1. Cell重磅！RNA編輯技術(shù)迎來新飛躍：CasRx展現(xiàn)非凡RNA編輯能力
從簡單地剪切致病基因翅楼，到開發(fā)出不再傳播疾病的工程動(dòng)物每聪，基因編輯技術(shù)已經(jīng)釋放出巨大的潛力。隨著研究的深入矗漾，科學(xué)界還發(fā)現(xiàn)，除了編輯具有遺傳訊息的DNA片段薄料，編輯RNA可以在不改變基因組的情況下缩功，幫助調(diào)整基因表達(dá)方式，此外都办，RNA的壽命是相對短暫的嫡锌，這也意味著它的變化是可以逆轉(zhuǎn)的，從而避免基因工程中的巨大風(fēng)險(xiǎn)琳钉。
2017年10月势木，來自Broad研究所的張鋒研究團(tuán)隊(duì)在《自然》期刊上發(fā)表了題為“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次將CRISPR-Cas13系統(tǒng)公之于眾歌懒，證實(shí)了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的RNA啦桌。僅僅時(shí)隔三周，又一篇名為“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作發(fā)表于《科學(xué)》期刊。在該研究中，張鋒研究團(tuán)隊(duì)再次展示了這一RNA編輯系統(tǒng)亡资，能有效地對RNA中的腺嘌呤進(jìn)行編輯。
在CRISPR出現(xiàn)之前板驳，RNAi是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的理想方法。但是Cas13a酶一大優(yōu)勢在于更強(qiáng)的特異性碍拆，而且這種本身來自細(xì)菌的系統(tǒng)對哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說若治，并不是內(nèi)源性的慨蓝，因此不太可能干擾細(xì)胞中天然的轉(zhuǎn)錄。相反端幼，RNAi利用內(nèi)源性機(jī)制進(jìn)行基因敲除礼烈，對本身的影響較大。但CRISPR-Cas13系統(tǒng)還有一個(gè)重要的問題婆跑，Cas13a酶本質(zhì)上是一種相對較大的蛋白質(zhì)此熬，因此很難被包裝到靶組織中，這也可能成為RNA編輯技術(shù)臨床應(yīng)用的一大障礙滑进。
2018年3月16日犀忱，一項(xiàng)發(fā)表在《細(xì)胞》期刊的重磅成果為RNA編輯技術(shù)帶來一大步飛躍，來自美國Salk研究所的科學(xué)家利用全新的CRISPR家族酶擴(kuò)展了RNA編輯能力郊供，并將這個(gè)新系統(tǒng)命名為“CasRx”峡碉。
CasRx（品紅色）在人類細(xì)胞核中靶向RNA（灰色）近哟，Salk研究所
“生物工程師就像自然界的偵探一樣驮审，在DNA模式中尋找線索來幫助解決遺傳疾病。CRISPR徹底改變了基因工程吉执，我們希望將編輯工具從DNA擴(kuò)展到RNA疯淫。”研究領(lǐng)導(dǎo)者Patrick Hsu博士表示戳玫，“RNA信息是許多生物過程的關(guān)鍵介質(zhì)熙掺。在許多疾病中，這些RNA信息失去了平衡咕宿，因此直接靶向RNA的技術(shù)將成為DNA編輯的重要補(bǔ)充币绩。”
除了高效性且無明顯脫靶效應(yīng)府阀，新系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵特征是其依賴于一種比以前研究中物理尺寸更小的酶缆镣。這對RNA編輯技術(shù)至關(guān)重要，這使得該編輯工具能夠更容易被包裝到病毒載體试浙，并進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行RNA編輯董瞻。來自東京大學(xué)的科學(xué)家Hiroshi Nishimasu并未參與這項(xiàng)研究，他表示：“在這項(xiàng)研究中田巴，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種較Cas13d更加‘緊湊’的酶CasRx钠糊。從基礎(chǔ)研究到治療應(yīng)用，我認(rèn)為CasRx將成為非常有用的工具壹哺〕椋”
此外，在這項(xiàng)研究中管宵，研究人員還展示了利用這種新型RNA編輯系統(tǒng)來糾正RNA過程的能力逝慧。他們將CasRx包裝到病毒載體中昔脯，并將其遞送到利用額顳葉癡呆（FTD）患者干細(xì)胞中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，最終使tau蛋白水平恢復(fù)到健康水平上笛臣，有效率達(dá)到80%云稚。
Patrick Hsu博士最后說道：“基因編輯技術(shù)通過對DNA的切割帶來基因序列的改變。在經(jīng)過基因編輯的細(xì)胞中沈堡，其效果是永久的静陈。雖然基因編輯技術(shù)能夠很好地將基因完全關(guān)閉，但對調(diào)節(jié)基因的表達(dá)上并不那么優(yōu)秀诞丽。展望未來鲸拥，這一最新工具將在RNA生物學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，并有望在未來憑借該技術(shù)對RNA相關(guān)疾病進(jìn)行治療僧免⌒谈希”
該研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合，通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方式懂衩，將CasRx系統(tǒng)和靶向Pten基因的sgRNA導(dǎo)入到小鼠肝臟細(xì)胞中撞叨，成功在小鼠肝臟中實(shí)現(xiàn)了Pten的高效沉默。
