文獻(xiàn)名稱(chēng)：教程：?jiǎn)渭?xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的計(jì)算分析指南
文獻(xiàn)期刊：nature protocols
發(fā)表時(shí)間：2021-1-9

摘要

單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù) (scRNA-seq) 是一種流行且功能強(qiáng)大的技術(shù)，可以分析大量單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜撰洗。然而灭袁，這些針對(duì)這些單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)的分析牛哺，需要專(zhuān)門(mén)的統(tǒng)計(jì)和計(jì)算方法坷衍。本篇文章瞧哟，我們概述涉及處理 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的計(jì)算工作流程。我們討論了一些最常見(jiàn)的分析任務(wù)和可用于解決核心生物學(xué)問(wèn)題的工具。在本文和我們的配套網(wǎng)站 (https://scrnaseq course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html) 中盐类，我們提供了執(zhí)行單細(xì)胞相關(guān)計(jì)算分析的最佳實(shí)踐的指南寞奸。本教程針對(duì)對(duì)他們自身數(shù)據(jù)感興的實(shí)驗(yàn)科研工作者以及尋求開(kāi)發(fā)新計(jì)算方法的生物信息學(xué)家。

簡(jiǎn)介

scRNA-seq 已成為一種革命性的技術(shù)在跳，用于表征復(fù)雜組織并回答bulk RNA-seq無(wú)法解決的問(wèn)題枪萄。自 2009年發(fā)布第一個(gè) scRNA-seq實(shí)驗(yàn)以來(lái)，已經(jīng)發(fā)布了許多單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)和商業(yè)平臺(tái)猫妙。當(dāng)前兩大主要的 scRNA-seq技術(shù)平臺(tái)是：
1.最常見(jiàn)的方法是使用微滴（microscopic droplets）或孔板（wells）來(lái)分離大量細(xì)胞瓷翻，然后對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序深度相對(duì)較淺地測(cè)序。為了識(shí)別給定轉(zhuǎn)錄本來(lái)自哪個(gè)細(xì)胞割坠，這些方法使用細(xì)胞條形碼（cellular barcodes齐帚，連接到每個(gè)read的短核苷酸標(biāo)簽，對(duì)于液滴或孔板是唯一的）彼哼。當(dāng)前主流的 10× Chromium 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)是典型的高通量对妄、低測(cè)序深度的范例。該技術(shù)的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是它支持唯一分子標(biāo)識(shí)符 (UMI)敢朱。UMI 是在PCR擴(kuò)增前附加到轉(zhuǎn)錄本上的短條形碼剪菱，從而可以去除PCR聚合酶鏈反應(yīng)重復(fù)拷貝，消除PCR擴(kuò)增偏好性拴签，獲得更準(zhǔn)確的基因表達(dá)水平估計(jì)孝常。 該技術(shù)一個(gè)主要缺點(diǎn)是該平臺(tái)僅允許對(duì)每個(gè)信使 RNA (mRNA) 的 5' 或 3' 端進(jìn)行測(cè)序。
2.但是篓吁，許多研究采取了相反的策略茫因，即分離相對(duì)較少的細(xì)胞蚪拦，但對(duì)它們進(jìn)行更深的測(cè)序杖剪。這些低通量、高測(cè)序深度的實(shí)驗(yàn)通常將細(xì)胞分離到單個(gè)孔中并應(yīng)用 Smart-seq2技術(shù)驰贷。除了最近引入的 Smart-seq3 實(shí)驗(yàn)技術(shù)外盛嘿，這些方法不支持 UMI，但它們通常表現(xiàn)出比基于液滴的技術(shù)更高的靈敏度括袒，并且它們還允許對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析次兆。有關(guān)不同平臺(tái)的詳細(xì)概述，請(qǐng)參閱最新的綜述和基準(zhǔn)測(cè)試锹锰。

除了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)工作流程之外芥炭，最近的創(chuàng)新還大大減少了scRNA-seq中每個(gè)細(xì)胞的成本。因此恃慧，用于分析的細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)园蝠。鑒于生成的大量數(shù)據(jù)，單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析需要有效的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法痢士。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的迅速改進(jìn)彪薛，用于處理數(shù)據(jù)的計(jì)算工作流程也得到了改進(jìn)。本教程的目的是概述最常見(jiàn)的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)分析類(lèi)型。本文旨在作為我們?yōu)橹v授 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的計(jì)算分析而開(kāi)發(fā)的課程材料 (https://scrnaseq-course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html) 的配套材料善延。該網(wǎng)站于 2016 年首次推出少态，并不斷更新以包含新方法并提供有關(guān)最佳實(shí)踐的最新建議。

