摘要

用熒光蛋白進行基因標記對于研究細胞蛋白的動態(tài)特性至關重要北苟。 CRISPR–Cas9技術可將熒光標記插入任何目標基因（gene of interest, GoI）實現(xiàn)融合蛋白的功能和生理表達。至關重要的是，仔細評估此類基因組編輯的細胞系，以防止由以下因素引起的脫靶效應：（i）熒光蛋白的不正確插入抓督；（ii）熒光蛋白對融合蛋白的干擾幌绍；或（iii）非特異性基因組CRISPR–Cas9對DNA的損害。在該協(xié)議中仆潮，我們提供了系統(tǒng)性的流程和逐步描述，便于大家生成和驗證純合的熒光敲入細胞系遣臼。我們使用配對的Cas9(D10a)切口酶性置，通過同源性定向修復（HDR）將標簽插入特定的基因組位點，且脫靶效應降至最低揍堰。對每個細胞克隆進行全基因組測序以檢查哺乳動物細胞系中發(fā)生的自發(fā)遺傳變異既費時又昂貴鹏浅。因此，我們已經開發(fā)了一條有效的驗證流程屏歹，包括連接PCR隐砸，Southern印跡分析，sanger測序蝙眶，顯微鏡季希，Western分析和活細胞成像，以了解細胞周期動力學幽纷。該協(xié)議需要6到9周式塌。通過該方案，可以用熒光蛋白純合地標記多達70％的靶基因友浸，從而導致融合蛋白的生理水平和表型功能性表達珊搀。

介紹

為了研究細胞內蛋白質的動力學和功能，研究人員通常使用熒光標記物標記蛋白質尾菇。 Mahen等人1揭示境析，在內源基因組位點標記蛋白是通過活細胞成像和生物物理方法研究融合蛋白定量特性的最佳選擇。為了反映蛋白質在單個細胞內的生理濃度并確保標記的蛋白質完全取代內源蛋白質的功能派诬，必須使用熒光標記所有等位基因劳淆。該協(xié)議描述了如何生成表達純合標記蛋白質的細胞系，以分析活細胞中的蛋白質組動力學默赂，并使用熒光相關光譜法校準的4D活細胞成像系統(tǒng)地在四個維度上系統(tǒng)地定量繪制細胞蛋白質組圖沛鸵。我們以前曾將此協(xié)議與本期隨附論文中描述的協(xié)議一起使用2來生成細胞，以研究核孔裝配并分析活細胞中蛋白質組動力學2-4。

流程的發(fā)展

我們的基因組編輯方法基于Ran等人5和Trevino等人6描述的方法曲掰，這些方法使用Cas9切口酶在真核系統(tǒng)中進行基因組編輯疾捍。在哺乳動物細胞中用于基因組編輯的所有核酸酶（例如，鋅指核酸酶（ZFN）栏妖，轉錄激活因子樣效應核酸酶和CRISPR–Cas9）都會在特定的基因組位點觸發(fā)雙鏈DNA（dsDNA）斷裂乱豆。主要通過兩個DNA修復途徑修復：非同源末端連接（NHEJ）和HDR7。對于產生敲入細胞系吊趾，HDR對于插入目標標簽至關重要宛裕。這是在dsDNA break5,8-16期間存在外源引入的修復模板才可完成的。 CRISPR–Cas9系統(tǒng)由野生型（wt）Cas9或突變型Cas9組成论泛，分別在小向導RNA（gRNA）的引導下引入dsDNA斷裂或單鏈DNA切口揩尸。我們已使用配對的Cas9 D10A切口酶方法，以特定的驗證流程以中等通量方式生成了純合標記的目的基因屁奏，如本協(xié)議中所述岩榆。配對的Cas9D10A切口酶方法將Cas9切口酶突變體（D10A）與靶向目標區(qū)域的有義和反義DNA鏈的成對gRNA結合在一起，以引入靶向的雙鏈斷裂5坟瓢、6朗恳、10、17载绿，在存在含有熒光標記的DNA模板時會產生HDR。這種方法是生成內源標記細胞系的最合適方法油航，因為它避免了脫靶效應崭庸，同時為生成內源標記細胞系提供了有效的DNA修復6,16-20（圖1）。我們已經使用配對的Cas9D10A切口酶方法常規(guī)生成了純合的敲入細胞系谊囚，與純ZFN時的46％相比怕享，純合子的敲入細胞系產生了70％（數(shù)據(jù)未顯示）。這些數(shù)據(jù)證實镰踏，成對的Cas9D10A切口酶方法更易受HDR影響函筋，正如Bothmer等人18和Miyaoka等人19所表明的那樣，這很可能導致純合效率提高（請參閱“與其他方法的比較”部分”以獲取更多詳細信息）奠伪。

有幾例報道抑制NHEJ修復途徑來增加HDR和隨后的純合性[21-26]跌帐。 但是，通過RNA干擾DNA連接酶4（LIG4）或X射線修復交叉互補蛋白4（XRCC4）耗盡后我們沒有觀察到純合性的實質性改善（數(shù)據(jù)未顯示）绊率。 同樣谨敛，我們發(fā)現(xiàn)添加NHRJ修復途徑抑制劑Scr7不會增加純合子的可能性，這證實了Greco等人的數(shù)據(jù)26（數(shù)據(jù)未顯示）滤否。 破壞DNA的試劑可損害有絲分裂27脸狸，并且因為我們主要研究有絲分裂蛋白，所以我們不想破壞DNA修復途徑的機制藐俺，以防影響細胞周期炊甲。

