圖1

文章是Clinical Cancer Research的分?jǐn)?shù)在8-10分昧绣，本研究其實(shí)是建立在以前卵巢癌分型基礎(chǔ)上展開的，彌補(bǔ)了之前一些研究的缺陷，嚴(yán)格了入組標(biāo)準(zhǔn)和研究方法缺猛。第一，再過去的幾十年中HGSOC診斷標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)有了顯著的改變椭符，所以現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)極有可能混雜了其他類型的樣本荔燎，對(duì)于這一點(diǎn)，本研究對(duì)樣本做了嚴(yán)格的篩選销钝，包括公共數(shù)據(jù)庫(kù)和自有數(shù)據(jù)有咨。第二，在過去的研究中主要用的都是無監(jiān)督聚類蒸健，而且各個(gè)研究的方法不用座享，得到的特定基因不同婉商，本研究是從無監(jiān)督聚類轉(zhuǎn)到有監(jiān)督分類模型。第三渣叛，本研究使用的NanoString平臺(tái)丈秩，在很多醫(yī)院的病理實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)使用，對(duì)卵巢癌分型進(jìn)入到臨床階段又近了一步淳衙。

（有個(gè)別翻譯有問題的地方請(qǐng)見諒~寫簡(jiǎn)書不是為了翻譯蘑秽，一是為了把自己看過的東西記錄下來，二是如果文章中有其他人需要的內(nèi)容可以去翻查箫攀，三是為了把自己的理解寫下來有問題的地方可以有人提問肠牲，多交流學(xué)習(xí)）

一、背景

基于以前研究過靴跛，高級(jí)別漿液性卵巢癌分型包括：

C1/Mesenchymal (C1.MES)：主要表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化埂材，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的成分高表達(dá)，其預(yù)后效果差汤求。

C2/Immunoreactive (C2.IMM) ：瘤內(nèi)CD3+/CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)俏险，炎癥因子高表達(dá)，預(yù)后較好扬绪。

C4/Differentiated (C4.DIF)：瘤內(nèi)CA125/MUC16高表達(dá)竖独，臨床表征與C2.IMM無區(qū)別。

C5/Proliferative (C5.PRO)：瘤體通常耗盡基質(zhì)和免疫組分挤牛，癌胚胎和干細(xì)胞基因高表達(dá)莹痢，預(yù)后不佳。

基因表達(dá)層面的HGSOC分子亞型在臨床上還沒有統(tǒng)一的分型標(biāo)準(zhǔn)墓赴，今年6月加拿大溫哥華總醫(yī)院竞膳，英國(guó)哥倫比亞大學(xué)卵巢癌研究中心聯(lián)合美國(guó)多所大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)嘗試突破現(xiàn)有臨床局限性和基因分子優(yōu)勢(shì)性，提出PrOTYPE – 最小基因集HGSOC預(yù)測(cè)器诫硕。

二坦辟、前期工作

這部分不是我的研究重點(diǎn)，只是大概寫幾點(diǎn)章办。關(guān)于樣本如何篩選锉走，病理檢查的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)詳細(xì)流程，看補(bǔ)充文件比較好藕届。非專業(yè)人員也不敢保證翻譯的全部正確挪蹭，有興趣仔細(xì)研究，看原文休偶。我在這里提一下只是說明文章補(bǔ)充文件詳細(xì)寫了這部分內(nèi)容梁厉。

1.樣本來源：來自英國(guó)，歐洲踏兜，澳大利亞词顾，加拿大和美國(guó)的卵巢腫瘤組織分析聯(lián)合會(huì)的20項(xiàng)研究提供了4071例用Nanostring分析的高級(jí)別漿液性輸卵管卵巢癌樣本（GSE135820）

2.樣本篩選和病理檢查：（1）至少一張有代表性的H&E玻片和福爾馬林固定的石蠟包埋組織（2）納入排除標(biāo)準(zhǔn)：排除復(fù)發(fā)只冻，新輔助化療樣本，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和腹水计技。（3）在三個(gè)病理學(xué)中心進(jìn)行了病理學(xué)回顧：不列顛哥倫比亞癌癥研究中心喜德，美國(guó)洛杉磯的南加州大學(xué)，澳大利亞墨爾本彼得麥卡倫癌癥中心垮媒，在每個(gè)中心安排婦科病理專家進(jìn)行病理檢查

3.額外的臨床數(shù)據(jù)：年齡舍悯，分期，腫瘤細(xì)胞和壞死睡雇，BRCA1/BRCA2有害突變狀況萌衬，種族， 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)計(jì)數(shù)等

