRa系統(tǒng)都是單效應(yīng)因子p300或者VP64兆旬，這里作者把兩個效應(yīng)因子放在了一起）。（這里說的比較亂怎栽，簡單的說就是作者構(gòu)建了很多種載體丽猬，是為了之后測試哪一種載體能最大程度激活enhancer的活性）

圖S1a

為了檢測 enCRISPRa在調(diào)節(jié)CRE的活性，作者以enCRISPRa或單效dCas9為靶點在HEK293T細(xì)胞中使用序列特異性sgRNAs激活已知的MYOD增強因子(圖1b)熏瞄。與沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比脚祟，dcas9單獨或者dCas9-VP64對MYOD的表達(dá)沒有影響，而dCas9-p300顯著的激活了MYOD的表達(dá)强饮，高達(dá)17.7倍由桌。重點是dCas9-VP64 + MCP-p300 (VP)或者dCas9-p300+ MCP-VP64 (PV)的結(jié)合可以增強MYOD的活性（分別是26.5倍和32.8倍），說明雙效應(yīng)體enCRISPRa產(chǎn)生了對靶向enhancer更有效的轉(zhuǎn)錄活性邮丰。

圖1b

之后作者主要研究人類β-球蛋白基因座上的HS2 enhancer（圖1C）行您。β-球蛋白基因座包含5個β-樣球蛋白基因（HBE1, HBG1, HBG2, HBD 和HBB），這些基因被共有的上游enhancer簇和基因座控制區(qū)域（LCR）調(diào)控剪廉。β-球蛋白基因座控制區(qū)域由5個離散的DNase I 超敏感位點（HS1-HS5）組成邑雅，其中HS2在轉(zhuǎn)基因分析中顯示其功能是紅細(xì)胞特異性的enhancer。與MYOD的enhancer相似妈经， enCRISPRa靶向的HS2的enhancer相比于單效應(yīng)dcas9來講更加可以激活β-球蛋白基因（HBE1,HBG1/2 和HBB）（圖1C）。兩種enCRISPRa版本的激活效應(yīng)沒有很大的區(qū)別捧书，作者主要使用 dCas9-p300 + MCP-VP64（PV）這一版本來進(jìn)行后續(xù)的驗證試驗吹泡。

圖1C

接下來作者比較了enCRISPRa和二代dCas9激活方法（例如dxCas9-VPR22, SunTag17和SAM19）（圖1D，E）经瓷。

圖1D

圖1E

很明顯的爆哑，enCRISPRa 相比于其他的dcas9激活系統(tǒng)更加提高了MYOD 的enhancer活性（圖1D）。在β-球蛋白基因座舆吮，enCRISPRa介導(dǎo)的HS2 enhancer的活性揭朝，使得HBE1, HBG1/2 和HBB表達(dá)水平分別提高了23.6、40.6和13倍（圖1E）色冀。這個激活的水平明顯比其他dcas9系統(tǒng)要高很多潭袱。

而enCRISPRa對于基因近端的promoter的激活效應(yīng)就不是很好，作者利用enCRISPRa的方法檢測了對IL1RN和OCT4的promoter的激活效應(yīng)（SFig1b）锋恬。

圖SFig1b

作者還比較了單效應(yīng)的CRISPRa和雙效應(yīng)因子CRISPRa系統(tǒng)的激活效率（圖SFig1d）屯换，結(jié)果說明將雙效應(yīng)因子p300 和VP64與MS2-MCP支架結(jié)合在一起的enCRISPRa系統(tǒng)能夠最大程度的激活enhancer的活性。

圖SFig1d

盡管不同的單效應(yīng)、雙效應(yīng)因子激活系統(tǒng)有著不一樣的激活效率彤悔，但是這個激活效率是根據(jù)不用的靶標(biāo)基因嘉抓、不同的細(xì)胞系、轉(zhuǎn)染條件晕窑、分析基因表達(dá)的時間抑片、以及你設(shè)計的sgRNA的位置而變化的。因此杨赤，作者使用了相同的細(xì)胞系敞斋、相同的sgRNA序列、相同的轉(zhuǎn)染條件來比較不同dcas9激活系統(tǒng)的效率望拖。

