? ? ? ?作物遺傳育種需要發(fā)掘?qū)r(nóng)藝性狀有重要貢獻(xiàn)的QTL。某一重要農(nóng)藝性狀往往是由多個(gè)QTL調(diào)控吗铐。對(duì)這些QTL進(jìn)行精細(xì)定位找出對(duì)應(yīng)的基因?qū)ψ魑锏母牧季哂兄匾饬x息楔。本文對(duì)如何進(jìn)行精細(xì)定位進(jìn)行詳細(xì)的介紹妒峦，希望能拋磚引玉重斑，引出寶貴意見。
? ? ? ?對(duì)某一QTL進(jìn)行精細(xì)定位的前提是能將這一QTL先粗定位到一條染色體的某一特定區(qū)域舟山。而對(duì)QTL進(jìn)行初定位主要有兩種方法：GWAS和BSA-Seq绸狐。
? ? ? ?GWAS(Genome Wide Assosiated Study )即全基因組關(guān)聯(lián)分析。是利用自然群體或雜交群體在全基因組范圍內(nèi)分析哪些區(qū)域與目標(biāo)性狀之間存在相關(guān)性的一種方法累盗。如果利用自然群體進(jìn)行GWAS分析寒矿，發(fā)現(xiàn)某一QTL與目標(biāo)性狀存在顯著相關(guān)性，那么這一QTL在整個(gè)自然群體中的存在頻率是相對(duì)較高的若债。而如果僅僅用雜交群體后代進(jìn)行GWAS分析符相，則所得到的與目標(biāo)性狀呈顯著相關(guān)的QTL只是代表在雜交雙親中對(duì)這一相對(duì)性狀具有貢獻(xiàn)，但是在自然群體中則不一定能夠檢測(cè)出來(lái)蠢琳。通過(guò)GWAS分析啊终，我們能夠?qū)⒛繕?biāo)QTL定位于特定的染色體的特定區(qū)間內(nèi)。這相比較于一開始在全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)maker利用交換單株去確定QTL在某一條染色體傲须，能節(jié)省大量人力物力蓝牲。圖1的GWAS分析結(jié)果表明調(diào)控目標(biāo)性狀的QTL位于3號(hào)染色體上。且通過(guò)對(duì)染色體的進(jìn)一步分析泰讽，可以得知QTL所在3號(hào)染色體的具體區(qū)間例衍。通過(guò)GWAS分析確認(rèn)QTL位于三號(hào)染色體的某一具體區(qū)間后昔期，可以在這一區(qū)間設(shè)計(jì)maker對(duì)其進(jìn)行fine- mapping，最終找到目標(biāo)基因佛玄。
? ? ? ? BSA（Bulked Segregant Analysis）是利用極端性狀進(jìn)行功能基因挖掘的一種方法硼一。 主要思想是將雜交后代中兩個(gè)具有極端性狀的群體進(jìn)行混池測(cè)序，比較兩個(gè)群體在多態(tài)位點(diǎn)（SNP）的Allele Frequency（AF）是否具有顯著差異梦抢。
? ? ? ?BSA有一個(gè)前提假設(shè)：與目標(biāo)基因鄰近的marker會(huì)表現(xiàn)出連鎖不平衡現(xiàn)象般贼。例如與目標(biāo)基因鄰近的marker在后代群體中不會(huì)表現(xiàn)出自由組合的情況，而隨著與目標(biāo)基因的距離越遠(yuǎn)奥吩，則重組事件就越多哼蛆，最終與目標(biāo)基因不連鎖的marker會(huì)在兩個(gè)bulk DNA pool中沒(méi)有差異。早期BSA受限于marker少等因素而無(wú)法在全基因組上鑒定與目標(biāo)性狀連鎖的QTL或基因圈驼。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及價(jià)格的下降人芽，我們能在全基因組范圍內(nèi)篩選高密度marker望几，從而能在全基因組范圍內(nèi)將與目標(biāo)性狀連鎖的QTL/基因找到绩脆。
影響B(tài)SA結(jié)果的有效性主要有5個(gè)因素：
群體大小：群體越大橄抹，所包含的兩種極端群體數(shù)目就越多靴迫，表型差異就越大，群體足夠大甚至能精細(xì)定位一個(gè)基因
選擇率：兩個(gè)極端群體所選擇的個(gè)體占總?cè)后w的比例越小越好楼誓，最好能控制在5%以下