3月18日浊洞，《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》期刊在線發(fā)表了《Cas13d介導(dǎo)的肝臟基因表達(dá)下調(diào)對代謝功能的調(diào)控》的研究論文牵敷，該研究由中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心法希、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組和上杭喜停科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院黃鵬羽研究組合作完成。該研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合苫亦，通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方式毛肋，將CasRx系統(tǒng)和靶向Pten基因的sgRNA導(dǎo)入到小鼠肝臟細(xì)胞中，成功在小鼠肝臟中實(shí)現(xiàn)了Pten的高效沉默屋剑，證實(shí)了CasRx系統(tǒng)在成體動(dòng)物體內(nèi)也具有靶向沉默RNA的活性润匙，通過增強(qiáng)下游蛋白AKT的磷酸化，影響了糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)饼丘。同時(shí)趁桃，利用AAV遞送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝臟，有效降低了肝臟中PCSK9的蛋白表達(dá)肄鸽，以及小鼠血液中的膽固醇水平卫病。這為治療后天性的代謝疾病提供了新方案。
同時(shí)典徘，楊輝研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第一人民醫(yī)院孫曉東研究組合作蟀苛，也探究了CasRx預(yù)防嚴(yán)重的眼部疾病——年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）的可能性，研究人員發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以顯著減少AMD小鼠模型中脈絡(luò)膜新血管形成（CNV）的面積逮诲，驗(yàn)證了將RNA靶向的CRISPR系統(tǒng)用于治療應(yīng)用的潛力帜平。相關(guān)研究論文《CasRx介導(dǎo)的RNA靶向策略可防止年齡相關(guān)的黃斑變性的小鼠模型中的脈絡(luò)膜新生血管形成》3月3日在《國家科學(xué)評(píng)論》在線發(fā)表幽告。
近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)因其強(qiáng)大且便捷的DNA編輯能力而受到廣泛關(guān)注裆甩。2016年冗锁，張鋒實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA進(jìn)行切割嗤栓。之后人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了靶向RNA的Cas13b, Cas13c冻河。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特點(diǎn)，理論上在一些特定疾病的檢測和治療上具有獨(dú)特優(yōu)勢茉帅，因而成為近年來的研究熱點(diǎn)叨叙。2018年，加州大學(xué)伯克利分校Patrick Hsu實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了Cas13d家族堪澎。他們發(fā)現(xiàn)與RNA干擾技術(shù)相比擂错，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默具有更高的特異性（與數(shù)百個(gè)shRNA脫靶相比，Cas13d沒有脫靶）和敲除效率（Cas13d達(dá)到96％樱蛤，shRNA達(dá)到65％）钮呀。而與Cas9介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)相比，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默不會(huì)改變基因組DNA刹悴，因此這種基因沉默是可逆的行楞，從而對一些后天性疾苍芟尽（如因不良生活習(xí)慣導(dǎo)致的高血脂等后天代謝性疾餐猎取）的治療更有優(yōu)勢。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于體積小形用，效率高就轧，被認(rèn)為是在未來應(yīng)用中最具有優(yōu)勢的Cas13蛋白。
此前的工作都在細(xì)胞水平證明了CasRx的高效性和特異性田度，楊輝研究組的這兩篇文章則更進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)證明了CasRx的活性妒御，為臨床提供了可能性。為證明CasRx在動(dòng)物體內(nèi)的活性镇饺，研究人員分別針對目的基因進(jìn)行了sgRNA的體外篩選乎莉，然后采用尾靜脈注射敲低Pten的質(zhì)粒、尾靜脈注射敲低Pcsk9的AAV8病毒奸笤、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒惋啃。對注射后的小鼠進(jìn)行相應(yīng)分析，分別得到Pten基因下調(diào)及其下游蛋白AKT的磷酸化上調(diào)监右，Pcsk9下調(diào)造成血清膽固醇下調(diào)边灭；Vegfa下調(diào)顯著減少AMD小鼠模型中脈絡(luò)膜新血管形成（CNV）的面積。
2. 關(guān)于CasRx在動(dòng)物體內(nèi)靶向沉默RNA的應(yīng)用成果