（二） enCRISPRi 系統(tǒng)：抑制enhancer 的活性
接下來作者還構(gòu)建了雙效應(yīng)表觀編輯系統(tǒng)enCRISPRi-LK（圖2a）渺尘。這里作者把dcas9與LSD1 (或KDM1A)融合，LSD1作為組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶说敏，可催化移除enhancer相關(guān)組蛋白H3-賴氨酸的單/雙甲基(H3K4me1/2)鸥跟，與MS2-sgRNA一起招募MCP-KRAB抑制區(qū)域。

圖2a

作為一個原理驗證盔沫，作者利用enCRISPRi靶向K562細(xì)胞里HS2 enhancer医咨，這個細(xì)胞系表達(dá)高水平的β-球蛋白基因(HBE1, HBG1/2和 HBB) ，作者設(shè)計了4個獨立的sgRNA(sgHS2-1 到 sgHS2-4)架诞，還有一個對照sgGal4（圖2b）拟淮。作者還構(gòu)建了第二個版本的enCRISPRi系統(tǒng)，是dCas9-KRAB + MCP-LSD1 (enCRISPRi-KL) 的組合（圖2a,圖sfig1a）谴忧。結(jié)果看來任何一個enCRISPRi版本都可以明顯的抑制β-球蛋白基因（圖2b）很泊。與單效應(yīng)dcas9系統(tǒng)相比（dCas9-KRAB (K) 和dCas9-LSD1 (L) ），雙效應(yīng)系統(tǒng)顯示出更強的抑制效率（圖2b,圖2c）沾谓。

圖2b

圖2c：K562細(xì)胞的RNA-seq結(jié)果委造，

另外，ChIP-seq分析結(jié)果顯示dacs9結(jié)合的明顯富集在HS2的enhancer上（相比于sgGal4）（圖2d）均驶。

圖2d

作者利用enCRISPRi檢測靶向單獨或者多個β-球蛋白 LCR的enhancer的效率（圖2e）昏兆。作者使用的是enCRISPRi (LK)版本。分別針對LCR enhancers設(shè)計sgRNA(sgHS1 到 sgHS5) 妇穴，并且對HBG1/2也設(shè)計了sgRNA (sgHBG)爬虱。β-球蛋白基因座兩端有兩個CTCF相關(guān)的絕緣子元件（在HS5和3′HS1附近)，所以作者在β-球蛋白絕緣子外2-4kb的地方設(shè)計了sgRNA (sgCTCF1和 sgCTCF2)腾它，還設(shè)計了β-球蛋白基因座拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)以外區(qū)域設(shè)計了sgTAD1和sgTAD2跑筝，并針對其他染色體設(shè)計了sgRNA(sgCtrl; chr2:211,337,408–211,337,427)（圖2e）。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染5個sgRNA的 β-球蛋白基因的表達(dá)量相比于單個sgRNA并沒有進(jìn)一步被抑制（圖2f）瞒滴。

圖2e

圖2f

當(dāng)靶向基因近端的啟動子時继蜡，基于dCas9的表觀修飾可能會阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，或干擾轉(zhuǎn)錄起始和延伸復(fù)合物的形成。相反稀并，enhancer的抑制要求干擾特定enhancer調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的功能仅颇，并影響它們的結(jié)合活性。作者推斷enCRISPRi 靶向近端的enhancer中心可能達(dá)到最大效應(yīng)碘举，相比于遠(yuǎn)端enhancer序列忘瓦。為了證明這個推斷，作者利用enCRISPRi靶向DNase I超敏活性（DHS）在HS2區(qū)域的峰引颈，和峰的上游0.5/ 2.5 kb以及下游0.5 /2.5 kb(sgHS2-2.5k, sgHS2-0.5k, sgHS2 + 0.5k和sgHS2 + 2.5k; Fig. 2e)耕皮。結(jié)果顯示隨著遠(yuǎn)離enhancer中心的位置， enCRISPRi的抑制效果明顯降低（圖2f）蝙场。