scRNA-seq分析的一個(gè)核心組成部分是基因表達(dá)矩陣易遣，它表示每個(gè)基因種每個(gè)細(xì)胞觀(guān)察到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量彼妻。工作流程可分為兩個(gè)主要部分：1）生成基因表達(dá)矩陣；2）基因表達(dá)矩陣的分析（圖1和表1）训挡。雖然我們的在線(xiàn)教程包含這兩個(gè)方面澳骤，但在這里，我們將重點(diǎn)介紹在獲得基因表達(dá)矩陣后執(zhí)行的分析類(lèi)型澜薄。大多數(shù)基因僅在一部分細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)为肮，但是，由于起始材料的含量較低肤京，以及scRNA-seq實(shí)驗(yàn)中常用的測(cè)序深度較低颊艳，一些基因即使表達(dá)也無(wú)法檢測(cè)到。導(dǎo)致基因表達(dá)矩陣中存在大量零值忘分，這是有問(wèn)題的棋枕，因?yàn)橐恍┝阒悼赡艽砑?xì)胞中的實(shí)際低表達(dá)或零表達(dá)以及測(cè)量過(guò)程的變化。區(qū)分和適當(dāng)建模這些觀(guān)察到的零值來(lái)源的困難是計(jì)算分析的主要挑戰(zhàn)之一妒峦。即使深度測(cè)序的數(shù)據(jù)集也可能有約50%的零值重斑，而低測(cè)序深度的數(shù)據(jù)集可能有99%的零值。相比之下肯骇，在bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中窥浪，小于20%的數(shù)據(jù)條目為零值。

分析流程概述

數(shù)據(jù)質(zhì)控

分析 scRNA-seq 的第一步是剔除不太可能代表完整單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞條形碼笛丙。對(duì)于高通量方法漾脂，關(guān)鍵步驟是過(guò)濾掉不代表細(xì)胞的細(xì)胞條形碼。最直接的方法是計(jì)算特定于數(shù)據(jù)集的細(xì)胞所需的最小 UMI 數(shù)量（閾值）胚鸯，高于閾值的將此類(lèi)條形碼視為細(xì)胞骨稿。最近開(kāi)發(fā)的一些工具，例如 EmptyDrops姜钳，首先估計(jì)存在于空孔或液滴中RNA的背景水平坦冠，然后識(shí)別與背景顯著偏離的細(xì)胞條形碼，將此視為細(xì)胞哥桥。這種策略的優(yōu)勢(shì)在于辙浑，它能夠檢測(cè)相對(duì)于樣本中其他細(xì)胞而言，RNA含量較低的細(xì)胞類(lèi)型泰讽。

不幸的是例衍，這些方法都不能將完整的活細(xì)胞與受損或垂死的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)昔期。必須進(jìn)行第二輪數(shù)據(jù)質(zhì)控，考慮檢測(cè)到的基因數(shù)量佛玄、來(lái)自線(xiàn)粒體基因組的RNA比例以及每個(gè)細(xì)胞比對(duì)不上或多重比對(duì)read的比例硼一。線(xiàn)粒體來(lái)源的基因比例高、檢測(cè)到的基因少或未比對(duì)或多重比對(duì)read比例高的細(xì)胞通常會(huì)受損或死亡梦抢。具體閾值通常通過(guò)手動(dòng)檢查數(shù)據(jù)質(zhì)控指標(biāo)圖來(lái)確定般贼，因?yàn)樽罴验撝等Q于組織、細(xì)胞解離方案和其他技術(shù)因素奥吩。為關(guān)鍵指標(biāo)定義異常值細(xì)胞（根據(jù)中值絕對(duì)偏差）能夠直接構(gòu)建數(shù)據(jù)集特定的閾值哼蛆，但應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用，特別是對(duì)于包含高異質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型的樣本 霞赫。

除了一些表示背景噪聲的細(xì)胞條形碼外腮介，細(xì)胞條形碼也可能對(duì)應(yīng)于多個(gè)細(xì)胞。通常端衰，約5%的細(xì)胞條形碼標(biāo)記多個(gè)細(xì)胞叠洗，稱(chēng)為doublets。此外旅东，最近的研究結(jié)果表明灭抑，多達(dá)20%的情況下，多個(gè)細(xì)胞條形碼可能標(biāo)記同一個(gè)單細(xì)胞抵代，稱(chēng)為多重條形碼（barcode multiplets）腾节。scrublet和DoubletFinder 等工具從數(shù)據(jù)集本身模擬可能的雙細(xì)胞，然后計(jì)算真實(shí)液滴條形碼與模擬雙細(xì)胞的相似性荤牍，并定義閾值以區(qū)分推斷的雙細(xì)胞和假設(shè)的單細(xì)胞案腺。其他方法也可以成功應(yīng)用（例如scds），但雙細(xì)胞檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題参淫，并且不能期望計(jì)算雙細(xì)胞檢測(cè)方法能夠在所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中完美執(zhí)行救湖。

