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本次課程的內(nèi)容分三大部分：

質(zhì)譜儀的原理濒析、使用與維護(hù)

納升型液相色譜儀的使用與維護(hù)

生物質(zhì)譜運(yùn)行狀態(tài)的評(píng)估

液相色譜儀

1906年正什，一位叫Tsweet的俄國(guó)科學(xué)家，發(fā)現(xiàn)了這么一個(gè)現(xiàn)象：在一個(gè)玻璃管里放了一些碳酸鈣的粉末号杏，也就是石灰粉婴氮，然后把胡蘿卜搗碎后的石油醚提取液加到柱子里，隨著石油醚的流動(dòng)盾致，他發(fā)現(xiàn)在柱子上形成不同的色帶主经，其實(shí)就是胡蘿卜里包含的各種色素在碳酸鈣柱子里被分離開了。由于觀察到不同的色帶绰上，所以他管這種現(xiàn)象叫色譜旨怠。

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我們通過下面的示意圖來理解一下這個(gè)現(xiàn)象的原理。胡蘿卜提取液中含有不同的色素蜈块，柱子上的碳酸鈣會(huì)對(duì)這些色素產(chǎn)生形成吸附作用鉴腻，而不同的色素迷扇，因?yàn)槔砘再|(zhì)不同，則與碳酸鈣固定相的吸附作用力也不同爽哎。吸附力強(qiáng)的色素蜓席，在里面停留的時(shí)間就會(huì)長(zhǎng)一些，比如說圖中的黃色物質(zhì)课锌，它是最后被洗下來的厨内，而吸附力弱的色素，比如綠色的物質(zhì)渺贤，就很容易被石油醚沖下來雏胃，所以它第一個(gè)被洗脫。

所以色譜分離的原理就是利用待分離物質(zhì)與固定相（比如上例中的碳酸鈣柱子）和流動(dòng)相（比如用來沖洗色素的石油醚）之間相互作用的差異來實(shí)現(xiàn)分離志鞍。

根據(jù)相互作用類型的不同瞭亮，色譜法又可以分為：

--吸附色譜法：物理吸附法

--分配色譜法：根據(jù)溶解度的不同，卻多肽疏水性的差異

--離子交換色譜法：根據(jù)多肽等電點(diǎn)的差異固棚，依靠陰陽(yáng)離子相互作用

--尺寸排阻色譜法：根據(jù)分子尺寸和分子量的不同

--親和色譜法：利用抗原抗體和其它特異性作用

目前统翩，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，用得最多的就是分配色譜法此洲，就是根據(jù)樣品在固定相與流動(dòng)相之間溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)多肽或蛋白的分離厂汗。實(shí)際上是利用了多肽或蛋白疏水性上的差異。

說到這里呜师，問題就來了：在上一個(gè)例子中娶桦，固定相是碳酸鈣粉末，是固體匣掸，那么蛋白或者多肽怎么可能會(huì)溶解到固體中去呢趟紊？

這里我們需要解釋一下液相色譜的固定相氮双。我們用的反相液相色譜的固定相叫做鍵合多孔硅膠碰酝。如果在電鏡下將這種材料顆粒放大，就能看到它的表面是一種多孔的結(jié)構(gòu)戴差，長(zhǎng)得有點(diǎn)像核桃的表面送爸。

它的表面并不是純粹的二氧化硅，而是通過化學(xué)修飾的方法暖释，鍵合上去一些C18（十八烷基硅烷）袭厂。比如下面這個(gè)反應(yīng)的示意圖：

硅膠的表面是二氧化硅，水化之后形成硅羥基球匕，然后通過化學(xué)反應(yīng)纹磺，把圖中含有Si, Cl, C的化合物結(jié)合到二氧化硅上去，形成長(zhǎng)鏈烷烴的結(jié)構(gòu)亮曹。長(zhǎng)鏈烷烴其實(shí)就是一種油橄杨，通過這種化學(xué)反應(yīng)秘症，相當(dāng)于在二氧化硅的表面涂上了一層油膜，只不過這不是簡(jiǎn)單的涂抹式矫，是“化學(xué)涂抹”乡摹，連接上去的油層是很穩(wěn)定牢靠的。于是采转，多肽就可以溶解在這層穩(wěn)定的油膜里聪廉。所以，對(duì)于疏水性更強(qiáng)的多肽故慈，更容易溶解在油膜里板熊，親水性強(qiáng)的多肽，則不容易溶解在油膜里察绷，于是就實(shí)現(xiàn)了不同極性多肽的分離邻邮。

