隨著測序成本的不斷下降，轉(zhuǎn)錄組測序分析已然成為生物學及醫(yī)學研究不可或缺的技術手段沽讹。
但是般卑，對于大多數(shù)初學者來說，會遇到各種各樣的問題爽雄。這里蝠检，小編就給大家重點介紹一下轉(zhuǎn)錄組測序分析的相關知識。
Question and Answer
1挚瘟、什么是轉(zhuǎn)錄組測序叹谁？
轉(zhuǎn)錄組廣義上指在某一生理條件下，細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)物的集合乘盖，包括：mRNA焰檩、ncRNA、rRNA等订框；狹義上指所有mRNA的集合析苫。
轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和ncRNA穿扳。
轉(zhuǎn)錄組具有時間特異性衩侥、組織特異性、空間特異性等特點矛物。
2茫死、無參轉(zhuǎn)錄組和有參轉(zhuǎn)錄組的區(qū)別？
如果所研究的物種有組裝注釋質(zhì)量較好基因組序列履羞，且和該基因組序列比對效率較高峦萎，那么可以采用有參轉(zhuǎn)錄組的分析策略，直接進行分析吧雹。反之，則需要按照無參轉(zhuǎn)錄組的分析策略進行轉(zhuǎn)錄本組裝涂身，構(gòu)建unigene庫雄卷，然后進行后續(xù)分析。
3蛤售、普通轉(zhuǎn)錄組測序適用于哪些情況丁鹉？
普通轉(zhuǎn)錄組測序主要適用于兩大類：一是不同的生長階段或者發(fā)育過程；二是不同的環(huán)境悴能、藥物揣钦、病原菌等逆境脅迫處理。
4漠酿、轉(zhuǎn)錄組測序推薦的測序數(shù)據(jù)量冯凹？
轉(zhuǎn)錄組測序所需數(shù)據(jù)量與所研究物種的基因組大小有關，基因組越大炒嘲，則所需數(shù)據(jù)量越大宇姚。按照我們的經(jīng)驗來說：
常規(guī)物種一般建議6G數(shù)據(jù)即可匈庭；
基因組較大的物種推薦8G以上數(shù)據(jù)，比如：小麥建議10G數(shù)據(jù)起浑劳，甘蔗阱持、甘薯建議至少8G數(shù)據(jù)。
5魔熏、轉(zhuǎn)錄組測序的取樣建議衷咽？
取樣要遵守三個原則：代表性和一致性原則、迅速性原則蒜绽、低溫原則镶骗。具體可以參考小編之前發(fā)的一篇推文《高通量測序及蛋白組學相關樣品準備須知》藍字為鏈接可點擊。
6滓窍、轉(zhuǎn)錄組測序必須做生物學重復么卖词？需要幾個重復？
生物學重復是生物實驗所必須的吏夯，轉(zhuǎn)錄組測序也不例外此蜈，至少3 次生物學重復。
準備生物重復樣品時噪生，通過對實驗的預先設計和控制裆赵，盡可能將與實驗處理無關的背景條件控制在同一水平，減少批次效應對結(jié)果的影響跺嗽。
7战授、轉(zhuǎn)錄組測序可以同時測到mRNA、lncRNA桨嫁、micRNA以及circRNA么植兰？
我們通常所講的轉(zhuǎn)錄組測序只能測到mRNA。但是全轉(zhuǎn)錄組測序通過構(gòu)建兩個測序文庫（一是小RNA測序文庫璃吧、二是lncRNA測序文庫）是可以測到以上4種RNA的楣导。
8、有參轉(zhuǎn)錄組測序分析中畜挨，與參考基因組的比對效率多高才能夠滿足后續(xù)分析筒繁？
與參考基因組的比對效率與多個因素有關，包括基因組組裝質(zhì)量巴元、測序質(zhì)量毡咏、有無污染等；一般來說逮刨，與參考基因組的比對效率在70%以上時呕缭，該基因組可以滿足后續(xù)的分析需求。當比對效率低于60%時，需要考慮換參考基因組或者按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析臊旭。
9落恼、所研究物種有參考基因組時，必須按照有參的來分析么离熏？
按照有參或者無參進行轉(zhuǎn)錄組分析佳谦，取決于基因組的質(zhì)量、所研究物種與參考基因組的比對效率滋戳。具體如下：
若參考基因組質(zhì)量較差钻蔑，則可以選擇按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析；