問(wèn)題：多個(gè)cell barcode對(duì)應(yīng)單個(gè)細(xì)胞愧杯；這種的處理方法是什么涎才？

查看《Inference and effects of barcode multiplets in droplet-based single-cell assays》文獻(xiàn)：
基于液滴的分流系統(tǒng)已成為單細(xì)胞基因組學(xué)研究必不可少的工具。與基于板的單細(xì)胞測(cè)定相比力九，基于液滴的方法耍铜，包括scRNA-seq和 scATAC-seq技術(shù)，可以在單個(gè)實(shí)驗(yàn)分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞跌前。檢測(cè)細(xì)胞通量的顯著增加是通過(guò)使用bead對(duì)細(xì)胞cDNA進(jìn)行平行條形碼來(lái)實(shí)現(xiàn)高度多樣性的DNA條形碼棕兼。至關(guān)重要的是，下游的計(jì)算分析假設(shè)一個(gè)條形碼序列等同于一個(gè)細(xì)胞抵乓。
在這項(xiàng)工作中伴挚，我們提供了多條證據(jù)表明細(xì)胞通常通過(guò)（i）多個(gè)beads出現(xiàn)在同一個(gè)液滴內(nèi)靶衍；(ii)單個(gè)bead內(nèi)存在異質(zhì)性的寡核苷酸序列（圖1a）。這里茎芋，我們指的是在同一液滴中出現(xiàn)多個(gè)DNA條形碼的情況颅眶，即“barcode multiplets”。我們發(fā)現(xiàn)多重條形碼會(huì)顯著影響單細(xì)胞分析和證明罕見(jiàn)的細(xì)胞事件（例如田弥，細(xì)胞克隆型分析）涛酗。此外，我們提供了針對(duì)現(xiàn)有的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集偷厦，特別是scATAC-seq平臺(tái)商叹，識(shí)別這些多重條形碼的計(jì)算解決方案。最后只泼，我們提供了緩解現(xiàn)有分析中這類(lèi)多重barcode偏差的建議剖笙。

歸一化

從測(cè)序?qū)嶒?yàn)中獲得的有用read數(shù)將因細(xì)胞而異，必須糾正這種差異请唱。對(duì)于scRNA-seq數(shù)據(jù)枯途，這種影響是顯著的，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞的RNA的數(shù)量可能會(huì)因細(xì)胞周期階段和其他生物因素而顯著變化籍滴，即使在相同的細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)也是如此酪夷。技術(shù)因素（例如，不同的液滴大心醵琛）可能會(huì)進(jìn)一步增加測(cè)序深度的可變性晚岭。由測(cè)序深度不均一而產(chǎn)生的差異可以通過(guò)歸一化來(lái)改善。

針對(duì)bulk RNA-seq數(shù)據(jù)勋功，歸一化相當(dāng)于計(jì)算與樣本測(cè)序深度相關(guān)的數(shù)量坦报，通常稱(chēng)為“size factor”，并將所有基因的表達(dá)計(jì)數(shù)除以該值狂鞋。原則上片择，類(lèi)似的方法可以用于scRNA-seq，但大量的零意味著需要修改策略骚揍。scran包通過(guò)使用細(xì)胞池來(lái)估計(jì)size factor實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的結(jié)果字管。或者信不，可以使用外部來(lái)源的RNA對(duì)照組或看家基因的RNA表達(dá)計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)size factor嘲叔。

由于大量的零值，低表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄行為可能與高表達(dá)基因不同抽活，以響應(yīng)不同的測(cè)序深度硫戈。為了補(bǔ)償這種行為，可以使用特定于每個(gè)基因表達(dá)水平的歸一化策略下硕。例如丁逝，SCnorm可用于低通量汁胆、高測(cè)序深度數(shù)據(jù)，sctransform可用于高通量霜幼、低測(cè)序深度的數(shù)據(jù)沦泌。2019年，開(kāi)發(fā)了一種新的用于scRNA-seq基因表達(dá)計(jì)數(shù)縮放和推斷的貝葉斯方法辛掠，稱(chēng)為bayNorm谢谦，其目的是在考慮mRNA捕獲的影響后估計(jì)潛在的基因表達(dá)矩陣。

批次校正

與測(cè)序深度的差異類(lèi)似萝衩，批次效應(yīng)是必須考慮的技術(shù)混雜因素回挽，這樣才能出現(xiàn)真正的生物信號(hào)。批次效應(yīng)是生物學(xué)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題猩谊，它們?cè)从诜巧飳W(xué)因素的差異千劈，例如實(shí)驗(yàn)時(shí)間、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的人或試劑的差異牌捷。如果沒(méi)有適當(dāng)考慮墙牌，批次效應(yīng)可能會(huì)被誤認(rèn)為是真正的生物信號(hào)，但是暗甥，通過(guò)仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)喜滨，它們可以完全避免。要將批次效應(yīng)校正應(yīng)用于數(shù)據(jù)集撤防，不能混淆實(shí)驗(yàn)（即每個(gè)批次必須包含至少兩個(gè)生物條件）虽风。當(dāng)在所有批次中處理所有生物條件時(shí)，批次效應(yīng)校正最有效寄月，稱(chēng)為“平衡設(shè)計(jì)”辜膝。不幸的是，當(dāng)樣本不能同時(shí)處理時(shí)（例如漾肮，如果細(xì)胞在收集后需要立即處理）厂抖，通常不可能實(shí)現(xiàn)平衡設(shè)計(jì)。