這種顆粒有多大呢？我們常用的液相色譜填料的顆粒直徑是在1.7μm - 5μm之間克婶，是非常小的筒严，與之前Tsweet例子里用的碳酸鈣粉末完全不在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，碳酸鈣粉末顆粒的直徑是在100μm-200μm之間情萤。

明白了液相色譜的原理以后鸭蛙，我們來學(xué)習(xí)一下它的構(gòu)成，主要有四個(gè)部分：

色譜儀組成

1筋岛、 色譜柱：玻璃柱+固定相

2娶视、 流動(dòng)相輸送系統(tǒng)：對(duì)于Tsweet那個(gè)實(shí)驗(yàn)，沒有專門的輸送系統(tǒng)睁宰，是靠重力使得樣品流過固定相肪获。對(duì)于現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)來講，我們用的色譜柱填料是非常細(xì)的柒傻，只有一點(diǎn)幾微米到幾微米孝赫，這時(shí)候靠重力是很難讓流動(dòng)相流下來的，而是需要用一個(gè)泵來把流動(dòng)相擠壓下去红符。所以液相色譜要配一個(gè)泵系統(tǒng)青柄，來輸送流動(dòng)相。

3预侯、 進(jìn)樣系統(tǒng)：對(duì)于Tsweet實(shí)驗(yàn)致开，只需要用手把樣品倒進(jìn)柱子里，就算進(jìn)樣了萎馅。而現(xiàn)在我們都是用密封的系統(tǒng)双戳，需要一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器來完成。

4糜芳、 檢測(cè)系統(tǒng)：現(xiàn)在常用的有紫外或熒光飒货，最簡(jiǎn)單的就是用肉眼來觀察是否有樣品流出千诬。

一個(gè)液相色譜儀，通常就是由這四個(gè)模塊組成膏斤。我們來看下面兩個(gè)實(shí)物圖徐绑。左邊是戴安的液相色譜儀，從上往下依次是泵系統(tǒng)莫辨、進(jìn)樣系統(tǒng)傲茄、柱系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，右邊是Waters的液相色譜儀沮榜，也是類似的結(jié)構(gòu)盘榨。

對(duì)于我們蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，常用的液相色譜儀是納升液相色譜蟆融。它與普通的液相色譜最大的區(qū)別就在管子的粗細(xì)和流速上草巡。下圖是納升液相色譜的管路和接頭與常規(guī)液相色譜的比較。

首先型酥，從外觀上我們也能看出很大的不同山憨。常規(guī)液相色譜的柱子內(nèi)徑是在1-5mm，而納升液相色譜柱子就細(xì)了很多弥喉，與連接的管路粗細(xì)幾乎是一樣的郁竟，看上去就像一根線。加上外面的保護(hù)皮由境，這根線的外徑也只有360μm棚亩，如果把保護(hù)皮扒掉，外徑大概只有110μm-120μm虏杰，內(nèi)徑只有50μm讥蟆。與常規(guī)的液相色譜柱相比，相當(dāng)于把柱子的直徑縮小了20-100倍纺阔。

當(dāng)我們把柱子的內(nèi)徑縮小了20-100倍以后瘸彤，流動(dòng)相的流速也相應(yīng)地變緩了很多。常規(guī)液相色譜的流動(dòng)相流速通常是在0.2-1ml/min州弟，而納升液相色譜卻只有50-300nL/min钧栖，這與常規(guī)液相色譜的流速比低零，下降了1000倍婆翔。