2020年3月18日健盒，《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》期刊在線發(fā)表了《Cas13d介導(dǎo)的肝臟基因表達(dá)下調(diào)對代謝功能的調(diào)控》的研究論文绒瘦，該研究由中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）称簿、上海腦科學(xué)與類腦研究中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組和上憾杳保科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院黃鵬羽研究組合作完成憨降。該研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合，通過尾靜脈注射質(zhì)粒的方式该酗，將CasRx系統(tǒng)和靶向Pten基因的sgRNA導(dǎo)入到小鼠肝臟細(xì)胞中券册，成功在小鼠肝臟中實(shí)現(xiàn)了Pten的高效沉默，證實(shí)了CasRx系統(tǒng)在成體動(dòng)物體內(nèi)也具有靶向沉默RNA的活性垂涯，通過增強(qiáng)下游蛋白AKT的磷酸化烁焙，影響了糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)耕赘，利用AAV遞送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝臟骄蝇，有效降低了肝臟中PCSK9的蛋白表達(dá)，以及小鼠血液中的膽固醇水平操骡。這為治療后天性的代謝疾病提供了新方案九火。
同時(shí)，楊輝研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第一人民醫(yī)院孫曉東研究組合作册招，也探究了CasRx預(yù)防嚴(yán)重的眼部疾病——年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）的可能性岔激，研究人員發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以顯著減少AMD小鼠模型中脈絡(luò)膜新血管形成（CNV）的面積**，驗(yàn)證了將RNA靶向的CRISPR系統(tǒng)用于治療應(yīng)用的潛力是掰。相關(guān)研究論文《CasRx介導(dǎo)的RNA靶向策略可防止年齡相關(guān)的黃斑變性的小鼠模型中的脈絡(luò)膜新生血管形成》3月3日在《國家科學(xué)評(píng)論》在線發(fā)表虑鼎。
近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)因其強(qiáng)大且便捷的DNA編輯能力而受到廣泛關(guān)注键痛。2016年炫彩，張鋒實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA進(jìn)行切割絮短。之后人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了靶向RNA的Cas13b, Cas13c江兢。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特點(diǎn)，理論上在一些特定疾病的檢測和治療上具有獨(dú)特優(yōu)勢丁频，因而成為近年來的研究熱點(diǎn)杉允。2018年，加州大學(xué)伯克利分校Patrick Hsu實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了Cas13d家族席里。他們發(fā)現(xiàn)與RNA干擾技術(shù)相比叔磷，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默具有更高的特異性（與數(shù)百個(gè)shRNA脫靶相比，Cas13d沒有脫靶）和敲除效率（Cas13d達(dá)到96％胁勺，shRNA達(dá)到65％）世澜。而與Cas9介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)相比，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默不會(huì)改變基因組DNA署穗，因此這種基因沉默是可逆的寥裂，從而對一些后天性疾睬锻荨（如因不良生活習(xí)慣導(dǎo)致的高血脂等后天代謝性疾病）的治療更有優(yōu)勢封恰。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于體積小麻养，效率高，被認(rèn)為是在未來應(yīng)用中最具有優(yōu)勢的Cas13蛋白诺舔。
此前的工作都在細(xì)胞水平證明了CasRx的高效性和特異性鳖昌，楊輝研究組的這兩篇文章則更進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)證明了CasRx的活性，為臨床提供了可能性低飒。為證明CasRx在動(dòng)物體內(nèi)的活性许昨，研究人員分別針對目的基因進(jìn)行了sgRNA的體外篩選，然后采用尾靜脈注射敲低Pten的質(zhì)粒褥赊、尾靜脈注射敲低Pcsk9的AAV8病毒糕档、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。對注射后的小鼠進(jìn)行相應(yīng)分析拌喉，分別得到Pten基因下調(diào)及其下游蛋白AKT的磷酸化上調(diào)速那，Pcsk9下調(diào)造成血清膽固醇下調(diào)；Vegfa下調(diào)顯著減少AMD小鼠模型中脈絡(luò)膜新血管形成（CNV）的面積尿背。
圖1 CasRx介導(dǎo)的Pten體內(nèi)體外的下調(diào)（Protein & Cell）
A.質(zhì)粒示意圖端仰；B.N2a細(xì)胞中Pten的下調(diào)；C.Western檢測PTEN及AKT的表達(dá)田藐； D.CasRx與shRNA脫靶比較荔烧；E.尾靜脈注射質(zhì)粒示意圖；F.G.H.免疫熒光坞淮，qPCR茴晋，western分別檢測Pten及p-AKT的表達(dá)
圖2 血清膽固醇的調(diào)節(jié)以及Pcsk9的可逆調(diào)控（Protein & Cell）
A.針對Pcsk9的AAV8病毒注射示意圖陪捷；B.肝組織中Pcsk9的表達(dá)量回窘；C.血清PCSK9的表達(dá)量；D.血清膽固醇水平市袖；E.F.血清ALT和AST的測定啡直；G.可逆調(diào)節(jié)注射示意圖； H.Pcsk9的動(dòng)態(tài)調(diào)控苍碟。
圖3 AAV介導(dǎo)CasRx減少了AMD小鼠模型中CNV的面積（National Science Review）
