Identification of functional pathways and molecular signatures in neuroendocrine neoplasms by multi-omics analysis
通過多組學(xué)分析識別神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的功能通路和分子特征
發(fā)表期刊：J Transl Med
發(fā)表日期：2022 Jul 6
DOI:? 10.1186/s12967-022-03511-7
一务傲、背景
????????神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NENs）是一類罕見的、異質(zhì)性的腫瘤枣申，其分子發(fā)病機(jī)制是一個未解決的問題售葡。NENs的特點是全身分布，因為它們由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)展而來忠藤，分布于全身挟伙。這些腫瘤既可以以散發(fā)性形式發(fā)生，也可以在遺傳性綜合征中發(fā)生模孩。源自胰腺和胃腸道的NENs尖阔，即胃腸胰腺NENs（GEP-NENs）是最常見的形式之一。
????????一般來說榨咐，NENs的特點是生長速度相對緩慢介却，能夠分泌肽類激素和生物胺，被用作生物標(biāo)志物块茁。然而齿坷，由于非特異性癥狀和缺乏早期標(biāo)志物，許多NENs在診斷時顯示出轉(zhuǎn)移的特征数焊，使得有時無法確定腫瘤病變的主要部位永淌。除了更準(zhǔn)確的分類外，另一個問題是缺乏診斷NEN的特異性標(biāo)志物昌跌。
二仰禀、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來源
1）46名NEN患者（甲狀腺=17，胰腺=14蚕愤，腸道=12答恶，肺=3）的腫瘤活體組織
2）從帕多瓦大學(xué)醫(yī)學(xué)系（DIMED）的內(nèi)分泌科獲得了20個先前從MTCs（甲狀腺髓樣癌）分離的RNA的驗證集
3）為了在液體活檢中驗證miRNA，獲得了42名NEN患者（6名MTCs和36名GEP-NENs）和34名健康受試者的血清
2.實驗流程
1） 核酸提取萍诱、突變分析悬嗓、陣列-CGH分析
2） 轉(zhuǎn)錄組分析、small-RNA分析
3） 血清采樣裕坊、RNA提取包竹、反轉(zhuǎn)錄和實時PCR
三、實驗結(jié)果
01 - 樣本選擇、組織形態(tài)學(xué)特征和免疫染色
????????本研究分析的患者隊列由66個樣本組成周瞎，包括29個不同等級的GEP-NENs和37個MTCs苗缩。其中，46個是冷凍組織或FFPE声诸，用于不同的檢測酱讶，而20個先前分離的RNA樣本代表了MTC轉(zhuǎn)錄組學(xué)的驗證組。此外彼乌，對于5個GEP-NENs泻肯，作者沒有獲得原發(fā)腫瘤，而是有轉(zhuǎn)移組織（2個肝臟和3個淋巴）慰照。作者應(yīng)用多組學(xué)實驗方法來確定改變的基因灶挟、編碼轉(zhuǎn)錄物和miRNAs，特別是影響所研究的NENs的功能途徑。
????????在可能的情況下，根據(jù)可用樣本的質(zhì)量和數(shù)量揩徊，作者進(jìn)行了多基因小組測序：RNA-Seq和smallRNa-Seq走芋。對于較小的集合（30個樣本），還通過比較基因組學(xué)雜交（CGH）陣列進(jìn)行了分子核型。根據(jù)新的組織病理學(xué)分類，基于腫瘤分級和細(xì)胞分化，將樣本分為G1-G2 GEP-NETs曹锨、G3 GEP-NECs和MTCs（圖1A, D, G, L）。此外還驗證了CgA和Syn免疫組化標(biāo)記物的陽性染色剃允，這些標(biāo)記物用于常規(guī)組織病理學(xué)診斷沛简，以確認(rèn)NENs的腫瘤類別（圖1B，E斥废，H椒楣，C，F(xiàn)牡肉，I）捧灰，以及CgA和Calcitonin的陽性染色，MTC的特異性免疫組化標(biāo)記物（圖1M统锤，N）毛俏。在圖1中，顯示了上述形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)特征的代表性圖像饲窿。聚類分析是為了評估在比較FFPE和新鮮/冷凍組織時可能出現(xiàn)的樣本變異煌寇，顯示樣本最好根據(jù)組織類型分組，而不是根據(jù)樣本儲存和文庫制備方法逾雄。然而阀溶，所有這些變異來源在下游分析中都被考慮到了腻脏。