幾項研究已經研究了NHEJ和HDR在人類細胞的細胞周期中對DNA的修復作用28-30泥彤。在細胞周期中，G1期幾乎不存在同源重組卿啡，但S期最活躍吟吝。因此，我們在細胞轉染前24-48 h剝奪血清牵囤，使細胞部分同步于G1期爸黄。然后，在靶向dsDNA斷裂期間揭鳞，我們將細胞釋放到S期炕贵，以增加存在修復模板時HDR的機會。對于某些基因靶標野崇，這種方法導致純合子的輕微增加称开，最高可達2％，但不是全部（數(shù)據(jù)未顯示）乓梨。盡管這只是純合性的少量增加鳖轰，但是我們盡可能進行血清剝奪，因為對于某些目標蛋白（POI）扶镀，只有少數(shù)克隆被純合標記蕴侣。

當熒光蛋白（FP）標簽的結構和大小擾亂融合蛋白的功能時，純合標簽對于某些必需蛋白是不可行的臭觉。因此昆雀，某些基因只能被雜合標記。根據(jù)我們的經驗蝠筑，根據(jù)系統(tǒng)性cDNA標記工作的數(shù)據(jù)狞膘，約25％的人類基因無法用FPs功能標記。

仔細驗證基因組編輯的細胞系對于控制脫靶效應至關重要什乙，這可能是由于在基因組中其他位置插入FP標簽挽封，F(xiàn)P對融合蛋白的干擾或gRNA的非特異性結合造成的非特異性DNA損傷而引起的，導致dsDNA斷裂和基因組重排臣镣。 Landry等人[32]證明辅愿，HeLa Kyoto細胞等細胞系的基因組不穩(wěn)定，可能導致自發(fā)突變忆某。此外渠缕，每個細胞克隆的全基因組測序（每個候選對象最多50個細胞克隆）既昂貴又費時褒繁。當使用非癌細胞系時亦鳞，考慮僅使用少數(shù)經過驗證的細胞克隆進行全基因組測序是合理的。許多標記細胞系的生成通常是研究細胞內的途徑或蛋白質復合物和網(wǎng)絡所必需的。因此燕差，我們建立了用于基因組編輯細胞系的驗證管道遭笋，其中在工作流程的每個級別上都進行了有效的質量控制（圖2），以確保保留每個POI的高質量純合和雜合細胞克隆并用于進一步的實驗徒探。如果僅產生了雜合標記的克隆瓦呼，則對這些克隆進行第二輪基因組編輯以實現(xiàn)純合。另外测暗，由于dsDNA斷裂而沒有重組(產生mutation)央串，雜合標記的克隆在未標記的等位基因中可能喪失功能，這可能導致偽純合細胞克隆僅表達重組的等位基因中的標記融合蛋白碗啄。工作流程中每個步驟的詳細信息將在“實驗設計”部分中進行討論质和。

應用領域

可以使用此協(xié)議標記任何POI。 我們小組的主要興趣是參與細胞分裂和細胞周期控制的蛋白質的稚字。 因此饲宿，該協(xié)議包含一個細胞周期分析步驟。 如果標記了其他信號通路的蛋白質胆描，則可能需要進行其他分析瘫想，或者可以自行修改“細胞周期分析”部分。

只要需要保持標記蛋白的生理表達水平及其功能性的標記蛋白昌讲，內源標記細胞均可用于任何應用国夜。

限制

按本方法操作70％的靶向基因被FPs純合標記，且融合蛋白按生理水平和表型功能表達短绸。 但某些蛋白質不能被純合標簽车吹，因為FP標簽的結構和大小會擾亂融合蛋白的功能。 因此某些基因只能雜合標記鸠按。 此外，還應考慮要表達的POI分子的豐度饶碘，因為在表達少量標記蛋白時某些方法存在檢測極限(目標蛋白太少檢測不到)目尖。

與其它方法比較

CRISPR–Cas9技術發(fā)展迅速。主要問題之一是脫靶效應扎运，通過使用配對的Cas9D10A切口酶可以大大降低脫靶效應瑟曲。此外，據(jù)報道轉染預先形成的Cas9 gRNA復合物（Cas9核糖核蛋白（Cas9RNP））可提高基因敲除的效率豪治，并且脫靶效應33-35洞拨。然而，根據(jù)我們的經驗负拟，使用Cas9RNP或mRNA而不是質粒表達Cas9蛋白并不能提高人細胞系中純合敲入的效率（數(shù)據(jù)未顯示）烦衣，反而很大程度上導致了雜合標記的基因。 Roberts等人36還報告了在人類干細胞中使用CRISPR–Cas9RNP進行系統(tǒng)性基因標記的方法中僅雜合標記的基因。但是花吟，此協(xié)議的應用是執(zhí)行定量FCS校準的活細胞成像（請參閱本期隨附的協(xié)議4）秸歧。這依賴于純合的熒光標記蛋白。因此衅澈，具有當前性能的Cas9RNP方法目前不適合該管道键菱。

Paix等[37]證明具有短同源臂的線性DNA可用作DNA修復模板，可用于基因組編輯敲入方法今布。我們能夠使用由mEGFP組成的雙鏈線性DNA模板经备，其側翼為短50 bp的同源臂，但只能產生雜合的敲入細胞系部默，而不會產生純合的敲入（數(shù)據(jù)未顯示）侵蒙。