極端個(gè)體數(shù)目：兩個(gè)極端群體的極端個(gè)體數(shù)目越多玉锌，由于表型鑒定錯(cuò)誤導(dǎo)致的假陽(yáng)性率就會(huì)越低
標(biāo)記密度：標(biāo)記密度越高，假陽(yáng)性率就越低
表型準(zhǔn)確性：表型鑒定準(zhǔn)確是確保BSA成功的關(guān)鍵疟羹。只有確保極端群體的表型準(zhǔn)確才能確保BSA成功
? ? ? ? 由于GWAS和BSA的定位在精確度上存在一定缺陷主守，只能將QTL定位于特定染色體的某一較大區(qū)間。往往難以究竟是哪個(gè)基因調(diào)控目標(biāo)性狀榄融。因此需要在粗定位的基礎(chǔ)上進(jìn)行精細(xì)定位参淫。
? ? ? ? 在減數(shù)第二次分裂過(guò)程中，同源染色體的非姐妹染色單體之間會(huì)發(fā)生染色體聯(lián)會(huì)與交叉互換愧杯，在這一過(guò)程中涎才，染色體發(fā)生斷裂重組，會(huì)形成多種形式的配子力九。之后各種配子之間發(fā)生自由組合耍铜，最后能夠形成不同組合的合子體。這些合子體最后發(fā)育成個(gè)體跌前，這些個(gè)體之間的染色體組合就存在很大的差異棕兼。如一半染色體沒(méi)有發(fā)生交換，另外一半染色體在一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了交換抵乓。在fine-mapping的過(guò)程中伴挚，我們就是需要挑選這些在目標(biāo)區(qū)間一半染色體沒(méi)有發(fā)生染色體交叉互換蹭沛，而另外一半發(fā)生交換的交換單株。
? ? ? ?對(duì)于數(shù)量性狀章鲤，由于控制這一相對(duì)性狀的QTL眾多摊灭，首先需要確定哪一個(gè)或哪幾個(gè)QTL的表型的貢獻(xiàn)度（PVE,phenotype?variation?explained by QTL）最大，即這一相對(duì)性狀是受哪一個(gè)或哪幾個(gè)QTL調(diào)控的败徊。當(dāng)確定某一QTL在染色體所處的大致位置被知曉后帚呼，我們能夠在這一位置左右兩端設(shè)計(jì)一些SNP或者Indel marker。通過(guò)對(duì)某一F2代的全部子代（即F3代）進(jìn)行表型統(tǒng)計(jì)皱蹦，我們能夠判斷F3代是否發(fā)生性狀分離煤杀。由遺傳定律可知，當(dāng)合子的基因型是雜合時(shí)沪哺，雜合基因型控制的表型會(huì)隨著基因型的分離而分離沈自，而當(dāng)合子的基因型是純合時(shí)，由于純合基因型在自由組合時(shí)不會(huì)進(jìn)行分離辜妓，那么純合基因型控制的表型在后代也不會(huì)發(fā)生性狀分離枯途。因此通過(guò)統(tǒng)計(jì)F3代是否發(fā)生性狀分離可以反推F2代在QTL存在的區(qū)域是純合還是雜合狀態(tài)。如下圖所示籍滴，F(xiàn)2-1與F2-2的后代沒(méi)有發(fā)生性狀分離酪夷，這表明QTL所在的區(qū)域是純合基因型，因此QTL在Indel marker 3的右側(cè)孽惰，而F2-3的后代發(fā)生了性狀分離晚岭，表明在F2-3中，QTL的基因型是雜合的勋功，故QTL是在Indel marker 2的右側(cè)坦报。通過(guò)以上的方法，利用合適的交換單株,目標(biāo)QTL最終能夠被鎖定在很小的區(qū)間狂鞋，有時(shí)甚至能將QTL鎖定在只含有一個(gè)注釋基因的區(qū)域內(nèi)片择，從而實(shí)現(xiàn)QTL的精細(xì)定位。對(duì)于數(shù)量性狀要销，如果用F2:3群體進(jìn)行fine mapping,?我們需要知道每一個(gè)F3群體中每個(gè)個(gè)體的基因型构回，根據(jù)F3子代個(gè)體的基因型與對(duì)應(yīng)表型是否分離判斷對(duì)應(yīng)target QTL是位于雜合區(qū)還是純合區(qū)。而對(duì)于一個(gè)由未知QTL控制的質(zhì)量性狀疏咐，我們只需要鑒定F3子代的表型纤掸，無(wú)需知道每個(gè)F3個(gè)體的基因型就能確定其對(duì)應(yīng)的F2代個(gè)體QTL所在區(qū)域的基因型。