02 - 評估NENs的多基因突變特征
????????通過NGS分析從46個冷凍或FFPE NEN-組織中分離出來的DNA，以確定523個癌癥相關(guān)組織中更可能受序列變異影響的基因银锻。測序后永品，由于質(zhì)量低，兩個樣本被丟棄击纬，無法進(jìn)行進(jìn)一步分析腐碱。詳細(xì)來說，該方法可以同時分析來自不同腫瘤組織的多種生物標(biāo)志物掉弛，在一次檢測中評估多種變異類型，包括小核苷酸變異（SNVs）喂走、插入殃饿、剪接變異和新興的免疫療法生物標(biāo)志物，如腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）芋肠。
????????在對變體進(jìn)行注釋并過濾掉同義變體乎芳、基因間變體、覆蓋率低于100倍的變體帖池、在普通人群中存在超過5%的變體以及在ClinVar數(shù)據(jù)庫中被注釋為 "良性 "或"可能良性 "的變體后奈惑，作者確定了5047個突變體。其中大多數(shù)是內(nèi)含子睡汹，而近18%是外含子（圖2A）肴甸；僅考慮外含子和剪接變體，超過80%是非同義的SNVs（圖2B）囚巴。在圖2C中列出了所有被檢查的NENs中前20個突變的基因原在，只考慮外顯子和剪接變體。有趣的是彤叉，在所分析的各種組織中庶柿，最頻繁突變的基因是DNA損傷檢查點蛋白1（MDC1）的介質(zhì)。這是一個關(guān)鍵的DNA損傷反應(yīng)（DDR）效應(yīng)器秽浇，通過與TP53相互作用發(fā)揮抗凋亡因子的作用浮庐，TP53的丟失通常與基因組不穩(wěn)定性和致瘤性有關(guān)。盡管它在同源重組修復(fù)中起著關(guān)鍵作用柬焕，也包括其他因素审残，如ATM和BRCA1，這些都是分析樣本中最主要的突變基因斑举，但迄今為止维苔，它在NENs中從未被發(fā)現(xiàn)有明顯改變，盡管它在癌癥發(fā)展和治療中的作用正在出現(xiàn)懂昂。另一個證據(jù)是介时，與其他大多數(shù)基因不同，MDC1在每個樣本中大多受到多個變體的影響，這一趨勢在NUTM1沸柔、ZFHX3和FAT1中較少出現(xiàn)循衰。其余的基因在單個病例中也觀察到類似的行為，相反褐澎，錯義突變最常在全球范圍內(nèi)觀察到会钝，而幀移插入或缺失和幀內(nèi)缺失是零星的事件。
????????然后工三，盡管考慮了所有的NEN樣本迁酸，但在前20個突變基因中，NUTM1俭正、ERCC4奸鬓、MAP3K1、MAP3K4掸读、RET和RPS6KB2與其他基因不同串远，從未在腸道組織中發(fā)生突變，而僅在甲狀腺和胰腺衍生的腫瘤中發(fā)生突變（圖2C）儿惫。另一方面澡罚，考慮到MTC和GEP-NENs的獨立情況（圖S1），在最主要的突變基因中檢索到已知的驅(qū)動因素和侵略性標(biāo)記肾请，如MTC的HRAS和RET（圖S1A）留搔，GEP-NETs的MEN 1（圖S1B），GEP-NECs的RB1和TP53（圖S1C）铛铁。
????????對突變基因進(jìn)行的功能注釋分析證實催式，正如預(yù)期的那樣，這些基因參與了與基因組穩(wěn)定性維持有關(guān)的途徑避归，如通過同源重組進(jìn)行DNA修復(fù)荣月，DNA損傷反應(yīng)和檢查點調(diào)節(jié)以及ATM信號傳導(dǎo)（圖2D）。最后梳毙，在分析TMB狀態(tài)時哺窄，考慮到GEP-NEN和MTC組，中位數(shù)約為3账锹；當(dāng)分別考慮NETs和NECs時萌业，在GEP-NEN組內(nèi)，NECs的中位數(shù)明顯增加奸柬，在某些情況下超過10生年，這是預(yù)測受試者對免疫療法有反應(yīng)的閾值（圖2E）。相反廓奕，MSI定量評分并不具有信息量抱婉，這與其他人的觀察一致档叔。