傳統(tǒng)的校正批次的方法克懊，如ComBat忱辅，假設(shè)每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)狀況是先驗(yàn)的，并利用此信息使用線(xiàn)性模型將生物效應(yīng)與批量效應(yīng)分離。然而，這種假設(shè)通常不適用于scRNA序列數(shù)據(jù)歧杏，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型身份可能未知逻澳。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，mnnCorrect使用不同批次中細(xì)胞之間的相互最近鄰來(lái)識(shí)別批次后的常見(jiàn)生物狀況蒜魄。這種相互最近鄰方法也適用于為Seurat的典型相關(guān)分析（CCA）方法找到“錨”扔亥。這兩種工具之間的主要區(qū)別是场躯，mnnCorrect使用PCA從基因表達(dá)矩陣中刪除批量效應(yīng)，而CCA將細(xì)胞投影到一個(gè)共同的基因相關(guān)空間旅挤，并在該空間上執(zhí)行校正踢关。然而，即使是這些單細(xì)胞特定工具也假設(shè)跨批次共享生物條件粘茄，如果應(yīng)用于一個(gè)有爭(zhēng)議的實(shí)驗(yàn)签舞，也會(huì)錯(cuò)誤地去除真實(shí)的生物信號(hào)。

缺值填補(bǔ)和平滑

許多歸一化策略不會(huì)更改零值柒瓣，因此很容易假設(shè)它們代表缺失值儒搭，并從檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本通過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)獲得的估計(jì)值進(jìn)行填充。原則上芙贫，刪除零值可以減少噪音搂鲫，并使其更容易識(shí)別數(shù)據(jù)的潛在結(jié)構(gòu)（例如，基因-基因相關(guān)性磺平、細(xì)胞cluster魂仍、標(biāo)記基因或發(fā)育軌跡）。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種工具來(lái)“填補(bǔ)”在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的零值拣挪，包括scImpute, DrImpute和SAVER擦酌。DrImpute和scImpute的性能類(lèi)似，而SAVER對(duì)數(shù)據(jù)的影響較小菠劝，產(chǎn)生的虛假信號(hào)更少仑氛。這些工具都依賴(lài)于在數(shù)據(jù)中找到可用于預(yù)測(cè)缺失值表達(dá)水平的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。然而闸英，這些方法假設(shè)數(shù)據(jù)集中的所有基因都由已識(shí)別的結(jié)構(gòu)（已有的基因表達(dá)矩陣）確定锯岖，經(jīng)常導(dǎo)致引入大量假陽(yáng)性信號(hào)。

其他工具甫何，如使用擴(kuò)散模型的MAGIC和使用自動(dòng)編碼器的scVI出吹，應(yīng)用平滑算法來(lái)減少噪聲。因此辙喂，這些方法采用數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的方法捶牢，假設(shè)缺失值可以從具有類(lèi)似基因表達(dá)譜的其他細(xì)胞中推斷出來(lái)。與基于模型的零值填補(bǔ)方法類(lèi)似巍耗，它們可以更容易地檢測(cè)下游分析中的結(jié)構(gòu)秋麸。這種算法的一個(gè)缺點(diǎn)是，基礎(chǔ)模型可能會(huì)扭曲真實(shí)結(jié)構(gòu)（例如炬太，通過(guò)放大隨機(jī)噪聲）灸蟆，這可能會(huì)被誤認(rèn)為是生物模式。隨著公開(kāi)可用的單細(xì)胞圖譜數(shù)量的增加亲族，使用外部引用來(lái)插補(bǔ)缺失值變得可行炒考。這種方法的示例是SAVER-X和netNMF-sc可缚，它們可能沒(méi)有相同的缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兡軌蚝喜?lái)自其他來(lái)源的相關(guān)信息斋枢。零值填補(bǔ)有助于改善scRNA-seq數(shù)據(jù)的可視化帘靡，但填補(bǔ)的數(shù)據(jù)確定的任何結(jié)構(gòu)或模式（例如差異表達(dá)基因或軌跡）必須通過(guò)對(duì)預(yù)進(jìn)行填補(bǔ)的數(shù)據(jù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。

細(xì)胞周期分配

如果樣本中含有活性細(xì)胞周期的細(xì)胞瓤帚，這可能會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)混雜因素描姚，可能需要在下游分析中去除該類(lèi)細(xì)胞「甏危或者轰胁，細(xì)胞周期的階段可能與正在研究的生物學(xué)問(wèn)題有關(guān)。在任何一種情況下朝扼，都有必要將細(xì)胞分配到其適當(dāng)?shù)募?xì)胞周期階段赃阀。有兩種廣泛使用的工具可用于識(shí)別細(xì)胞周期階段：cyclone和Seurat。Cyclone分析在不同相對(duì)水平表達(dá)值的成對(duì)基因擎颖，以將細(xì)胞分配到G1榛斯、S或G2/M。無(wú)論是否歸一化搂捧，cyclone都很精確驮俗，但它很難區(qū)分非細(xì)胞周期細(xì)胞。Seurat采用Tirosh等人提出的方法允跑，根據(jù)已知標(biāo)記基因G1/S和G2/M的平均歸一化表達(dá)值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分王凑。