那么，為什么我們需要將流速下降1000倍呢掏婶？要回答這個(gè)問題啃奴，我們先來看看下面這張納升色譜與常規(guī)色譜靈敏度的對(duì)比圖。

我們分析2 pmol的肌紅蛋白酶解產(chǎn)物雄妥，在不同直徑的柱子中的靈敏度最蕾。比如依溯，在4.6mm的柱子里，流速為1ml/min瘟则，我們幾乎是看到紫外信號(hào)的黎炉；當(dāng)我們把色譜柱逐漸縮細(xì)到1mm、300μm醋拧，直到180μm的時(shí)候慷嗜，我們就可以看到非常清晰的紫外吸收峰，也就是酶解產(chǎn)物的譜圖丹壕。

為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢庆械？

我們來回顧一下，當(dāng)常規(guī)液相色譜的流速是1ml/min時(shí)菌赖，也就是說缭乘，我的樣品會(huì)被1mL/min的液相所稀釋，而當(dāng)我們用納升液相色譜時(shí)琉用，我們會(huì)把流速降到300nL/min堕绩，相比于1mL/min，流速下降了3000倍邑时，也就是說逛尚，樣品被變相地濃縮了3000倍。由于樣品的濃度被變相提高了很多刁愿，所以檢測(cè)的靈敏度也就相應(yīng)提高了绰寞。

這就是為什么我們要使用納升液相色譜，就是為了減少樣品被流動(dòng)相稀釋的倍數(shù)铣口，從而提高檢測(cè)的靈敏度滤钱。

那么，納升液相色譜儀從外部看脑题，有什么特點(diǎn)呢件缸？其實(shí)它與常規(guī)液相色譜儀使用的泵都是一樣的，但是管路這部分是不同的叔遂。下面是一個(gè)實(shí)物圖他炊，右側(cè)的局部圖展示的是流量控制器，進(jìn)樣的管路還是跟常規(guī)管路一樣已艰，是100mm的內(nèi)徑痊末，而流出的管路外徑就變成了180μm，內(nèi)徑只有50μm哩掺，用了非常細(xì)的色譜柱凿叠，可以縮減流動(dòng)過程中體積的延遲，或者梯度的延遲。

Tips

梯度延遲是指梯度洗脫時(shí)色譜泵改變梯度后盒件，色譜柱感受到這個(gè)變化所需要的延遲時(shí)間蹬碧。常規(guī)液相色譜的梯度延遲約100-400微升，0.2-0.5 min炒刁，納升液相色譜約1-5微升恩沽，5-15分鐘。

介紹完液相色譜儀翔始，我們?cè)龠M(jìn)一步說說飒筑，它是怎么與質(zhì)譜儀聯(lián)用的。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

實(shí)際上绽昏，對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究來說协屡，液相色譜和質(zhì)譜是不能單獨(dú)工作的，它們必須聯(lián)機(jī)工作全谤，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)肤晓。那它們是怎么實(shí)現(xiàn)聯(lián)機(jī)的呢？可能你會(huì)說认然，弄個(gè)接口連起來唄补憾！小編也覺得這是最直接的解決方案，但問題是卷员，需要什么樣的接口盈匾？

要回答這個(gè)問題，我們先來看看將液相色譜和質(zhì)譜連接起來毕骡，需要面對(duì)哪些挑戰(zhàn)削饵？液相色譜儀是在常溫常壓下工作的，柱子是放在空氣中運(yùn)行的未巫，而且樣品是溶解在流動(dòng)相（水或有機(jī)溶劑）當(dāng)中的窿撬。而質(zhì)譜儀需要在真空環(huán)境下工作，樣品需要從溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)叙凡，而且需要被電離劈伴。所以總的來說，我們需要一個(gè)電離源握爷，能把樣品從常溫常壓的液相狀態(tài)直接變成真空中的氣態(tài)離子狀態(tài)跛璧。