????????上述44個分析樣本中的30個樣本的DNA也通過CGH陣列進(jìn)行了分子核型分析，以評估CNVs的存在蒸绩。GEP-NENs一般呈現(xiàn)多個缺失/重復(fù)和幾個鑲嵌衙四，染色體5、6患亿、7传蹈、11、18步藕、22和X主要受影響惦界，而MTCs除了一個病例外，每個樣本大多顯示單一事件咙冗，主要代表缺失（圖3A沾歪，B）。從先前的的多基因組合測試分析可以識別基因擴(kuò)增乞娄，發(fā)現(xiàn)EGFR和BRAF基因都位于7號染色體上，是GEP-NEN樣本中最常擴(kuò)增的基因之一显歧。而最常擴(kuò)增的RPS6KB1則位于17號染色體上仪或，僅在少數(shù)情況下導(dǎo)致重復(fù)（圖3B）。正如所料士骤，MTC樣本沒有顯示基因擴(kuò)增事件范删。
????????由于NGS對上述相同的樣本集的總RNA進(jìn)行了測序，另外還有20個只有RNA的樣本拷肌，因此對數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析到旦，以評估基因表達(dá)數(shù)據(jù)與所述擴(kuò)增/缺失模式的一致性以及融合轉(zhuǎn)錄物的存在。關(guān)于第一點巨缘，在大多數(shù)情況下觀察到DNA重排和基因數(shù)量之間有明顯的對應(yīng)關(guān)系添忘。這一點在19號染色體和22號染色體上得到了緩解，在19號染色體上若锁，擴(kuò)增的患者與未擴(kuò)增的樣本相比搁骑，同一染色體上的基因數(shù)總體上有增加的趨勢（圖3C），而在22號染色體上又固，顯示缺失的患者則出現(xiàn)了相反的情況（圖3D）仲器。對于第二點，根據(jù)方法中描述的過濾標(biāo)準(zhǔn)仰冠，在放棄低質(zhì)量樣本（66個樣本中的6個）后乏冀，檢測到20個融合轉(zhuǎn)錄物。其中大多數(shù)只在1名患者中發(fā)現(xiàn)洋只，少數(shù)在2或3名患者中發(fā)現(xiàn)（圖3A）辆沦。有趣的是昼捍，盡管MTC組織很少出現(xiàn)融合轉(zhuǎn)錄物，證實這種類型的腫瘤中染色體重排事件的頻率很低众辨，但在本研究隊列中端三，有兩名MTC患者檢索到了以前在高級別漿液性卵巢癌中發(fā)現(xiàn)的融合物AL391840.3-SH3BGRL2。需要進(jìn)一步的實驗來研究這些重排在NENs發(fā)展和患者生存中的功能意義鹃彻。
03 - NEN的miRNome剖析
????????為了研究miRNA的表達(dá)譜郊闯，試圖鑒定可作為NEN生物標(biāo)志物的去調(diào)控分子，進(jìn)行了small-RNA-Seq蛛株，使623個miRNA在GEP-NENs和MTCs中普遍表達(dá)（圖4A）团赁。
????????對它們在研究樣本中表達(dá)的靶mRNAs進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)它們參與了神經(jīng)和內(nèi)分泌癌癥相關(guān)的途徑谨履，如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤欢摄、膠質(zhì)瘤和胰腺癌的信號傳導(dǎo)，以及其他具體參與腫瘤發(fā)展和進(jìn)展的途徑笋粟，包括上皮粘連連接怀挠、TGF-β、PTEN和NGF信號傳導(dǎo)（圖4B）害捕。由于缺乏配對的或獨立的正常組織绿淋，不可能確定癌癥樣本中不同表達(dá)的編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。盡管如此尝盼，僅考慮GEP-NEN組織吞滞，作者評估了不同等級之間差異表達(dá)的miRNAs的可能證據(jù)，情況確實如此盾沫。正如其他研究小組已經(jīng)假設(shè)的那樣裁赠，一組miRNAs，在本研究案例中是52個赴精，在NETs和NECs之間有明顯的差異表達(dá)佩捞，其中一些似乎也能區(qū)分腫瘤等級。為了確定可能的循環(huán)NENs生物標(biāo)志物蕾哟，對3名患者進(jìn)行了small-RNA-Seq失尖，這些患者的組織和血清樣本都是可用的；同樣的組織之前進(jìn)行了多組學(xué)分析渐苏。這使得兩個MTC血清中的186個和176個miRNAs以及一個胰腺NET血清中的232個miRNAs得以識別掀潮；其中94%至98%的miRNAs也在相應(yīng)的組織中表達(dá)。