一旦細(xì)胞被分配了一種細(xì)胞周期階段，兩種工具都使用一般線(xiàn)性模型來(lái)回歸差異聋丝。此外索烹，Seurat提供了一個(gè)選項(xiàng)，僅回歸掉G1/S和G2/M細(xì)胞之間的差異弱睦，同時(shí)保留細(xì)胞周期的細(xì)胞和非細(xì)胞周期的細(xì)胞之間的差異百姓。如果有人對(duì)細(xì)胞周期和非細(xì)胞周期的細(xì)胞亞群之間的差異感興趣，后一種情況很重要况木。

高可變基因選擇

在 scRNA-seq 實(shí)驗(yàn)中垒拢，每個(gè)基因代表一個(gè)維度，因此火惊，對(duì)于小鼠或人類(lèi)數(shù)據(jù)集求类，將有大約 20,000 個(gè)維度。然而屹耐，許多基因不會(huì)在給定的細(xì)胞或細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)尸疆，并且在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的數(shù)量取決于不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。高通量、基于液滴的方法可以識(shí)別細(xì)胞中多達(dá) 5,000個(gè)基因仓技，而更靈敏的方法可以檢測(cè)較前面兩倍的基因鸵贬。然而俗他，許多研究依賴(lài)于低深度測(cè)序脖捻，因此檢測(cè)到的基因較少，有時(shí)每個(gè)細(xì)胞少于 1,000 個(gè)基因兆衅〉鼐冢基因數(shù)目過(guò)多會(huì)使分析變得困難，因?yàn)楦呔S度的距離估計(jì)是不可靠的羡亩，即使在噪聲水平較低的情況下也是如此摩疑。

高可變基因識(shí)別是相對(duì)于技術(shù)噪聲具有很強(qiáng)的生物學(xué)信號(hào)。因此畏铆，在下游分析只限制在信息量最大的基因集上雷袋，可以減少維度的影響，減少噪音并簡(jiǎn)化分析辞居。一些工具可能會(huì)識(shí)別固定數(shù)目的高可變基因楷怒，或嘗試確定哪些特征基因包含大量的生物學(xué)信息。scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的特征基因選擇有兩個(gè)復(fù)雜的因素：(i) 影響每個(gè)基因的技術(shù)噪聲取決于該基因的平均表達(dá)瓦灶；(ii) 小樣本量難以估計(jì)方差鸠删。最廣泛使用的特征基因選擇策略是考慮高度可變的基因（即具有高于預(yù)期方差的基因）。對(duì)于使用 UMI 量化的數(shù)千個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集贼陶，已表明噪聲遵循負(fù)二項(xiàng)分布刃泡，可用于識(shí)別重要特征基因。 Seurat等工具使用非參數(shù)方法通過(guò)經(jīng)驗(yàn)擬合方差和基因平均表達(dá)之間的關(guān)系來(lái)識(shí)別高可變的基因碉怔。相反烘贴，另一種特征選擇策略是考慮具有高于預(yù)期數(shù)量的觀(guān)察到的零值的基因。

許多特征選擇方法的一個(gè)局限性是撮胧，它們考慮了整個(gè)數(shù)據(jù)集的整體可變性庙楚。因此，在罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型中差異表達(dá)的基因可能無(wú)法檢測(cè)到趴樱，因?yàn)檫@些細(xì)胞對(duì)總變異性的貢獻(xiàn)很小馒闷。在這種情況下，其他指標(biāo)叁征，如量化轉(zhuǎn)錄本不均勻分布的基尼指數(shù)纳账，可能更合適，如基尼聚類(lèi)方法所示捺疼，該方法旨在識(shí)別小聚類(lèi)疏虫。

降維和可視化

另一種降低基因表達(dá)矩陣高維負(fù)面效應(yīng)的策略是對(duì)縮減的特征空間進(jìn)行降維。有許多可用的方法 ，但最常用的策略涉及主成分分析 (PCA)卧秘，這是一種線(xiàn)性變換呢袱，可保留完整 PCA 空間中細(xì)胞之間的歐幾里德距離，即使對(duì)于非常大的數(shù)據(jù)集也可以有效計(jì)算翅敌。為下游分析保留的組分?jǐn)?shù)量將取決于數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性羞福，并且存在各種算法來(lái)識(shí)別適當(dāng)?shù)腜C個(gè)數(shù)。由于這些通常在計(jì)算上運(yùn)行起來(lái)很耗時(shí)蚯涮，因此最常見(jiàn)的方法是繪制每個(gè)分量可解釋的方差分?jǐn)?shù)治专，然后直觀(guān)地識(shí)別曲線(xiàn)急劇彎曲的點(diǎn)，通常稱(chēng)為“拐點(diǎn)”遭顶，并且只保留拐點(diǎn)以上的那些PC組分张峰。