我們?cè)賮硎崂硪幌逻@個(gè)電離源需要具備的功能：

電離源功能

功能一：去溶劑和氣化，把樣品中的溶劑去掉新啼，將待檢測(cè)的多肽分子變成多肽的氣態(tài)分子追城；

功能二：將多肽的氣態(tài)分子離子化，讓它們帶上電荷师抄；

功能三：把多肽的氣態(tài)離子送到真空當(dāng)中漓柑。

僅用一個(gè)電離源，就能同時(shí)實(shí)現(xiàn)這么多的功能叨吮？聽上去貌似是件很難完成的任務(wù)辆布！然后，就有這樣一種技術(shù)被機(jī)智的人類發(fā)現(xiàn)了出來茶鉴，很好地實(shí)現(xiàn)了上述功能锋玲，它就是ESI，即電噴霧電離涵叮！順便說一句惭蹂，這個(gè)技術(shù)的發(fā)明者，John Fenn割粮，在2003年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)盾碗。

ESI的主要原理是這樣的：樣品首先通過一個(gè)毛細(xì)管噴針，被噴出來馅笙，進(jìn)入質(zhì)譜儀珍特。而在噴針的外面壳鹤，會(huì)用一個(gè)鞘氣（sheath gas）來輔助樣品的霧化。這其實(shí)跟我們用的噴霧器或者噴壺是非常相似的道理航缀。如果壓噴壺，噴壺里的氣或者水就會(huì)噴出來堰怨。

但是噴出來這一步芥玉，只能解決樣品的霧化問題，樣品實(shí)際上還是溶解在流動(dòng)相中的备图。所以我們會(huì)對(duì)鞘氣進(jìn)行加熱灿巧，當(dāng)加熱的鞘氣吹到樣品中或者溶液中時(shí)，溶液中的流動(dòng)相或者溶劑就會(huì)揮發(fā)揽涮，就會(huì)剩下氣態(tài)的離子砸烦。

同時(shí)，在毛細(xì)管噴針尖端與質(zhì)譜儀的入口之間绞吁，還會(huì)加一個(gè)電壓幢痘，叫High voltage，對(duì)這些待電離的分子家破，首先溶劑揮發(fā)掉颜说，然后分子被氣化，最后在電場(chǎng)的作用下汰聋，分子就會(huì)變成離子门粪，實(shí)現(xiàn)電離的過程。然后烹困，這些離子會(huì)被質(zhì)譜儀入口處的真空抽到質(zhì)譜儀里玄妈，同時(shí)被電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)進(jìn)入質(zhì)譜儀。于是，就實(shí)現(xiàn)了氣化拟蜻、電離以及真空過渡三重需求绎签。這就是液相色譜與質(zhì)譜的接口，即ESI電噴霧電離酝锅。示意圖如下：

對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究來說诡必，由于我們前面分離樣品的時(shí)候使用的是納升液相色譜，所以ESI電離源也需要做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)搔扁，來適應(yīng)納升液相的特點(diǎn)爸舒，這種ESI我們叫做nanoESI，即納升電離源稿蹲。

對(duì)于普通的電離源扭勉，當(dāng)使用鞘氣的時(shí)候，電離源可以承受的流速通常是在0.1mL/min – 1mL/min苛聘，而納升電離源的流速只有100-500nL/min涂炎，這種超低流速下我們已經(jīng)不需要用鞘氣來輔助噴霧，只需要依靠樣品自身的揮發(fā)焰盗，以及樣品的噴針針尖與質(zhì)譜儀入口的電壓差璧尸，就可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的噴霧。也就是說熬拒，在這種情況下爷光，我們只需要把噴針針尖的開口做得非常細(xì)（通常開口內(nèi)徑是在3-10μm），并且只需要1.5 -2.5kV的電壓澎粟，就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定的噴霧蛀序。

樣品通過這個(gè)噴針出來以后，就會(huì)發(fā)生霧化氣化活烙，溶劑蒸發(fā)掉徐裸，然后樣品發(fā)生電離，進(jìn)入質(zhì)譜啸盏。下面就是nanoESI的實(shí)物細(xì)節(jié)圖重贺，右下角就是噴針的特寫照。