實驗室新服務(wù)器需要安裝cellranger酣衷，發(fā)現(xiàn)最新版（3.1.0）與舊版（1.2.0）有點差別，故整理流程如下：
1. 下載安裝
1.1下載地址
[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest)
wget -O cellranger-3.1.0.tar.gz "http://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-3.1.0.tar.gz?Expires=1564516562&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cDovL2NmLjEweGdlbm9taWNzLmNvbS9yZWxlYXNlcy9jZWxsLWV4cC9jZWxscmFuZ2VyLTMuMS4wLnRhci5neiIsIkNvbmRpdGlvbiI6eyJEYXRlTGVzc1RoYW4iOnsiQVdTOkVwb2NoVGltZSI6MTU2NDUxNjU2Mn19fV19&Signature=LjEM6kHZLAa-5QpBoR8adaynXbxxMczkx9hYBprJqYBTeM1duSTqNQ-kTe-qvNWY18C-mrjX0cql9jETFVUHIgQzh3UILSdzScAH82dk7iCaDPcsjpwkajQpR9gQf5Es2laj5yvRDw0vgd1OsifTn5XwDxc557Bba58mTxz5TChZsh1Apf~2sgQkDqh4toBRJXXfn7EzX~VbxI1x3ZOnyAqS0D1h54T5K6mL1ez3LPIRfk7WWifNs0dT4B6qcBHZ~vTjwo6kU2A2azM0EzUdnJvutdO1BoIaq4ymEjdvug4r8AEhAjnM7knc9CeGlTp9Pd7Fl5rneafCPw5sYfqfSw__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
1.2 安裝指南
[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/installation](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/installation)
1.2.1安裝cellranger
cd biosoft/ #（文件目錄）
tar -xzvf cellranger-3.1.0.tar.gz
1.2.2 添加環(huán)境變量便于調(diào)用
#臨時變量
export PATH=/biosoft/cellranger-3.1.0:$PATH
#當前用戶永久變量
vim ~/.bashrc
export PATH=“～/software/biosoft/cellranger-3.1.0:$PATH”
1.2.3基本命令
cellranger mkfastq #拆分
cellranger count #定量
cellranger aggr #標準化浅妆，見仁見智
cellranger reanalyze #分析
cellranger mat2csv
cellranger mkgtf #gtf索引
cellranger mkref # 索引
cellranger vdj
cellranger mkvdjref
cellranger testrun #測試
cellranger upload #問題反饋
cellranger sitecheck #系統(tǒng)檢測
1.2.4 references
cellranger 提供了集成human+mouse的參考索引。
下載安裝：
下載地址 wget http://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-cellranger-GRCh38-and-mm10-3.1.0.tar.gz
tar -xzvf refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0.tar.gz
自建索引：#針對3.1.0障癌，其他物種可以參考這種方式
參考：[https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/release-notes/build#grch38mm10_3.1.0](https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/release-notes/build#grch38mm10_3.1.0)
#以人為例
1.獲取fasta參考基因組
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
2.獲取gtf注釋文件
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-93/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf.gz
3.構(gòu)建cellranger調(diào)用gtf
cellranger mkgtf Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.gtf Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.filtered.gtf \
--attribute=gene_biotype:protein_coding \
--attribute=gene_biotype:lincRNA \
--attribute=gene_biotype:antisense \
--attribute=gene_biotype:IG_LV_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_V_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_V_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:IG_D_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_J_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_J_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:IG_C_gene \
--attribute=gene_biotype:IG_C_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_V_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_V_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_D_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_J_gene \
--attribute=gene_biotype:TR_J_pseudogene \
--attribute=gene_biotype:TR_C_gene
根據(jù)服務(wù)器配置時間長短略有不同狂打，我這里大概一分鐘。
4.構(gòu)建參考索引
cellranger mkref --genome=GRCh38 \
--fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
--genes=Homo_sapiens.GRCh38.97.chr.filtered.gtf \
--ref-version=3.1.0
這里cellranger用STAR構(gòu)建ref混弥，時長約半個小時趴乡。
也可以利用 cellranger mkref 將兩個物種ref合并。3.10版本建議直接采用合并方式蝗拿，以前均有單獨ref方式晾捏。
具體區(qū)別還得仔細看文檔。
此外哀托，舊服務(wù)器1.2版本還有ERCC reference惦辛，3.1中已被取消。10x不建議加ERCC仓手，Smart-seq2可以加胖齐。
1.2.5 測試
cellranger建議運行以下命令來看系統(tǒng)能否支持運算:
cellranger sitecheck > sitecheck.txt
cellranger upload your@email.edu sitecheck.txt
生成一個sitecheck.txt文件，記錄一些系統(tǒng)配置的東西嗽冒，如果配置不滿足呀伙，官網(wǎng)會發(fā)信給你。
1.2.6預(yù)運行
cellranger提供預(yù)運行檢查流程能否跑的通添坊。
cellranger testrun --id=tiny
會在當前目錄下生成tidy文件剿另，cellranger3.1下生成cellranger-tiny-fastq與cellranger-tiny-ref文件。
tiny下有tiny.mri.tgz，可以作為問題診斷指南雨女。
如果預(yù)運行失敗:
cellranger upload your@email.edu tiny/tiny.mri.tgz
發(fā)郵件給官網(wǎng)即可谚攒。
明天更新四個pipeline使用方法。接下來計劃為:
1.軟件探索
2.PBMC數(shù)據(jù)集使用
3.seurat在10x上的應(yīng)用
4.long ranger探索與使用