Paquet等[38]表明，通過Cas9RNP使用單鏈寡核苷酸供體（ssODN）進行純合突變導入甩牺，需要靶向接近預期突變的gRNA蘑志。在我們的實驗方案中，gRNA的位置也靠近或應該插入標簽的目標位置贬派，因此在熒光標記或其他標簽（例如Halo或SNAP）的純合導入中具有良好的效率急但。感興趣的地點。但是搞乏，我們必須通過質粒供體引入一個約700-750 bp的熒光標簽波桩，因此，我們不能像Paquet等[38]所描述的那樣使用ssODN请敦。如上所述镐躲，根據(jù)我們的經驗，盡管雜合標簽是可能的侍筛，但結合質粒DNA作為供體的Cas9RNP方法并不成功萤皂。

總而言之唆途，目前此方案中所述的基于配對Cas9D10切口酶質粒的方法仍然是敲入人細胞系生成具有純合熒光基因的最佳程序人芽。

實驗設計

gRNA和供體質粒的設計

gRNA和供體的設計取決于POI的標記位置，通常在N或C末端偎快。 謹慎地進行擴展文獻搜索以查找定位數(shù)據(jù)禽笑，對POI標記版本進行功能研究以及其他物種（如酵母或小鼠）中的表達數(shù)據(jù)入录，以洞悉可以標記POI的哪個末端，同時保持其功能和定位的正確佳镜。

種子區(qū)域內的點突變僚稿，即原間隔鄰近基序（PAM）10-12個堿基以內的序列，可降低gRNA結合活性39蟀伸。 因此蚀同，所用細胞系的序列變異（例如單核苷酸多態(tài)性（SNP））與參考基因組不同缅刽，GOI的同工型可能會干擾CRISPR–Cas9靶向。 因此唤崭，建議不僅在用于標記的GOI區(qū)域內而且還要對可能的同工型進行測序拷恨。

gRNA應直接結合靶位點，例如開放閱讀框的起始或終止密碼子谢肾。 HDR最好在dsDNA斷裂位點100 bp內腕侄。此范圍外，HDR的效率下降了四倍9芦疏。使用Cas9D10A切口酶時冕杠，需要兩個gRNA，一個用于反義酸茴，一個用于有義DNA鏈分预。將適當設計的gRNA6、9薪捍、17笼痹、18作為退火的寡核苷酸插入包含兩個表達盒，人密碼子優(yōu)化的Cas9D10切口酶和gRNA的Cas9 / gRNA表達質粒中酪穿。

供體質粒含有進行同源重組的模板和熒光標記基因（例如凳干，mEGFP或mCherry），所述熒光標記基因的側翼與GOI的靶位點具有500至800bp的同源臂被济。

熒光標記替換起始密碼子或終止密碼子救赐，并與GOI一致。默認情況下只磷，標簽和基因之間應該有一個短的柔性接頭经磅，以改善標簽蛋白的功能。供體質粒不應含有外源啟動子或哺乳動物選擇標記钮追，避免靶基因未發(fā)生重組而具有選擇標記预厌。質粒的遞送方法取決于所選的細胞系而進行優(yōu)化。 HeLa Kyoto細胞可通過脂質轉染進行很好的轉染元媚，脂質轉染可用于在此方案中生成內源標記的細胞系轧叽。

熒光蛋白陽性細胞克隆的熒光激活細胞分選

供體質粒用作DNA修復模板。 BacORI是在大腸桿菌中復制質粒必不可少的惠毁，但含有隱蔽的啟動子區(qū)域犹芹。細胞中只要有該質粒崎页，就可以在基因組整合之前產生某些背景表達40鞠绰。因此，在轉染后7-10 d進行單細胞分選以選擇熒光細胞飒焦，從而減少了熒光激活細胞分選（FACS）期間假陽性細胞克隆的數(shù)量蜈膨。根據(jù)選擇的FACS后細胞系中單細胞的存活率屿笼，應分類數(shù)百個單細胞克隆以進行下游鑒定。通常翁巍，必須針對每種親本細胞系優(yōu)化單細胞克隆的最佳生長條件驴一。該協(xié)議中的條件已針對廣泛使用的HeLa Kyoto細胞進行了優(yōu)化。 HeLa Kyoto wt細胞用作陰性對照灶壶，以區(qū)分非特異性和特異性FP / mEGFP表達水平肝断。

用DAKO MoFlo高速分選儀對細胞進行分選，并通過EMBL的流式細胞術核心設施（Heidelberg驰凛；圖3）進行分選胸懈。設置和校準如下：BD FACSFlow被用作鞘液。該儀器裝有一個100 μm的噴嘴頭恰响，液滴的產生頻率約為40 kHz趣钱。初級激光是調諧到單線488 nm 200 mW輸出功率（通過50/50分束器后撞擊細胞的100 mW單相干Saber氬離子激光器）。該激光器用于產生前向和側向散射（分別為FSC和SSC）胚宦，以及用于激發(fā)GFP首有。次級激光器是相干馬刀K離子激光器。在mCherry的激發(fā)中將其調諧至568 nm（200 mW）的單線枢劝，在Cerulean的激發(fā)中將其調諧至多線紫（MLVio：406.7–415.4 nm）井联。激光束已仔細對準MoFlo的主要光路。在運行Flow-Check熒光球期間呈野，可以優(yōu)化光路的對準低矮。樣品事件是在液滴占比小于25％的情況下獲得的。樣品-護套的壓差低被冒，無法將細胞限制在同軸流的中心军掂，因此限制了光照變化。排序決策門基于在多個2D圖中圍繞目標人群繪制的區(qū)域的組合：FSC面積與SSC面積昨悼； FSC面積與FSC脈沖寬度和熒光的關系蝗锥。在將分類目標細胞克隆到含有生長培養(yǎng)基的96孔板的過程中，使用了一個一滴模式率触。使用Moflo Summit軟件和FlowJo（Tree Star）軟件分析數(shù)據(jù)终议。