若所研究物種與參考基因組比對效率比較低奸鸯，則需要按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行分析咪笑。
10、做完轉(zhuǎn)錄組之后一定要進行Q-PCR驗證么娄涩？一般驗證多少個差異基因合適窗怒？
目前來說，Q-PCR驗證是轉(zhuǎn)錄組測序分析必不可少的補充驗證實驗蓄拣，發(fā)文章必須扬虚。一般驗證15-20個差異基因比較合適。
11球恤、Q-PCR與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的吻合度一般多高是合適的辜昵？為什么會出現(xiàn)不吻合的現(xiàn)象？
Q-PCR與有參轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的吻合度在80%以上咽斧；Q-PCR與無參轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的吻合度在70%以上堪置。
出現(xiàn)結(jié)果不吻合現(xiàn)象的原因如下：實驗所用樣本弄混；沒有使用與轉(zhuǎn)錄組測序同一批的樣本進行Q-PCR驗證张惹；挑選的基因表達量較低或差異不顯著舀锨。
12、轉(zhuǎn)錄組測序的后續(xù)補充分析有哪些宛逗？
做完轉(zhuǎn)錄組測序可以考慮以下分析內(nèi)容做為補充坎匿，用于提高文章檔次和深度。
可變剪接的深入分析（對生信基礎要求較高）
基因家族分析（基因家族分析發(fā)SCI-多拧额、快碑诉、好彪腔、式慕酢！）藍字為鏈接可點擊
WGCNA分析（你距離SCI文章只差一個WGCNA分析）藍字為鏈接可點擊
其他分析（參考其他人的高分文章德挣，整理自己的個性化分析思路）
13恭垦、有參轉(zhuǎn)錄組測序分析的結(jié)果文件中有全部基因的cds序列么？在哪個文件中？
一般來說結(jié)果文件中有全部基因的cds序列番挺。我公司有參轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中的基因cds序列信息位于Gene_Func_Anno文件夾下面的NewGene中的All.longest_transcript.fa文件里唠帝。
14、轉(zhuǎn)錄組測序分析常用的數(shù)據(jù)庫有哪些玄柏？重點關注哪些注釋信息襟衰？
Nr：NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，包含的信息很全面,?注釋到的基因較多粪摘。
COG?：中文釋義即“同源蛋白簇”瀑晒。COG?分為兩類，一類是原核生物的徘意，另一類是真核生物苔悦。原核生物的一般稱為?COG?數(shù)據(jù)庫；真核生物的一般稱為?KOG?數(shù)據(jù)庫椎咧。
SWISS-PROT：經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫玖详，數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)的功能經(jīng)過了試驗驗證，注釋是精確的勤讽；
TrEMBL：數(shù)據(jù)庫全稱“Translation of EMBL”蟋座，是從EMBL中的cDNA序列翻譯得到的，其中TrEMBL收錄的是未經(jīng)人工注釋的編碼DNA序列翻譯數(shù)據(jù)地技；
KEGG：翻譯成中文是京都基因與基因組百科全書蜈七，是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫莫矗，旨在揭示生命現(xiàn)象的遺傳與化學藍圖飒硅。它是由人工創(chuàng)建的一個知識庫，KEGG數(shù)據(jù)庫最優(yōu)的地方在于擁有描繪已知通路的代謝通路圖作谚。另外KEGG中有一個“專有名詞”KO（KEGG Orthology）三娩，它是蛋白質(zhì)（酶）的一個分類體系，序列高度相似妹懒，并且在同一條通路上有相似功能的蛋白質(zhì)被歸為一組雀监，然后打上KO（或K）標簽，一般用字母K后面加5個數(shù)字表示眨唬。KEGG_ID?是pathway的ID会前，表示方法是2-4個字母，后面跟上5個數(shù)字匾竿；