然后琼富，考慮到在所分析的組織中表達(dá)量最大的100個miRNAs仪吧，NETs和NECs之間的差異表達(dá)，以及已發(fā)表的證據(jù)鞠眉，選擇了一組13個miRNAs進(jìn)行驗證薯鼠。驗證隊列由MTC和GEP-NEN患者組成择诈；前者被進(jìn)一步區(qū)分為散發(fā)性或遺傳性（MEN1）。對照組在年齡和性別上完全匹配出皇，總共有34名健康對照組和42名患者羞芍；在患者中只有2名是G3 NENs，因此不可能根據(jù)分泌的miRNAs對GEP-NEN等級進(jìn)行分層郊艘。具體考慮到被選定的miRNA子集靶向的mRNAs荷科，這些都與ERK/MAPK、mTOR纱注、HIF-1α畏浆、p53和ATM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)（圖4C）。
????????其中一些途徑特別是p53和ATM狞贱，也受到基因變異的影響（圖2D）刻获，因此表明在 NEN 發(fā)育和進(jìn)展過程中這種級聯(lián)的多層次失調(diào)。如圖4D所示瞎嬉，所有選定的miRNAs在患者中的表達(dá)量都比對照組高蝎毡，其中大多數(shù)可以明顯區(qū)分受腫瘤影響的人和健康受試者。另一方面氧枣，根據(jù)NEN的起源沐兵，即甲狀腺（MTC）、胰腺散發(fā)性（pNEN）挑胸、胰腺家族性（MEN1）或其他（主要包括腸道和肺部NENs）對患者血清進(jìn)行分組痒筒，發(fā)現(xiàn)一些miRNAs在特定的亞組中顯著失調(diào)宰闰。具體而言茬贵，miR143-3p在MEN1和其他NEN中顯著上調(diào)，miR144-3p和miR7-5p在MTC和MEN1中顯著上調(diào)移袍，miR942-5p在MEN1中顯著上調(diào)（圖 4E）解藻。相反，miR-375在所有不同的亞組中均顯著上調(diào)葡盗，它已經(jīng)被提出作為其他癌癥類型的循環(huán)生物標(biāo)志物螟左。然而，這種影響可能是由于亞組的相對規(guī)模觅够，需要更大的病例系列來證實這些數(shù)據(jù)胶背。
04 - 臨床上可操作的路徑預(yù)測
????????在被調(diào)查的NENs中，多組學(xué)分析揭示了經(jīng)常突變和重復(fù)的基因喘先、染色體重復(fù)/缺失钳吟、融合轉(zhuǎn)錄物和失調(diào)的miRNAs【秸總的來說红且，考慮到這些數(shù)據(jù)坝茎，作者進(jìn)行了功能分析，以突出受影響最大的路徑暇番，這些路徑可能是治療這些腫瘤的有用目標(biāo)嗤放。具體而言，考慮到數(shù)據(jù)集中最頻繁擴(kuò)增的基因壁酬，PTEN信號是受影響最明顯的（圖5A）次酌，特別是胰腺NENs。此外厨喂，已知與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有關(guān)的NGF信號傳導(dǎo)（圖5B）和措，包括本研究案例中一些最頻繁突變的基因。另一方面蜕煌，在失調(diào)的miRNA靶點中派阱，在圖5C中報告了那些明顯參與HIF1α信號傳導(dǎo)的miRNA（圖5C），已知RET在MTCs中被激活斜纪。相反贫母，考慮到受基因改變和miRNA失調(diào)影響的不同層次的途徑，在那些明顯富集的途徑中出現(xiàn)了描述良好的p53和新關(guān)聯(lián)的ATM信號盒刚，前者代表了治療這類癌癥的潛在新治療目標(biāo)腺劣。事實上，最后一個網(wǎng)絡(luò)因块，如圖5D所示橘原，包括失調(diào)的miRNA靶點、突變的基因涡上，其中MDM2和MDM4都是miRNA的下游靶點趾断，在一些分析的組織中也被檢索為擴(kuò)增的基因，加強(qiáng)了可能的多層次靶向的假設(shè)吩愧。
四芋酌、結(jié)論
????????本研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NENs的一種新的分子景觀，鑒定了一組可能作為NEN生物標(biāo)志物研究的循環(huán)miRNA雁佳，并建議將ATM及其輔助因子作為可能的分子靶點脐帝，與目前的治療方法相結(jié)合進(jìn)行測試。