這些結(jié)果不僅建立了改進(jìn)的針對enhancer擾動表觀編輯系統(tǒng)凌停，還證明了表觀調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子的結(jié)合可以更大程度的擾動特異基因的轉(zhuǎn)錄。之前的系統(tǒng)CRISPRa (p300/VP64) 和CRISPRi (LSD1 /KRAB)被用來檢測啟動子和增強子對于轉(zhuǎn)錄的調(diào)控售滤，但是之前沒有人把兩種效應(yīng)因子結(jié)合在一起使用罚拟。所以enCRISPRa 和enCRISPRi 系統(tǒng)是第一次在單個dcas9復(fù)合體里結(jié)合了 p300–VP64、LSD1–KRAB完箩，從而增強赐俗、抑制enhancer的活性。

（三）利用enCRISPRi進(jìn)行位點特異性的表觀編輯
為了確定enCRISPRi在表觀譜上的影響弊知，作者進(jìn)行了多個Chip-seq實驗阻逮，包括檢測增強子相關(guān)活性組蛋白marks（H3K4me1, H3K4me2 和H3K27ac）、抑制染色體相關(guān)的H3K9me3 和 H3K27me3秩彤、造血譜系主要調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子（GATA1 和TAL1）叔扼，以及CTCF。對照是不靶向任何基因的sgGal4漫雷、或sgHS2（圖3）（不得不說這實驗室真的是有錢瓜富。。）珊拼。

圖3：Chip-seq結(jié)果：標(biāo)注為enCRISPRi—C, enCRISPRi—K, enCRISPRi—L, or enCRISPRi—KL的，意思分別是enCRISPRi比上control的信號強度流炕、enCRISPRi比上dcas9-KRAB的信號強度澎现、enCRISPRi比上dcas9-LSD1的信號強度、和enCRISPRi比上KL的信號強度每辟。 淺綠色的bar表示的 β-球蛋白基因

與對照組相比（C）剑辫，dCas9-LSD1 (L) 和dCas9-KRAB(K), 雙效應(yīng)抑制因子系統(tǒng) enCRISPRi LK 和 KL在HS2位點上的H3K4me1和H3K27ac結(jié)合明顯降低（增強子相關(guān)激活組蛋白marks）。但對于其他位點沒有影響渠欺。兩個版本的enCRISPRi LK 和KL提高了HS2 enhancer的抑制組蛋白marks（H3K9me3）妹蔽。值得注意的是，enCRISPRi也大幅的抑制了在β-globin基因近端啟動子和基因body上的H3K4me2和H3K27ac。這些結(jié)果說明了enCRISPRi介導(dǎo)的enhancer抑制導(dǎo)致靶向的enhancer和相關(guān)基因啟動子的表觀變化胳岂，主要是通過抑制了enhancer和promoter的相互作用编整。兩個版本的enCRISPRi (LK or KL)相比于dcas9-KRAB或單獨dcas9-LSD1而言，同時促進(jìn)了H3K9me3的增加和H3K4me1/2的降低乳丰。說明了兩個抑制蛋白的協(xié)同作用掌测。

dCas9-KRAB或者dCas9-LSD1單獨作用對GATA1和TAL1的結(jié)合都只降低的不多，這兩個造血系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子是HS2 enhancer的所必需的产园，但是如果使用enCRISPRi就可以明顯的抑制GATA1和TAL1對HS2 enhancer的結(jié)合汞斧。雖然dcas9的結(jié)合可能會干擾TF–DNA的相互作用，如果sgRNA和轉(zhuǎn)錄因子靶向序列重合的時候什燕，但是在這個結(jié)果來看，GATA1/TAL1對DNA結(jié)合的改變可能是因為dcas9抑制因子改變了HS2的表觀譜。截至目前川蒙，作者在體外實驗證明了雙效應(yīng)因子系統(tǒng)可以更加有效的對靶序列進(jìn)行表觀修飾著角。