內源性標記蛋白的熒光信號取決于它們的生理表達水平，與常用的過表達系統(tǒng)相比通常相對暗淡葱蝗，必須使用高靈敏度的FACS分選儀穴张。 對于細胞周期調節(jié)的蛋白，可能還需要在特定的細胞周期階段同步細胞两曼，以使細胞富集FACS信號皂甘。 質粒轉染后7-10 d陽性標記細胞的效率介于0.05％和10％之間（例如，圖3）悼凑，但通常約為0.5％偿枕。 HeLa Kyoto wt細胞用作陰性對照并定義背景信號（圖3璧瞬，上圖； HeLa細胞渐夸，0.04％GFP陽性）嗤锉，并相應設置陽性GFP細胞的門。 對于mEGFP-NUP358墓塌，獲得了1.76％的mEGFP-NUP358陽性細胞（圖3瘟忱，下圖； mEGFP-NUP358）苫幢，并分入96孔板中酷誓。

連接PCR

可以使用結合在基因組基因座中同源臂外部和重組熒光標簽內的引物，通過PCR檢測熒光標記物是否正確整合到預期的基因座中（圖4a）态坦。 為了確定所有等位基因是否都被熒光標記標記（純合性）盐数，使用位于左右同源臂外側的引物。 所得的一種或兩種PCR產物分別表示純合或雜合伞梯。 但由于兩種PCR產物之間的競爭玫氢，可能無法檢測到雜合克隆中的標記基因（圖4b）。 因此谜诫，建議在同源臂內用引物重復連接PCR漾峡，這會導致PCR產物縮短（圖4c）并改善兩種PCR產物的擴增。 但是喻旷，當使用目標位點的GOI引物時生逸，純合標記的基因將始終僅產生一種PCR產物（圖4，克隆號97）且预。

sanger測序

用靶區(qū)域周圍的引物進行PCR槽袄，然后進行Sanger測序41,42，以檢測基因組位點標簽插入位點內的突變锋谐。親代wt細胞和供體質粒的序列用作參考遍尺。圖5顯示了一個測序實例，隨后進行比對分析涮拗。兩個不同的表達mEGFP–NUP358的HeLa Kyoto細胞克隆純合（圖5乾戏，tagged 97）或雜合（圖5，tagged 118和untagged 118）與mEGFP–NUP358供體質粒和HeLa Kyoto wt序列比對三热。 HeLa Kyoto wt和未加標簽的118個不包含預期的mEGFP鼓择，但是在編號內有一個缺失（63 nt）。未標記的NUP358的第一個外顯子缺失6個氨基酸（圖5就漾，untagged 118號）呐能。但是，同一克隆的mEGFP–NUP358（圖5从藤，tagged 118）是正確的催跪，并且mEGFP的整合在插入位點（圖5，tagged 118）沒有任何突變夷野，正如預期的那樣懊蒸。純合子克隆97僅包含標記的mEGFP– NUP358，從而將mEGFP正確插入目標位點（圖5悯搔，tagged 97的位置）骑丸。因此，mEGFP已正確插入NUP358的N末端妒貌，該純合標簽的克隆可用于進一步的實驗通危。

另外，如果在第一輪基因組編輯之后僅存在雜合細胞克隆灌曙，則對雜合細胞克隆的所有未標記等位基因進行測序菊碟，以檢測靶區(qū)域內可能的突變。這很重要在刺，因為點突變可能會阻礙第二輪基因組編輯的gRNA結合逆害。由于FP的結構和大小，某些蛋白質無法被純合標簽蚣驼，這會干擾蛋白質的功能魄幕。

Southern印跡分析

Southern印跡分析對于顯示純合性和排除標簽的脫靶整合非常重要。針對該標簽的探針應僅在Southern印跡上產生一種預期的產物（圖6颖杏，GFP探針纯陨，mEGFP– NUP358）。但是留储，在某些情況下翼抠，會檢測到其他DNA片段，這表明供體質粒的隨機整合或dsDNA斷裂后由于基因組重排而引起的其他脫靶效應（圖6获讳，GFP探針机久，綠色星號）。也可以插入多個mEGFP標簽如克隆1和18所示（圖6赔嚎，GFP和NUP358印跡膘盖，克隆1和18，綠色星號）尤误，導致標記的DNA片段發(fā)生移位侠畔。隨機插入的標簽的表達應通過蛋白質印跡分析進行徹底研究，因為多余的FP會干擾下游實驗（如定量活細胞成像）的結果4损晤。