A.小鼠和人序列比較以及sgRNA示意圖酒觅；B.C.在293T和N2a細(xì)胞中敲低Vegfa；D.VEGFA蛋白的表達(dá)微峰；E.AAV病毒質(zhì)粒示意圖舷丹；F.實(shí)驗(yàn)流程圖；G.CasRx的mRNA表達(dá)水平蜓肆；H.I.激光燒傷之前或之后7天的Vegfa mRNA水平颜凯；J.CNV誘導(dǎo)3天后的VEGFA蛋白水平谋币；K.激光燒傷7天后，用PBS或AAV-CasRx-Vegfa注射的代表性CNV圖像症概；L.M.CNV面積統(tǒng)計(jì)蕾额。
3. Cell | 中科院楊輝/周海波團(tuán)隊(duì)利用 CasRx 將膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化，在神經(jīng)性疾病治療領(lǐng)域取得重大進(jìn)展
2020 年 4 月 8 日彼城，Cell 期刊在線發(fā)表了題為《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》的研究論文诅蝶，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、上海腦科學(xué)與類腦研究中心募壕、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊輝研究組完成调炬。
該項(xiàng)研究通過運(yùn)用最新開發(fā)的 RNA 靶向 CRISPR 系統(tǒng) CasRx 特異性地在視網(wǎng)膜穆勒膠質(zhì)細(xì)胞中敲低 Ptbp1 基因的表達(dá)，首次在成體中實(shí)現(xiàn)了視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生舱馅，并且恢復(fù)了永久性視力損傷模型小鼠的視力筐眷。同時(shí)，該研究還證明了這項(xiàng)技術(shù)可以非常高效且特異地將紋狀體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成多巴胺神經(jīng)元习柠，并且基本消除了帕金森疾病的癥狀匀谣。該研究將為未來眾多神經(jīng)退行性疾病的治療提供一個(gè)新的途徑。
人類的神經(jīng)系統(tǒng)包含成百上千種不同類型的神經(jīng)元細(xì)胞资溃。在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中武翎，神經(jīng)元一般不會(huì)再生，一旦死亡溶锭，就是永久性的宝恶。神經(jīng)元的死亡會(huì)導(dǎo)致不同的神經(jīng)退行性疾病，常見的有阿爾茲海默癥和帕金森癥趴捅。此類疾病的病因尚不明確且沒有根治的方法垫毙，因此對人類的健康造成巨大威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)拱绑，目前全球大約有 1 億多的人患有神經(jīng)退行性疾病综芥，而且隨著老齡化的加劇，神經(jīng)退行性疾病患者數(shù)量也將逐漸增多猎拨。
在常見的神經(jīng)性疾病中膀藐，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡導(dǎo)致的永久性失明和多巴胺神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的帕金森疾病是尤為特殊的兩類，它們都是由于特殊類型的神經(jīng)元死亡導(dǎo)致红省。我們之所以能看到外界絢爛多彩的世界额各，是因?yàn)槲覀兊难劬痛竽X中存在一套完整的視覺通路，而連接眼睛和大腦的神經(jīng)元就是視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞吧恃。
作為眼睛和大腦的唯一一座橋梁虾啦，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對外界的不良刺激非常敏感。研究發(fā)現(xiàn)很多眼疾都可以導(dǎo)致視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡，急性的如缺血性視網(wǎng)膜病傲醉，慢性的如青光眼针饥。視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞一旦死亡就會(huì)導(dǎo)致永久性失明。據(jù)統(tǒng)計(jì)需频，僅青光眼致盲的人數(shù)在全球就超過一千萬人丁眼。
帕金森疾病是一種常見的老年神經(jīng)退行性疾病。它的發(fā)生是由于腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)域中一種叫做多巴胺神經(jīng)元的死亡昭殉，從而導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元不能通過黑質(zhì)-紋狀體通路將多巴胺運(yùn)輸?shù)酱竽X的另一個(gè)區(qū)域紋狀體苞七。目前，全球有將近一千萬人患有此病挪丢，我國尤為嚴(yán)重蹂风，占了大約一半的病人。如何在成體中再生出以上兩種特異類型的神經(jīng)元乾蓬，一直是全世界眾多科學(xué)家努力的方向惠啄。
該研究中，研究人員首先在體外細(xì)胞系中篩選了高效抑制 Ptbp1 表達(dá)的 gRNA任内，設(shè)計(jì)了特異性標(biāo)記穆勒膠質(zhì)細(xì)胞和在穆勒膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá) CasRx 的系統(tǒng)撵渡。所有元件以雙質(zhì)粒系統(tǒng)的形式被包裝在 AAV 中并且通過視網(wǎng)膜下注射，特異性地在成年小鼠的穆勒膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào) Ptbp1 基因的表達(dá)死嗦。
大約一個(gè)月后趋距，研究人員在視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層發(fā)現(xiàn)了由穆勒膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)分化而來的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以像正常的細(xì)胞那樣對光刺激產(chǎn)生相應(yīng)的電信號(hào)越除。