（四）癌基因的超級增強子的等位基因特異性干擾
證明了enCRISPRa 和enCRISPRi在體外的效率，下面作者測試了是否可以在體內(nèi)通過靶向疾病相關(guān)基因CRE來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和疾病表型剑勾。在原癌基因TAL1的一個enhancer上游8kb的地方在淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系和患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有頻發(fā)突變埃撵。雜合體細(xì)胞突變通常是通過在TAL1的enhancer序列上插入幾個核苷酸來獲得的。為了驗證enCRISPRa在體內(nèi)的活性虽另，作者檢測了在Jurkat細(xì)胞里enCRISPRa介導(dǎo)的TAL1 enhancer的活性暂刘。作者設(shè)計了兩個sgRNA靶向突變的等位基因，這兩個sgRNA帶有12bp的插入序列（sgMut1 和 sgMut2）（圖4a）捂刺。作為對照谣拣，作者又設(shè)計了兩個sgRNA同時靶向WT和突變的enhancer序列（在靠近12bp插入序列的位置，命名為sgWT1和sgWT2）族展。

圖4a

在Jurkat細(xì)胞里共表達(dá)enCRISPRa和設(shè)計的那些sgRNA森缠，作者檢測了sgRNA的靶向性（圖4b），發(fā)現(xiàn)sgMut1 和sgMut2明顯的結(jié)合Mut等位基因仪缸，不結(jié)合WT等位基因贵涵；而sgWT1和sgWT2對于WT和Mut的結(jié)合能力相似。在K562細(xì)胞里恰画，這個細(xì)胞缺乏Mut等位基因宾茂，所以可以看到dcas9幾乎不和WT等位基因結(jié)合。說明了enCRISPRa的等位基因特異性靶向效率很高拴还。

圖4b

更重要的是跨晴，作者發(fā)現(xiàn)了TAL1的mRNA和蛋白水平被sgMut和sgWT誘導(dǎo)表達(dá)（圖4c,d）。升高的TAL1的表達(dá)明顯的促進(jìn)了細(xì)胞生長（圖4e）片林。由于sgMut1和sgMut2特異靶向突變的enhancer序列端盆，這些結(jié)果說明突變的TAL1等位基因特異的改變怀骤，導(dǎo)致了TAL1轉(zhuǎn)錄的活化。相反的焕妙，作者發(fā)現(xiàn)使用enCRISPRi介導(dǎo)的TAL1的SE抑制（使用相同的sgRNA）能夠明顯的降低TAL1的mRNA和蛋白的水平蒋伦，并抑制細(xì)胞生長（圖就不放上來了）。

圖4c,d,e

之后访敌，作者把轉(zhuǎn)染了enCRISPRa的T-ALL細(xì)胞注射進(jìn)小鼠（NSG）體內(nèi)凉敲，發(fā)現(xiàn)enCRISPRa-介導(dǎo)的TAL1 enhancer的活化促進(jìn)了腫瘤的生長（圖4I,j）。白血病表型也顯著的增加寺旺，在外周血（PB）和骨髓（BM）里浸潤的白血病細(xì)胞也升高了（圖4k,l）爷抓。這些結(jié)果不僅說明了TAL1癌基因SE的功能作用在T-ALL發(fā)展中的建立，也證明了enCRISPRa 和enCRISPRi 的等位基因特異性干擾疾病相關(guān)enhancer在體內(nèi)也非常有效阻塑。