與同源臂外的內源目的位點結合的探針可檢測雜合性和純合性（圖6软棺，NUP358探針，Nup358和mEGFP–NUP358）尤勋。純合子克隆僅產生一種預期產物喘落，其大小與針對該標簽的探針相同（圖6茵宪，克隆編號97），而雜合子克隆有兩種產物瘦棋，一種用于標記的基因稀火，一種用于未標記的基因（圖6 克隆號118）。感興趣的內源基因座內可能發(fā)生重排赌朋，并通過額外的意外條帶檢測到（圖6凰狞，NUP358探針，紅色星號）沛慢。此外赡若，某些樣本（例如克隆26和27）可以顯示出帶有標簽GOI較小尺寸的產品，這與預期的一樣团甲，這可能是由于該區(qū)域內的缺失所致逾冬。

綜上所述，沒有額外的意外DNA片段的克隆將用于進一步的實驗躺苦。

蛋白質印跡分析

熒光標記的蛋白的表達通過蛋白質印跡分析進一步表征（圖7）粉渠。 FP抗體（例如抗GFP）以預期的大小將標記的POI的特異性表達檢測為特定條帶（圖7，上圖圾另，抗GFP霸株，mEGFP–NUP358 = 385 kDa）。當將供體質粒插入常染色質區(qū)域時集乔，其隨機整合可引起游離FP的表達去件，可檢測到27kDa蛋白帶。在HeLa對照樣品中可見一個弱的非特異性條帶扰路，大小與游離GFP相同尤溜，進而會干擾游離GFP的檢測。該非特異性條帶最有可能是由于抗體的非特異性汗唱，這可以通過使用不同的抗體來解決宫莱。測試了來自多家公司（例如Abcam，Santa Cruz Biotechnology哩罪，Rockland和MBLand Roche）的GFP抗體授霸，發(fā)現(xiàn)由Roche產生的GFP抗體最敏感，最特異性际插。但是碘耳，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358克隆26和122似乎表達少量的游離mEGFP，因為使用GFP抗體可檢測到較HeLa Kyoto wt細胞高的27 kDa的條帶（圖7框弛，上圖辛辨，抗GFP）。

游離FP的表達可能會干擾蛋白質表征實驗，例如定量活細胞成像斗搞。表達游離GFP的克隆不可用于進一步的實驗指攒。利用蛋白質印跡分析內源引入的標簽也可用于檢測其他游離FP /標簽的表達。

如Mahen等人1所示僻焚，針對POI的特異性抗體（如果可用）對于區(qū)分純合和雜合克隆非常有用允悦。 但是，在mEGFP–NUP358的情況下溅呢，這是不可行的，因為蛋白大猿挚，無法通過常規(guī)蛋白質印跡分析檢測到358 kDa的未標記NUP358和385 kDa的標記的mEGFP–NUP358之間的差異咐旧。

細胞周期分析

在基因組編輯過程后，細胞周期可能會受到標簽或脫靶效應的影響绩蜻。我們小組的主要興趣是參與細胞分裂和細胞周期控制的蛋白質的表征铣墨。因此，我們建立了由自動延時顯微鏡和分析組成的自動化工作流程办绝，以一次測量許多細胞的細胞周期動力學（圖8）伊约。可以使用帶有適當標記物的高通量顯微鏡對其他感興趣的細胞功能進行類似的測定孕蝉。

首先屡律，將細胞核用SiR-DNA染色以確定每個單個細胞的細胞周期狀態(tài)。隨后降淮，每5分鐘執(zhí)行一次自動活細胞成像超埋，持續(xù)24小時（圖8a）。圖像被自動分析追蹤單個細胞佳鳖，檢測相間和有絲分裂細胞并測量有絲分裂時間（圖8b霍殴，c）。例如系吩，測量從前期開始到后期開始的有絲分裂時間（圖8c）并進行統(tǒng)計評估（圖8d）来庭。將有絲分裂的持續(xù)時間與wt細胞的持續(xù)時間進行比較。丟棄具有明顯延長的細胞克麓┌ぁ（圖8d月弛，mEGFP-CDC20，克隆140）和縮短的有絲分裂時間（圖8d科盛，mEGFP-Bub3尊搬，克隆74）。

分析每個標記基因的所有細胞克隆的有絲分裂時間土涝。例如佛寿，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358細胞的所有克隆在有絲分裂期間均表現(xiàn)為HeLa Kyoto wt細胞（圖9），這證實了它們在諸如FCS校準的4D活細胞成像2,4等未來實驗中的用途。

必需的對照

內源性標記POI的優(yōu)勢在于冀泻，標記的蛋白不僅保留其生理表達水平常侣，而且還保留其功能。但是弹渔，可能的脫靶效應和使用的FP可能會影響這一點胳施。因此，必須開發(fā)驗證工作流程來分析POI的正確表達和功能肢专。

在生成和驗證工作流程中舞肆，需要考慮幾個控件。對照完全按照樣品準備博杖。每個驗證步驟中每個樣品/對照的制備在“程序”部分中有詳細說明椿胯；在這里，我們提供所需控件的摘要剃根。

gRNA功能測試的陰性對照是未轉染的細胞對照哩盲，陽性對照是已驗證的gRNA對（步驟26）。陰性對照的PCR產物帶應只有一個條帶狈醉，而用T7E1消化的配對切口酶樣品應具有預期的幾個切割帶廉油。 T7E1分析的替代方法是TIDE。 TIDE包括目標區(qū)域的擴增苗傅，Sanger測序和通過專門開發(fā)的分解算法對序列痕跡進行分析抒线，該算法可識別計劃的編輯位點中的主要誘導突變并準確確定其在細胞群體中的頻率43。