大多數(shù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)集都很復(fù)雜，它們的結(jié)構(gòu)不能被兩個(gè)或三個(gè)主成分捕獲棒旗。因此喘批，可視化算法用于創(chuàng)建一個(gè)二維圖，匯總scRNA-seq數(shù)據(jù)集的大量的重要組成部分铣揉。當(dāng)前的最佳實(shí)踐方法是統(tǒng)一流形逼近與投影UMAP的降維方式饶深。該算法使用細(xì)胞-細(xì)胞最近鄰網(wǎng)絡(luò)近似數(shù)據(jù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，然后估計(jì)數(shù)據(jù)的低維嵌入老速，以最好地保留結(jié)構(gòu)粥喜。UMAP 在很大程度上取代了 t 分布隨機(jī)指標(biāo)鄰居嵌入降維方法（t-SNE）， 因?yàn)樗軌蚋玫乇４嫒纸Y(jié)構(gòu)橘券。最近的一項(xiàng)研究表明额湘，這可以歸因于UMAP實(shí)現(xiàn)中默認(rèn)使用的初始化策略。然而旁舰，UMAP傾向于支持?jǐn)?shù)據(jù)的完全性連接表示锋华，而不是t-SNE支持的離散聚類(lèi)。t-SNE和UMAP的一個(gè)缺點(diǎn)是它們都需要用戶(hù)定義的超參數(shù)箭窜，結(jié)果可能對(duì)選擇的參數(shù)數(shù)值敏感毯焕。此外，這些方法是隨機(jī)的磺樱，提供良好的初始化可以顯著改善這兩種算法的結(jié)果纳猫。需要注意的是，無(wú)論是可視化算法保留了細(xì)胞之間的距離竹捉，因此芜辕，投影坐標(biāo)的信息不能直接用于聚類(lèi)或擬時(shí)序分析等下游分析。

無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)

scRNA-seq 數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)是大多數(shù)分析的核心块差，因?yàn)樗梢宰R(shí)別具有相似表達(dá)譜的細(xì)胞組侵续。其中一些組可以代表不同的細(xì)胞類(lèi)型倔丈，而其他組可以被認(rèn)為是中間細(xì)胞狀態(tài)（例如，細(xì)胞周期階段）状蜗，這取決于樣本的生物學(xué)系統(tǒng)需五。早在 scRNA-seq 出現(xiàn)之前就已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種聚類(lèi)方法，現(xiàn)有的工具都是經(jīng)典方法的應(yīng)用轧坎。一個(gè)例子是廣泛使用的 k-means 算法 宏邮，它構(gòu)成了單細(xì)胞共識(shí)聚類(lèi) (SC3) 算法的基礎(chǔ)。除了基本的 k-means 算法之外眶根，SC3 還使用一種共識(shí)方法來(lái)平均多個(gè)聚類(lèi)結(jié)果蜀铲。另一個(gè)例子是用于網(wǎng)絡(luò)聚類(lèi)的 Louvain 算法 rithm边琉，它成功地適應(yīng)了Phenograph中的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集属百，隨后被 Seurat和 scanpy采用”湟蹋基于Louvain算法的方法為細(xì)胞構(gòu)建最近鄰網(wǎng)絡(luò)族扰，然后識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的不同社區(qū)。這些方法的優(yōu)勢(shì)在于它們的速度定欧，即使對(duì)于非常大的數(shù)據(jù)集也是如此渔呵。獨(dú)立的基準(zhǔn)比較表明 SC3 和 Seurat 總體上表現(xiàn)相似，盡管對(duì)于單個(gè)數(shù)據(jù)集砍鸠，其中一個(gè)或另一個(gè)可能表現(xiàn)更好扩氢，并且優(yōu)于所有其他當(dāng)前可用的方法。這些基準(zhǔn)基于數(shù)據(jù)集爷辱，其中細(xì)胞類(lèi)型身份可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析以外的其他方式（例如录豺，已知表面標(biāo)記的熒光激活細(xì)胞分選分析）建立。

每個(gè)聚類(lèi)算法都有自己的一組參數(shù)饭弓，這些參數(shù)可以顯著影響結(jié)果和生物學(xué)解釋双饥。例如，Louvain 算法有一個(gè)resolution參數(shù)會(huì)影響cluster的大小——較小的分辨率會(huì)生成較少數(shù)目的cluster弟断。同樣咏花，對(duì)于k-means的方法，k 的值直接決定了聚類(lèi)的數(shù)量阀趴。不幸的是昏翰，沒(méi)有確定最佳參數(shù)的固定規(guī)則，用戶(hù)通常必須根據(jù)手頭的數(shù)據(jù)集做出明智的決定刘急。重要的是要同時(shí)考慮數(shù)學(xué)和生物學(xué)方面棚菊，因?yàn)閮H依靠一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分析流程可能會(huì)導(dǎo)致不能提供最適合該數(shù)據(jù)集的結(jié)果，或者cluster的分群不合理排霉。例如窍株，可以計(jì)算cluster對(duì)輸入?yún)?shù)的穩(wěn)健性民轴，并檢查生成的cluster中已知存在于特定組織中的細(xì)胞類(lèi)型。