研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)节腐，轉(zhuǎn)分化而來的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以通過視神經(jīng)和大腦中正確的腦區(qū)建立功能性的聯(lián)系，并且將視覺信號(hào)傳輸?shù)酱竽X摘盆。在視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的小鼠模型中翼雀，研究人員發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)分化的視神經(jīng)細(xì)胞可以讓永久性視力損傷的小鼠重新建立對光的敏感性。
為進(jìn)一步發(fā)掘 Ptbp1 介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化的治療潛能孩擂，研究人員證明了該策略還能特異性地將紋狀體中的星形膠質(zhì)細(xì)胞非常高效的轉(zhuǎn)分化為多巴胺神經(jīng)元狼渊，并且證明了轉(zhuǎn)分化而來的多巴胺神經(jīng)元能夠展現(xiàn)出和黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元相似的特性。
在行為學(xué)測試中肋殴，研究人員發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)分化而來的多巴胺神經(jīng)元可以彌補(bǔ)黑質(zhì)中缺失的多巴胺神經(jīng)元的功能囤锉，從而將帕金森模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙逆轉(zhuǎn)到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是护锤，雖然科學(xué)家們在實(shí)驗(yàn)室里取得了重要進(jìn)展，但是要將研究成果真正應(yīng)用于人類疾病的治療酿傍，還有很多工作要做：人類的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞能否再生烙懦？帕金森患者是否能通過該方法被治愈？這些問題有待全世界的科研工作者共同努力去尋找答案赤炒。
（上）CasRx 通過靶向的降解 Ptbp1 mRNA 從而實(shí)現(xiàn) Ptbp1 基因表達(dá)的下調(diào)氯析。
（中）視網(wǎng)膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特異性的將視網(wǎng)膜穆勒膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亏较，轉(zhuǎn)分化而來視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以和正確的腦區(qū)建立功能性的聯(lián)系，并且提高永久性視力損傷模型小鼠的視力掩缓。
（下）在紋狀體中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特異性的將星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為多巴胺神經(jīng)元雪情，從而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的運(yùn)動(dòng)癥狀。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome, but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
How were Cas13d enzymes discovered?
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
How do Cas13d enzymes compare to other Cas13s?
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
Yan et al.: WYL-domain-containing accessory protein WYL1 increases RspCas13d and EsCas13d cleavage activity
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here).
Konermann et al.: CasRx is a highly potent, specific editor in mammalian cells
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy. In this case, Konermann et al. targeted MAPT, the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
- Plasmids from this paper are available at Addgene.
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
Plasmids from this paper are available at Addgene.
Learn more about research at Arbor Biotechnologies.
參考資料：
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-020-00700-2
https://academic.oup.com/nsr/advance-article/doi/10.1093/nsr/nwaa033/5775464
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[https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html