FACS期間內源標記蛋白的表達水平可能非常低渣慕。因此十兢，必須使用HeLa Kyoto wt細胞作為陰性對照來區(qū)分非特異性和特異性FP / mEGFP表達水平（步驟42）。

來自親本細胞系（例如HeLa Kyoto）和水的基因組DNA可用作陰性對照摇庙，以驗證標簽在正確位點的整合并通過連接PCR測試純合性（步驟48A）旱物。

從親本細胞系（例如HeLa Kyoto細胞）制備的基因組DNA可用作Southern印跡分析（步驟48B）和Sanger測序（步驟48C）中的陰性對照，以區(qū)分標記的DNA和未標記的DNA卫袒。

在蛋白質印跡分析中宵呛，可將源自親本細胞的蛋白質提取物用于比較未標記蛋白和標記蛋白的表達水平（步驟48D）。

可以通過在固定細胞的顯微鏡檢查過程中使用針對POI的抗體來確認標記POI的正確定位（步驟49B）夕凝。

將內源標記細胞系的細胞周期與親代細胞（例如宝穗，HeLa Kyoto細胞）的細胞周期時序進行了比較（專欄1）。

與內源標記的POI相比码秉，親本細胞系中POI的表達和功能至關重要逮矛。但是，如果POI未知转砖，將很難評估這些方面须鼎，并且可能必須生成一些工具鲸伴，例如抗體。

材料

試劑

gRNA克隆

T7E1

細胞培養(yǎng)

轉化

FACS

連接PCR

Southern Blot

sanger測序

Western Blot

活細胞和細胞周期分析

實驗過程

gRNA設計 - 1d

gRNA設計晋控。設計一對gRNA汞窗，一個與反義鏈結合，另一個與有義鏈結合赡译，以使其中一個與目標位點（例如ATG或終止密碼子）結合或盡可能接近仲吏。同源重組將最有效地發(fā)生在靶位點的100 bp之內，并且在該區(qū)域之外效率顯著降低蝌焚。使用http://crispr.mit.edu/或https://benchling.com/crispr9,44,45設計兩個不同的gRNA對裹唆。可容忍的脫靶應包含至少2個核苷酸不匹配且位于PAM序列的8-12 nt 5'種子區(qū)域內只洒。

設計用于gRNA克隆的寡核苷酸许帐。使用BbsI消化pX335載體，并在gRNA支架之前將一對退火的寡核苷酸克隆到pX335載體中红碑。根據(jù)目標位點序列（20 bp）設計寡核苷酸舞吭，其中3 bp NGG PAM序列位于3'末端泡垃，但不包括PAM位點析珊。如https://www.addgene.org/crispr/zhang/（表1）所述，我們向gRNA中添加了BbsI位點蔑穴，以將寡核苷酸克隆到pX335載體中忠寻。

訂購表1中所示的寡核苷酸。

供體的設計合成14–21 d

供體設計存和。設計供體質粒DNA上熒光標記基因（例如奕剃，編碼mEGFP或mCherry）兩側包含GOI兩側500至800 bp同源臂。熒光標記替換起始密碼子或終止密碼子捐腿，并與GOI和內源啟動子一致纵朋。如果同源臂的末端富含GC或包含任何重復區(qū)域，則應將其縮短茄袖；否則800 bp效果很好操软。標簽和基因之間應有l(wèi)inker維持標簽蛋白的功能（可以使用5x甘氨酸或5x甘氨酸/絲氨酸重復序列）46；但是宪祥，如果有一個已知的linker已用于POI聂薪，則最好使用該linker。如果需要蝗羊，在同源臂和插入物之間包含額外的克隆位點可以交換標簽或linker（補充圖1）藏澳。如果必須標記兩個POI，則應使用mEGFP標記表達最低的蛋白質耀找，因為它比mCherry明亮且穩(wěn)定翔悠。使用單體熒光標簽，例如mEGFP，mCherry或mCer3凉驻。供體的設計通常取決于gRNA腻要，因為它應該與內源基因不同。否則涝登，gRNA也會切割供體雄家，導致HDR效率降低。因此胀滚，最好在起始或終止密碼子之間使用gRNA（取決于N端或C端標簽）趟济，以使供體由于插入標簽而不同于內源性基因組基因座。關鍵咽笼！供體質粒中不含哺乳動物細胞的選擇標記顷编。如果在哺乳動物細胞中使用抗生素選擇，則供體質粒到細胞基因組中的隨機整合將增加剑刑。此外媳纬，供體質粒內不應存在CMV，RSV或任何其他外源啟動子施掏；否則钮惠，標記蛋白質的表達水平將不是生理性的，并且會出現(xiàn)偽影七芭。

供體的基因合成素挽。使用Geneart（Thermo Scientific）或Genewiz（Sigma-Aldrich）合成供體。關鍵狸驳！供體的合成可能需要長達21天的時間预明，具體取決于同源臂中的G / C％和重復序列。在生產期間耙箍，進行gRNA克隆和T7E1分析

將gRNAs克隆到pX335-u6-chimeric-bb-cbh-hspcas9n（D10a）載體 4 d

將每個gRNA寡核苷酸的正向和反向鏈重懸至ddH2O中的終濃度為100 μM撰糠。

100 μM正向和反向儲備液各4 μl混合均勻。

使用以下參數(shù)在熱循環(huán)儀中對正向和反向寡核苷酸（表1）進行退火：95°C持續(xù)5分鐘辩昆，然后以0.1°C / s（?5°C / m）的斜率冷卻至25°C