GO（gene ontology）：是基因本體聯(lián)合會（Gene Onotology Consortium）所建立的數(shù)據(jù)庫瓦宜，旨在建立一個適用于各種物種的，對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述的數(shù)據(jù)庫岭妖。按照三大類別BP（生物學過程）临庇、 MF（(分子功能）反璃、CC（細胞組分）對基因的產(chǎn)物-蛋白質(zhì)進行了分類，并能隨著研究不斷深入而更新的語言詞匯標準假夺。在GO數(shù)據(jù)庫中淮蜈，本質(zhì)上是一個有向無環(huán)圖的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，在三大類別之下已卷，又有小的分類層級梧田，一層一層的分類下去。對于某個具體的GO號來說侧蘸，代表一組同源蛋白柿扣，擁有相似的結(jié)構(gòu)和功能；
Pfam：是一個被廣泛使用的蛋白家族數(shù)據(jù)庫闺魏，它有兩個數(shù)據(jù)庫未状，高質(zhì)量，手工確定的Pfam-A析桥，自動注釋的Pfam-B數(shù)據(jù)庫司草。
15、差異分析的篩選標準默認是多少泡仗？是固定不變的么埋虹？
差異分析的篩選標準默認為：Fold Change≥2且FDR<0.01。篩選條件要靈活娩怎，要根據(jù)情況進行參數(shù)調(diào)整搔课，數(shù)據(jù)是死的，人是活的截亦，要靈活變通爬泥。
16、unigene和轉(zhuǎn)錄本的區(qū)別崩瓤？
unigene是轉(zhuǎn)錄本的子集袍啡。首先通過triniy組裝出來的視為轉(zhuǎn)錄本，然后挑選最長的一條轉(zhuǎn)錄本作為unigene却桶。
17境输、差異基因太多，注釋信息太雜亂颖系，怎么挑選目標基因嗅剖？
可以根據(jù)KEGG和GO富集分析結(jié)果，挑選富集程度較高的代謝通路和GO terms嘁扼，進而查看相關的差異基因信粮；
對不同的差異組合進行維恩圖分析，挑選共有或者特有的差異基因作為后續(xù)的研究對象偷拔；
根據(jù)前人的文獻報道蒋院，挑選相關差異基因，不要局限在自己研究的物種上莲绰。
18欺旧、為什么原核物種只能做有參轉(zhuǎn)錄組分析？
由于原核生物的基因組中存在大量基因重疊區(qū)域蛤签、操縱子及多順反子辞友，如果按照無參轉(zhuǎn)錄組分析策略進行組裝的話，難度較大震肮，組裝結(jié)果存在較大風險称龙。
19、差異基因數(shù)目多少比較合理戳晌？
不同的處理鲫尊，不同的研究目標，差異基因的數(shù)目是不同的沦偎，從幾十個到幾千個都有可能疫向。但是如果差異基因數(shù)目是個位數(shù)或者上萬，那么就需要和分析人員溝通一下豪嚎，查一查是否有問題搔驼。
20、組學生物的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果與其他公司的區(qū)別在哪里侈询？
我們的標準分析在不斷更新舌涨，盡量做到國內(nèi)做全；
后期個性化分析速度快扔字，質(zhì)量好囊嘉，沒有大公司的拖延癥；
針對初學者革为，我們精心制作了配套的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果解讀教程（藍字為鏈接可點擊）哗伯，確保您能看懂分析結(jié)果。
您可以掃描下方二維碼篷角，關注我們組學大講堂公眾號焊刹，然后公眾號對話框內(nèi)發(fā)送“轉(zhuǎn)錄組報告”獲取有參轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)題報告。
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