圖4I,j,k,l

（五）在可誘導(dǎo)的knock-in小鼠模型中應(yīng)用enCRISPRi
在體內(nèi)系統(tǒng)性的分析enhancer功能至今都是比較困難的蓝撇。為了驗證enCRISPRi在體內(nèi)對enhancer的干擾作用，作者構(gòu)建了位點特異性的dcas9-KRAB的knock-in嵌合體小鼠陈莽，這個dcas9-KRAB是由TRE的啟動子控制渤昌，可進(jìn)入Col1a1位點（圖5a）。囊胚注射胚胎干細(xì)胞走搁，篩選后代独柑，把篩選好的細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)，這里用的小鼠是dCas9-KRAB::Rosa26-M2rtTA雜合體（或純合dCas9-KRAB KI小鼠）（圖5b）私植。

圖5a

為了檢測dcas9-KRAB在小鼠造血系統(tǒng)發(fā)展過程中的表達(dá)忌栅，作者用小鼠的全血和骨髓和脾細(xì)胞去做分選，根據(jù)紅系（Ter119+）曲稼，B淋巴系（B220+）索绪，T淋巴系（CD3+）和骨髓來源的細(xì)胞（Mac1 +Gr1+）分（加或不加DOX誘導(dǎo)dcas9）。結(jié)果（補充圖6贫悄，我就不放了）顯示瑞驱，DOX誘導(dǎo)的dcas9-KRAB表達(dá)并不影響造血系統(tǒng)的功能。也不影響骨髓和脾的造血干細(xì)胞群窄坦。說明dcas9-KRAB表達(dá)對小鼠血液功能沒有副作用唤反。

（六）譜系特異性enhancer在體內(nèi)的功能
造血系統(tǒng)作為一個范例，可以供人們研究控制干細(xì)胞分化的相關(guān)譜系特異性的轉(zhuǎn)錄因子鸭津。自我更新的造血干細(xì)胞（HSC）通過一系列的祖細(xì)胞層級彤侍，產(chǎn)生所有成熟的血細(xì)胞譜系。在骨髓移植中曙博，HSC可以為受體重構(gòu)整個血液系統(tǒng)拥刻，然而祖細(xì)胞卻不能怜瞒。HSC自我更新和譜系分化被一系列的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控父泳，許多轉(zhuǎn)錄因子的功能有著高度譜系特異性和組織特異性般哼。

接下來，作者設(shè)計了一個體內(nèi)實驗enhancer干擾試驗惠窄，用dCas9-KRAB KI 小鼠與sgRNA-MS2 和MCP-LSD1結(jié)合在一起蒸眠，在體內(nèi)組裝enCRISPRi復(fù)合體（圖5a）。然后作者用enCRISPRi的方法杆融，驗證了譜系特異性enhancer相關(guān)造血轉(zhuǎn)錄因子的功能（圖5d）楞卡。作者集中在5個轉(zhuǎn)錄因子上：Cebpa,Spi1 (or PU.1), Gata1, Gata2和 Runx1。這些轉(zhuǎn)錄因子對HSC功能和譜系分化起著重要作用脾歇。每一個基因都有一個或多個被注釋的enhancer（根據(jù)ATAC-seq和H3K27ac的Chip-seq結(jié)果）（圖5e,f）蒋腮。

作者針對每一個enhancer設(shè)計了2個或3個sgRNA，對每一個啟動子也設(shè)計了2或3個sgRNA作為陽性對照藕各。還有另外10個nontarget的陰性對照池摧。將這些sgRNA分成5個庫，每個庫里有16-20個sgRNA激况。從dcas9-KRAB KI小鼠體內(nèi)分離出CD45.2+譜系陰性HSPC細(xì)胞作彤，用retro病毒轉(zhuǎn)染這5個sgRNA庫（MOI<=0.5），保證每一個細(xì)胞里不多于一個sgRNA乌逐。這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被植入CD45.1+的接受致死輻射量的小鼠體內(nèi)竭讳，DOX誘導(dǎo)dcas9-KRAB表達(dá)16周。此時浙踢，所有供體來源的造血細(xì)胞（CD45.2+）代替了“短命”的祖細(xì)胞绢慢。作者收集骨髓移植之前的細(xì)胞（T1）作為對照，受體外周血里的供體來源骨髓細(xì)胞HSPC和成熟髓細(xì)胞（Gr1+Mac1+）成黄，B細(xì)胞（B220+）和T細(xì)胞（CD3+）（T2）（圖5d）呐芥。