4.NanoString 基因選擇：NanoString CodeSte包含的513個(gè)基因來源：1.根據(jù)以前報(bào)道的排名靠前的差異基因它抱；2.以前亞型分類的監(jiān)督學(xué)習(xí)分類亞型特異基因秕豫；3.手動(dòng)回顧文獻(xiàn)確定的與亞型相關(guān)的常見分子途徑中的基因；4.在meta分析與預(yù)后價(jià)值和其他特定假設(shè)選擇基因观蓄；5.為確保轉(zhuǎn)錄組表達(dá)混移，我們標(biāo)記并包含了來自之前報(bào)道中99%相關(guān)基因表達(dá)簇的其他基因；6.五個(gè)管家基因侮穿，是指所有細(xì)胞中均要穩(wěn)定表達(dá)的一類基因歌径，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的（RPL19，ACTB亲茅，PGK1回铛，SDHA，POLR1B）克锣。

5.RNA提取

6.NanoString過程

三茵肃、分析流程

圖2

? ? 大致講一下分析流程，后邊補(bǔ)充詳細(xì)一些的袭祟。分析包括了兩個(gè)獨(dú)立流程验残，圖2 A中兩組樣本array data是公共數(shù)據(jù)庫(kù)中樣本，按照入組條件過濾榕酒，然后進(jìn)行聚類胚膊，聚類分析用了九種故俐，之后通過K-mode方法將聚類結(jié)果合成一個(gè)結(jié)果想鹰。做分類模型，array數(shù)據(jù)集中的分類模型用了9種药版，TCGA分類模型用了5中辑舷，在驗(yàn)證集中驗(yàn)證選擇最好的模型，array data和TCGA兩組數(shù)據(jù)分別形成兩個(gè)模型槽片。從array數(shù)據(jù)中到Nanostring數(shù)據(jù)需要驗(yàn)證可移植性何缓，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中有兩組數(shù)據(jù)可以驗(yàn)證肢础。之后將兩個(gè)模型同時(shí)對(duì)Nanostring數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，選擇相同分類結(jié)果的樣本碌廓。對(duì)相同結(jié)果的樣本重新做分類模型传轰，篩選最小預(yù)測(cè)樣本集」绕牛基本思路是這個(gè)樣子慨蛙。

四、詳細(xì)流程

1.1Array data和TCGA data分類模型

圖3

????Array data有四種來源纪挎，在49個(gè)項(xiàng)目中的3437個(gè)樣本期贫。排除：92個(gè)重復(fù)或者非標(biāo)準(zhǔn)治療樣本，1121例診斷為非HGSOC樣本异袄，475個(gè)研究大小不符合（在樣本入組要求中通砍，有提到入組研究樣本量大于40）。剩余14個(gè)studies烤蜕，1650個(gè)樣本封孙，Training1 1322例，confirmation1 328例讽营；Confirmation2 98例樣本敛瓷。不同樣本集的批次校正選擇了XPN和EB兩種方法，檢驗(yàn)批次校正結(jié)果的方法采用了主成分分析（PCA）和主方差分析（PVCA斑匪，這個(gè)我沒查到呐籽，覺得是不是就是傳統(tǒng)方差分析）。之后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化蚀瘸，之后是聚類分析狡蝶，聚類分析包括Kullback-Leibler散度的非負(fù)矩陣因子分解（NMF-LEE）；歐幾里距離的Kmeans贮勃；Spearman距離的Kmeans聚類贪惹；Manhattan距離的Kmeans聚類；Euclidean距離的Kmeans聚類寂嘉；歐幾里距離的medoids聚類奏瞬；Spearman距離的medoids聚類；manhattan距離的medoids聚類泉孩；隱模式的塊聚類硼端。最后通過K-mode方法把九種聚類方法結(jié)果聚類成一種。批次效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果顯示XPN的結(jié)果更好（圖4）寓搬。

圖4

圖5

? ? 分類模型因?yàn)橐贜anostring中應(yīng)用珍昨，所以按照Nanostring中的513個(gè)基因進(jìn)行篩選。array中共有12536個(gè)基因通過，通過過濾條件刪除樣本最終剩余454個(gè)基因镣典。TCGA數(shù)據(jù)集中的12042個(gè)基因過濾完剩余438個(gè)基因在Nanostring基因集中兔毙。

圖6

????通過將其他基因減去關(guān)機(jī)基因的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，之后的基因表達(dá)量不再是絕對(duì)值兄春，而是相對(duì)于管家基因的相對(duì)量澎剥，方便移植到Nanostring平臺(tái)中。array data中分類模型用的是線性判別分析(LDA)赶舆、隨機(jī)森林(RF)肴裙、微陣列預(yù)測(cè)分析(PAM)、多元lasso回歸（MLR_lasso）涌乳，多元嶺回歸（MLR_ridge）蜻懦，K臨近分類（KNN），自適應(yīng)提升樹（adaboost）夕晓，貝葉斯（nbayes）宛乃，支持向量機(jī)模型（SVM）模型。TCGA數(shù)據(jù)中的分類模型為對(duì)角線線性判別分析(DLDA)蒸辆、隨機(jī)森林(RF)征炼、K臨近分類（KNN），支持向量機(jī)（SVM）躬贡，逐步提升（GBM）谆奥。