結合以下成分阅酪，用BbsI（BpiI）消化pX335-U6-chimeric-BB-CBh-hSpCa9n（D10A）載體：

孵育后，將40 μl的消化產物中加入8 μl的6x上樣染料卤材，在含SYBR Safe染料的TBE緩沖液中的1％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上樣遮斥，并在100 V下運行約20分鐘。

根據(jù)供應商手冊扇丛，使用QIAquick凝膠純化試劑盒純化8.4 kb的消化產物术吗。 用30 μl EB緩沖液（試劑盒的一部分）洗脫DNA。

使用Roche快速連接試劑盒將退火的寡核苷酸連接到BbsI消化的pX335中帆精。 準備每個gRNA的寡核苷酸和用于以下連接反應的無插入陰性對照：關鍵较屿！在先前公布的方案9中隧魄，對退火的寡核苷酸進行了磷酸化處理，并對載體進行了去磷酸化處理隘蝎，這可能導致假陽性菌落數(shù)量增加或完全沒有菌落购啄。 當前的方案可靠地產生了正確插入gRNA寡核苷酸的陽性菌落，盡管您可能會發(fā)現(xiàn)有時只產生幾個菌落嘱么。

-17轉化提質粒

測序確認sgRNA正確插入質粒

使用t7e1測試grnas功能 5 d

-22培養(yǎng)HeLa Kyoto細胞

在轉染前1 d狮含，在2 ml正常生長培養(yǎng)基中的六孔細胞培養(yǎng)皿上每孔接種1.5×105個細胞，并在37°C曼振，5％CO2下孵育1 d几迄。轉染過程中細胞應至少融合50％。

第二天冰评，將gRNA質粒在200 μl jetPrime緩沖液中稀釋映胁，濃度如下表所示。

-32轉染后培養(yǎng)細胞提取基因組

Touchdown PCR甲雅。 設計引物最終產生的700至1,000 bp PCR產物解孙。 通過CRISPR–Cas9成功切割此PCR產物應產生兩個片段。 每個剪切片段應為?300 bp抛人，長度應相差100–200 bp弛姜，在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上產生兩個可檢測的條帶。 使用HotStar HighFidelity PCR試劑盒擴增目標區(qū)域函匕，并如下所述設置每個反應：

使用以下循環(huán)條件放大目標區(qū)域：

在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上跑2 μl PCR產物娱据。 應該存在一個擴增片段蚪黑。 將3 μl PCR產物放在冰上盅惜，以備以后在步驟36中進行分析。

使用剩余的15 μl PCR產物進行以下變性/再退火循環(huán)以生成異源雙鏈DNA：

通過添加1.8 μl 10×NEB緩沖液2和1.2 μl T7核酸內切酶I消化15 μl異源雙鏈DNA忌穿。在37°C下孵育30分鐘抒寂。

在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上分析18 μl T7E1消化產物。 運行3 μl未消化的PCR產物以比較切割效率掠剑。 陰性對照的PCR產物帶應只有一個條帶屈芜，而用T7E1消化的成對的雙切口酶樣品應具有預期的幾個切割帶。 在步驟39中應使用具有最高切割效率的gRNA對朴译，將熒光標記基因導入目標基因座井佑。

使用質粒的配對CRISPR–Cas9方法 7–10 d

關鍵！CRISPR-Cas9配對方法已用于許多哺乳動物細胞系6眠寿、7躬翁、16-18。 必須優(yōu)化每個細胞系的轉染條件盯拱。 下述條件最適合HeLa Kyoto細胞盒发。

用gRNA和供體質粒轉染HeLa Kyoto細胞例嘱。在轉染前，在2毫升Opti-MEM I培養(yǎng)基的六孔細胞培養(yǎng)皿中宁舰，每孔接種1.5×105個細胞拼卵，以使細胞饑餓。轉染前1 d在37°C蛮艰，5％CO2下孵育細胞腋腮。轉染過程中細胞應至少融合50％。關鍵壤蚜！當將細胞接種到無血清的培養(yǎng)基（如OptiMEM I）中時由于饑餓和G1阻滯低葫，純合子產率可提高2％。因此仍律，細胞在轉染后進入S期嘿悬。在細胞周期的這一階段同源重組更頻繁。

（第2天）確保在轉染過程中細胞至少融合60％水泉。如下表所示善涨，在200 μl jetPrime緩沖液中稀釋從步驟37中選擇的gRNA質粒和供體質粒。充分混合并加入4 μl jetPrime溶液草则，在室溫下孵育15分鐘钢拧，然后將轉染復合物添加到細胞中。在37°C和5％CO 2下孵育4小時后炕横，將轉染培養(yǎng)基替換為正常生長培養(yǎng)基并培養(yǎng)細胞源内，直到它們匯合至?80％

（第3-10天）當細胞達到約80％匯合時傳代。 轉染后7-10 d對1–2×107個細胞進行單細胞分選份殿。

Facs選擇表達熒光標簽的單細胞克隆 10–19 d

關鍵膜钓！單細胞分選可能會導致某些細胞系的生長問題。 因此卿嘲，重要的是建立最佳的生長條件颂斜，例如通過使用條件培養(yǎng)基。 條件生長培養(yǎng)基包含由親代細胞系產生的生長因子拾枣。 條件培養(yǎng)基是一種體積的培養(yǎng)基的混合物沃疮，其中親代細胞系在其中生長了幾天，另一種體積是新鮮的完全生長培養(yǎng)基梅肤。 HeLa Kyoto細胞在單細胞分選中存活得比較好司蔬，存活率為30–50％。 用至少一個轉染的10 cm細胞培養(yǎng)皿（如果可能姨蝴，用1–2×15 cm細胞培養(yǎng)皿俊啼，每個含有1-2×107細胞）進行FACS，并將親本細胞系用作陰性對照 似扔。