圖5d

作者進(jìn)行了5個獨立位點特異性enhancer干擾篩選，每個有獨立的兩次實驗重復(fù)奋岁，分別針對Cebpa, Spi1, Gata1, Gata2和Runx1（圖5e,f）思瘟。Cebpa的缺失或者其下游的enhancer（E4，圖5e）的缺失導(dǎo)致髓系分化的缺陷闻伶，但不影響淋巴細(xì)胞生成滨攻。另外，cebpa E2 enhancer也是體內(nèi)髓系生成所必需的蓝翰，而E1和E3不是必需光绕。

圖5e,f：（e）體內(nèi)enCRISPRi 干擾 Cebpa CREs 揭示造血過程中譜系特異性所必需的Cebpa enhancer。Waterfall plots結(jié)果顯示特異靶向sgRNA（綠色和紅色的點）和非靶向的sgRNA（灰色的點）畜份，縱坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)化log2倍數(shù)變化（T2比上T1）

對于spi1位點诞帐，作者設(shè)計的3個sgRNA都可以很好的去除-14kb的enhancer活性（髓系。而非B或者T）（圖5f）爆雹。這些結(jié)果說明了spi1在正常髓系細(xì)胞發(fā)育的作用停蕉，證實了體內(nèi)spi1上游的enhancer的調(diào)節(jié)作用愕鼓。而對于Gata1而言，靶向其啟動子的sgRNA只能輕微的抑制它的表達(dá)慧起，靶向其增強子的sgRNA完全沒有抑制效果菇晃，而且Gata1增強子表現(xiàn)出了染色體可接近性和H3K27ac的富集（在HSC細(xì)胞，而不再B,T細(xì)胞里）蚓挤，說明Gata1的增強子并不是HSC分化為成熟髓系或者淋巴系所必需的（圖就不放了）磺送。

（七）造血系統(tǒng)多位點enhancer干擾
位點特異性干擾篩選提供了每一個enhancer在相對的基因的“重要性”（local），但是并不能揭示在造血系統(tǒng)里多位點enhancer之間的相對重要性灿意。為了解釋這個問題估灿，作者把之前針對5個基因的enhancer設(shè)計的所有sgRNA和對照放在一起組成一個大庫，進(jìn)行多位點增強子干擾篩選（圖6a ）缤剧。

圖6a

結(jié)果顯示甲捏，被抑制的最大的enhancer是Cebpa + 37 kb (E4) 和+8 kb (E2)，Gata2 + 9.5 kb (E4)和Spi1 –14 kb（圖6b）鞭执。而spi1和Gata2增強子的sgRNA只是輕微的被抑制（在B和T細(xì)胞里）司顿。這些結(jié)果說明造血系統(tǒng)中需要不同的發(fā)育enhancer，有些enhancer事參與大部分譜系分化兄纺，比如Gata2或者spi1的增強子大溜；而有些是特異性譜系分化必須的（比如Cebpa增強子）。

討論
本文首先是描述了雙效應(yīng)因子CRISPR表觀編輯系統(tǒng)進(jìn)行位點特異性轉(zhuǎn)錄增強子（或CRE）的激活或者抑制系統(tǒng)構(gòu)建估脆。之后利用構(gòu)建的系統(tǒng)在體內(nèi)和體外都進(jìn)行了驗證钦奋。該系統(tǒng)可以供人們進(jìn)行對增強子的研究（生理和病理條件下），從而可以提供enhancer調(diào)控的機制疙赠。