擬時(shí)序分析

聚類(lèi)分析將每個(gè)細(xì)胞分配給一個(gè)組（cluster）球订，這在某些情況下是不合適的后裸。例如，如果數(shù)據(jù)集代表一個(gè)發(fā)育過(guò)程或源自一個(gè)時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)冒滩，那么將細(xì)胞視為從一個(gè)發(fā)育/時(shí)序連續(xù)體中繪制出來(lái)的更合適微驶。這種可以表示空間位置、化學(xué)濃度或時(shí)間進(jìn)程的連續(xù)軌跡通常被稱(chēng)為“偽時(shí)間”开睡，每個(gè)細(xì)胞都可以被分配一個(gè)特定的位置因苹。大多數(shù)工具無(wú)法確定細(xì)胞沿軌跡移動(dòng)的方向或速度。相反篇恒，必須使用外部信息扶檐，例如時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)的采樣時(shí)間或發(fā)育軌跡的標(biāo)記基因來(lái)推斷這些數(shù)量。大量的偽時(shí)間推理方法已經(jīng)發(fā)表胁艰，最近也有研究已經(jīng)進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試款筑。作者強(qiáng)調(diào)這些方法是互補(bǔ)的，它們?yōu)椴煌?lèi)型的數(shù)據(jù)選擇哪種方法提供了指導(dǎo)腾么。

大多數(shù)工具采用兩種方法中的一種奈梳。第一種方法是基于流形方法的擬時(shí)序方法。使用降維技術(shù)來(lái)識(shí)別細(xì)胞所在的低維“流形”解虱，并使用細(xì)胞-細(xì)胞圖來(lái)描述流形的拓?fù)淙列搿Ｊ褂眠@種策略的主流方法包括 Monocle和 DPT。第二種方法是基于cluster的聚類(lèi)方法殴泰。在連接cluster并將單個(gè)細(xì)胞投影到cluster分支上之前于宙，使用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組。此類(lèi)方法的示例包括 TSCAN 和 Mpath艰匙。當(dāng)進(jìn)行軌跡分析的細(xì)胞密度不相等時(shí)限煞，基于cluster的擬時(shí)序方法往往更準(zhǔn)確——例如，來(lái)自一種狀態(tài)的細(xì)胞可能比來(lái)自其他狀態(tài)和大規(guī)模發(fā)育層次結(jié)構(gòu)的細(xì)胞更頻繁或更可靠地捕獲员凝。另一方面署驻，當(dāng)在過(guò)渡過(guò)程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行均勻采樣以及檢查奇異過(guò)渡的細(xì)節(jié)時(shí)，流形方法表現(xiàn)最佳健霹。

表示剪接和未剪接轉(zhuǎn)錄本的外顯子和內(nèi)含子read的相對(duì)豐度可用于推斷 scRNA-seq 實(shí)驗(yàn)中的時(shí)間動(dòng)態(tài)旺上。 RNAvelocity 和 scVelo6等工具可以推斷在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行采樣時(shí)每個(gè)基因的表達(dá)是增加還是減少。盡管 RNAvelocity 使用簡(jiǎn)單的動(dòng)態(tài)模型糖埋，但 scVelo 采用概率方法來(lái)解釋單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的不確定性宣吱。盡管這種方法受到測(cè)序深度和比對(duì)到內(nèi)含子的讀取數(shù)量的限制，但它可以推斷每個(gè)細(xì)胞在表達(dá)空間中移動(dòng)的方向以及對(duì)變化率的估計(jì)瞳别。結(jié)果可以在低維投影中可視化為指示每個(gè)細(xì)胞如何移動(dòng)的箭頭征候，類(lèi)似于相平面杭攻。

差異基因表達(dá)

差異基因表達(dá)（DE）已成為bulk RNA-seq中最重要的應(yīng)用之一，因?yàn)樗峁┝艘幌盗性趦蓚€(gè)或多個(gè)生物條件之間受干擾的基因疤坝。scRNA-seq的DE分析更具挑戰(zhàn)性兆解，因?yàn)槲覀儾粌H僅是比較每個(gè)基因的單個(gè)值，而是需要比較基因表達(dá)水平的分布跑揉。單細(xì)胞數(shù)據(jù)特有的另一個(gè)挑戰(zhàn)是锅睛，我們想要比較的細(xì)胞組不是先驗(yàn)定義的。相反历谍，這些組通常是基于我們想要比較的基因表達(dá)水平來(lái)定義的现拒，這違反了統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)假設(shè)檢驗(yàn)中的中心假設(shè)。事實(shí)上望侈，已經(jīng)證明印蔬，無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)和差異表達(dá)分析可以導(dǎo)致人為的低P值。因?yàn)樵诙x細(xì)胞組別時(shí)使用了基因表達(dá)值甜无，這可能會(huì)引入偏差扛点，因?yàn)榫垲?lèi)和DE分析不再獨(dú)立哥遮。

最近的一項(xiàng)比較得出結(jié)論岂丘，與目的構(gòu)建方法相比，非參數(shù)Wilcoxon檢驗(yàn)表現(xiàn)出色眠饮。作者還得出結(jié)論奥帘，為bulk RNA-seq開(kāi)發(fā)的方法表現(xiàn)良好，尤其是當(dāng)與基因表達(dá)矩陣的每個(gè)元素分配權(quán)重的策略相結(jié)合時(shí)仪召。另一項(xiàng)基準(zhǔn)研究得出了類(lèi)似的結(jié)論寨蹋，補(bǔ)充說(shuō)基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化可以對(duì)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。在專(zhuān)門(mén)為scRNA-seq量身定制的方法中扔茅，MAST已旧，它使用高斯障礙模型將檢測(cè)率差異和平均表達(dá)差異結(jié)合到一個(gè)測(cè)試中，已被報(bào)告具有最佳性能召娜。

