參考：
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第一部分：ChIP-seq 簡介
- 首先了解兩個概念：
Cistrome: the set of cis-acting targets of a transacting factor on a genome scale.
Epigenome: a parallel to the word "genome"; the overall epigenetic state of a cell
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一般的雙端測序，R1/R2 比對到兩條鏈上面跟伏。通過Flag 可以提取比對到正反鏈的read,使用基因組瀏覽器可視化得到兩個峰圖丢胚。
（Tips:而ChIA-PET 也是雙端測序，但是R1/R2 可能同一條鏈)
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- 張勇老師開發(fā)出第一個peak callling 工具（macs,現(xiàn)在更新到macs3酬姆，由師弟劉濤維護Ｊ茸馈）
- ChIP-exo ： 從5 -end 進行酶切，提高TFBS分辨率,幾乎直接看peak,而不需要軟件找辞色。
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iChIP : 對不同細胞進行index,再進行抗體富集骨宠，運用到單細胞領域.
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不同的TF 結合模型：
一般TF是sharp peak.
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第二部分：ChIP-seq 實驗設計
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關于實驗重復及其測序深度：
- 以人類為例浮定，一般對于轉錄因子達到20M，寬峰達到40M read 比較好层亿。當然read越多越好桦卒，但是read 不太多，足以檢測結合比較強的位點匿又。
- 重復的問題方灾，由于剛開始的一些文章ChIP-seq沒有重復，帶了一個不好的頭碌更，后面慢慢要求2-3個重復（2-3個質量好的重復裕偿，不是做了3個重復就好）。
image.png 對照組：一般來說Input 和IgG 有一個就行痛单，對于一些特別容易富集的區(qū)域嘿棘，也就是假陽性，可以通過對照組來過濾掉旭绒。
第三部分：檢測ChIP質量
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通過IGV瀏覽器查看peak 是否明顯
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通過計算Frip 值：不同的TF鸟妙，F(xiàn)rip 大小不同，結合越強的位點挥吵，F(xiàn)rip 可能越高
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交聯(lián)系數：通過移動 計算正反鏈read 皮爾遜相關系數變化過程重父。
- 高質量的ChIP 正負鏈的peak ，移動到最大 重疊位置忽匈，相關系數最大房午，也就是圖中ChIP peak 位置。
image.png 同時比較兩個peak高度值脉幢，計算差異倍數歪沃，得到NSC/RSC 結果.下圖左邊為質量高的實驗結果.
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同時計算Frip 和NSC關系，兩者之間存在明顯的聯(lián)系.也就是說Frip 高的NSC,RSC 往往也較高嫌松。
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IDR 方法：此方法對于重復間質量好的樣本沪曙，IDR可能效果好，否則滿足條件的peak 會很少萎羔。
從B圖可知液走，20000左右的peak ,IDR （不可重復率）較低，也就是peak 很可信贾陷。
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也可以通過peak 區(qū)域motif 富集情況缘眶，評價質量好壞。
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通過序列保守型來看：也就是通過通過profile 圖反映出富集效果髓废。
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第四部分：完成項目后巷懈，需要提交哪些數據
第五部分：分析流程
- 第一步：數據比對
- 下一步：peak calling
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要發(fā)布的部分peak calling 工具
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下一步：差異peak 分析
- 定性問題：通過設置閾值，對兩組sample進行peak 差異位點分析慌洪。得到有無peak的差異結果顶燕，但是對于一些在閾值邊界的位置凑保，可能得到的差異peak 位點，存在假陽性問題涌攻。
- 定量問題：通過差異倍數欧引，及其顯著性來判斷差異peak. 對于組蛋白修飾來說，修飾水平的高度和表達強弱有關系恳谎；但是對于轉錄因子來說芝此，可能沒有太大影響。
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- 差異peak 目前的工具
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下一步：peak注釋
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下一步：motif 分析
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目前的工具
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下一步：靶基因預測
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也可以嘗試對TF進行敲除因痛，過表達研究目標基因.
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下一步：目標基因GO注釋
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思考
- 感覺做差異分析時候婚苹，定量分析采取Deseq2 或者DiffBind 結果差別較大時候，不好判斷選擇哪一個工具result.
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了解到ChIP-seq 靶基因尋找工具鸵膏。比如結合RNA-seq結果租副，判斷敲除TF,那些基因是差異基因。工具如BETA
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