（第1天）準備五個用于單細胞分選的96孔板吨些，每個孔中添加100 μl生長培養(yǎng)基搓谆。

準備用于FACS單細胞分選的細胞。從HeLa Kyoto細胞的10厘米培養(yǎng)皿中除去生長培養(yǎng)基豪墅。每10厘米培養(yǎng)皿用5–10 ml PBS洗滌細胞泉手。加入1-2 ml 0.05％的胰蛋白酶-EDTA，在室溫下孵育直到細胞幾乎從培養(yǎng)皿中分離（1-5分鐘）偶器。除去0.05％的胰蛋白酶-EDTA斩萌，并加入2 ml FACS緩沖液。徹底重懸細胞屏轰，并用細胞過濾器通過試管過濾細胞颊郎。使用HeLa Kyoto細胞作為FACS的陰性對照。

對表達熒光標記的細胞（通常為mEGFP或mCherry）進行單細胞分選霎苗，將其放入含有100 μl生長培養(yǎng)基的96孔板中姆吭，產生至少五個含有單細胞的96孔板。內源性標記蛋白的熒光信號通常相對較暗唁盏。陽性標記細胞的效率在陽性細胞的0.05-10％范圍內内狸，通常為0.5％。

（第2至12天）讓細胞克隆在完全生長的培養(yǎng)基中于37°C厘擂，5％CO2下生長2至12 d昆淡。約5天后檢查細胞生長在哪些孔中，單細胞克隆作為單個菌落生長刽严。丟棄含有多細胞克隆的孔昂灵，這些克隆會在孔的不同區(qū)域以多個菌落的形式生長。培養(yǎng)單細胞克隆舞萄，使約50％的孔被細胞覆蓋眨补。

（第10–12天）要挑選克隆裁厅，請去除培養(yǎng)基并用1x PBS沖洗細胞一次。向每個孔中添加20μl胰蛋白酶理卑，在室溫下孵育1分鐘曹宴，除去胰蛋白酶，添加100μl完全生長培養(yǎng)基疮装，并將所有細胞轉移至96孔板的新鮮孔中。

（第13天和第14天），如步驟45所述吊履，通過胰蛋白酶消化將96孔板分開，并準備DNA復制品调鬓。

讓克隆在96孔板上的37°C艇炎，5％CO2的完全生長培養(yǎng)基中生長，直到準備評估克隆是否表達正確標記的POI為止腾窝。通過胰酶消化（約80％融合）分裂細胞

敲入細胞系的驗證缀踪。 按照選項A進行連接PCR居砖，以驗證熒光標記已整合到正確的位點并進行純合性測試。 按照選項B進行Southern印跡分析驴娃，再次顯示純合性并排除標簽的脫靶整合奏候。 按照選項C進行Sanger測序，以檢測基因組位點標簽插入位點內的突變唇敞。 按照選項D進行蛋白質印跡分析蔗草，以研究隨機插入標簽的表達。

（a）驗證熒光標記在正確的位置整合疆柔，并通過連接pcr測試純合性 1 d（i）設計用于連接PCR的寡核苷酸咒精。正向引物在左同源臂外側5'端，反向引物結合熒光標記基因（表1）旷档。檢測所有等位基因是否在正確的基因座處標記（即它們被純合標記）模叙，左同源臂外側5'的正向引物和位于右同源臂外側3'的反向引物。使用該引物組的兩種PCR產物將指示雜合克滦（補充圖2）向楼。

（ii）關鍵步驟連接PCR不是定量PCR；因此谐区，有時無法檢測到雜合克隆中的標記基因湖蜕，因為兩種PCR產物之間存在競爭（圖4）。如果在檢測標記的基因時出現(xiàn)問題宋列，建議使用用于T7E1分析的引物重復連接PCR昭抒，這將導致PCR產物更短，從而改善兩種PCR產物的擴增炼杖。但是灭返，使用T7E1引物進行實驗的缺點是引物將位于同源臂內，這也會擴增隨機整合的供體質粒坤邪。純合標記的基因將總是產生一種PCR產物熙含。由親代細胞系（例如HeLa Kyoto細胞）制備的基因組DNA用于檢測未標記的基因。水控制用于檢測PCR期間可能發(fā)生的污染艇纺。

（iii）-（v）連接PCR的DNA制備怎静。直接從96孔板中除去培養(yǎng)基，加入30 μl DNA裂解緩沖液黔衡。 重懸細胞并將DNA溶液轉移到PCR管中蚓聘。

（vi）將DNA溶液在56°C孵育1小時，然后在95°C孵育10分鐘盟劫。 暫停poInt將DNA儲存在4–8°C夜牡，直至進一步使用。

（vii）連接PCR侣签。使用HotStar HighFidelity PCR試劑盒擴增目標區(qū)域塘装，每個反應的設置如下：

使用以下循環(huán)條件放大目標區(qū)域：

（viii）-（xii）跑核酸電泳膠檢測