當(dāng)單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包含多個(gè)生物學(xué)重復(fù)時(shí)运褪，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)有趣的情況（例如，比較3個(gè)健康個(gè)體的細(xì)胞與3個(gè)患有糖尿病的個(gè)體的細(xì)胞）玖瘸。當(dāng)前的單細(xì)胞差異表達(dá)檢驗(yàn)將每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞視為生物學(xué)重復(fù)秸讹，不能解釋共享的遺傳背景或疾病狀態(tài)。對(duì)于此類(lèi)比較雅倒，當(dāng)前的可能的操作是： (i) 計(jì)算每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的每個(gè)個(gè)體的細(xì)胞間基因平均表達(dá)量璃诀，并將結(jié)果視為bulk RNA-seq樣本；或 (ii) 執(zhí)行所有個(gè)體 × 個(gè)體雙重比較和過(guò)濾出單個(gè)個(gè)體所獨(dú)有的差異基因結(jié)果蔑匣。前一種方法類(lèi)似于最近提出的 MetaCell 想法劣欢。 MetaCell 背后的想法是使用引導(dǎo)方法來(lái)識(shí)別原始數(shù)據(jù)集最穩(wěn)定和可重現(xiàn)的特征棕诵。然而，隨著 scRNA-seq 應(yīng)用于更大的隊(duì)列和比較研究凿将，我們預(yù)計(jì)進(jìn)一步的發(fā)展將導(dǎo)致更準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)模型用于更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)年鸳。

比較與整合數(shù)據(jù)集

隨著 scRNA-seq 數(shù)據(jù)量的不斷增長(zhǎng)，重要的挑戰(zhàn)是如何最好地整合單細(xì)胞數(shù)據(jù)集丸相。批次效應(yīng)是整合數(shù)據(jù)的主要挑戰(zhàn)是數(shù)據(jù)來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)搔确，即使這些問(wèn)題可以克服，整合這些數(shù)據(jù)集的重分析可能需要耗費(fèi)大量的時(shí)間灭忠、精力和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存膳算。相反，整合數(shù)據(jù)的一種替代策略是比較它們弛作。當(dāng)其中一個(gè)數(shù)據(jù)集非常大（例如細(xì)胞圖譜）時(shí)涕蜂，該策略特別有用。當(dāng)給定一個(gè)或多個(gè)具有已知細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)據(jù)集時(shí)映琳，scmap構(gòu)建一個(gè)小索引机隙。當(dāng)給定一個(gè)新的查詢(xún)數(shù)據(jù)集時(shí)，scmap根據(jù)轉(zhuǎn)錄譜快速確定識(shí)別心數(shù)據(jù)集的每個(gè)細(xì)胞與參考數(shù)據(jù)集的哪個(gè)細(xì)胞類(lèi)型最接近萨西。此外有鹿，scmap可以預(yù)測(cè)參考數(shù)據(jù)集中最緊鄰細(xì)胞，這意味著當(dāng)為細(xì)胞分配偽時(shí)間數(shù)值而不是離散cluster標(biāo)簽時(shí)谎脯，可以使用它葱跋。也就是說(shuō)scmap可以做擬時(shí)序分析。最近有文獻(xiàn)研究源梭，對(duì)將細(xì)胞映射到參考數(shù)據(jù)集的不同方法進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試娱俺。另一種方法MetaNeighbor，旨在測(cè)試細(xì)胞類(lèi)型在多個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集中是否一致废麻。它通過(guò)計(jì)算跨數(shù)據(jù)集的細(xì)胞-細(xì)胞Spearman相關(guān)性來(lái)實(shí)現(xiàn)荠卷，允許MetaNeighbor驗(yàn)證細(xì)胞標(biāo)簽在多個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的重復(fù)性。

總結(jié)

scRNA-seq的計(jì)算分析是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域烛愧。在很大程度上油宜，這是由新平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的開(kāi)發(fā)推動(dòng)的。然而屑彻，研究人員也提出了從數(shù)據(jù)中提取信息的新方法验庙。未來(lái)幾年可能會(huì)出現(xiàn)新的分析工具，進(jìn)一步擴(kuò)大scRNA-seq的使用社牲。此外粪薛，我們還希望整合分析工作流的軟件工具（如Seurat、scanpy和Bioconductor）會(huì)有所改進(jìn)搏恤，使生物信息知識(shí)有限的用戶(hù)更容易訪(fǎng)問(wèn)分析违寿。

新型單細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展湃交，尤其是可以分析細(xì)胞的多組學(xué)方法和提供空間信息的方法，將需要新的計(jì)算方法來(lái)充分利用數(shù)據(jù)藤巢。此外搞莺，各種圖譜項(xiàng)目產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量不斷增加，這將需要更適合于分析大細(xì)胞量的方法掂咒。