1.2模型驗(yàn)證

? ? ? ? ?Array data內(nèi)部驗(yàn)證是Trainning，外部驗(yàn)證兩個(gè)數(shù)據(jù)集是圖3中的confirmation1 328例拂玻；Confirmation2 98例樣本酸些。在Traning數(shù)據(jù)中top5的模型如圖7

圖7

? ?挑選了top5算法在confirmation1中測(cè)試， 首先使用ssGSEA在CLOVAR（ 高級(jí)別漿液性卵巢癌的預(yù)后相關(guān)基因特征）中公開的基因集和澳大利亞卵巢癌研究（AOCS）數(shù)據(jù)集對(duì)樣本進(jìn)行分類檐蚜。ssGSEA定義的CLOVAR魄懂、AOCS定義一致的樣本占241/328。在一致的241個(gè)樣本中進(jìn)行分類闯第。五個(gè)模型的準(zhǔn)確度在0.747到0.784之間市栗。（這一步操作有疑問，猜測(cè)是通過CLOVAR中的和AOCS中關(guān)于每個(gè)亞型的特有基因咳短，用ssGSEA分別計(jì)算每個(gè)樣本的亞型賦分填帽，怎么做的分型真的是沒get到，有興趣看看圖8）在confirmation2中驗(yàn)證咙好，各模型的準(zhǔn)確率為adaboost：0.91篡腌；lasso：0.89，ridge：0.89敷扫；randomforest：0.88哀蘑，SVM：0.93诚卸，在預(yù)處理的NanoString data數(shù)據(jù)集中adaboost：0.79葵第；lasso：0.81,绘迁；ridge：0.81；randomforest:0.74;SVM:0.26卒密。

圖8

? ? ? ? TCGA樣本集驗(yàn)證缀台，由于TCGA下載到的數(shù)據(jù)就是歸一化和批次校正過的。所以不需要這些處理哮奇。亞型分類標(biāo)簽是從TCGA中獲得的膛腐。內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果，如圖9所示鼎俘。外部驗(yàn)證使用來自Tothill等人的數(shù)據(jù)集哲身。使用已發(fā)表的子類型標(biāo)簽作為外部數(shù)據(jù)集來評(píng)估分類器的準(zhǔn)確性。 從GEO(GSE9899)下載RMA歸一化數(shù)據(jù)和log2轉(zhuǎn)換表達(dá)式數(shù)據(jù))贸伐。 然后對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化勘天，使其具有零均值單位方差。 然后將轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)作為輸入捉邢，以獲得樣本的子類型標(biāo)簽脯丝。 然后利用樣本的已發(fā)表標(biāo)簽來計(jì)算分類器的精度。外部驗(yàn)證的準(zhǔn)確性如圖10所示伏伐。

圖9

圖10

1.3可移植性

????confirmation2樣本集驗(yàn)證宠进，all array model在98個(gè)樣本中比較，預(yù)測(cè)一致的有70個(gè)藐翎，TCGA model在85個(gè)樣本中比較材蹬，預(yù)測(cè)一致的有65個(gè)。兩個(gè)模型分別的預(yù)測(cè)性能都不高吝镣。將兩個(gè)模型同時(shí)對(duì)一個(gè)數(shù)據(jù)集驗(yàn)證赚导，統(tǒng)計(jì)得到相同結(jié)果的樣本數(shù)量。按照kappa一致性檢驗(yàn)的結(jié)果0.92赤惊，可以認(rèn)為公布的標(biāo)簽和兩個(gè)模型預(yù)測(cè)的標(biāo)簽的準(zhǔn)確性的一致性基本可以認(rèn)為是幾乎完全一致吼旧。（Kappa檢驗(yàn)：0.0~0.20極低的一致性；0.21~0.40一般的一致性未舟；0.41~0.60 中等的一致性圈暗；0.61~0.80 高度的一致性；0.81~1幾乎完全一致）.作者還分析了一致樣本和不一致樣本的技術(shù)差異和生物差異裕膀，診斷年齡员串，細(xì)胞數(shù)量，壞死率昼扛，RNA吸光度寸齐，信噪比這些欲诺。

圖11

? ?文獻(xiàn)分享時(shí)有人問怎么判斷陽(yáng)性陰性？這種數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)這么問問題渺鹦，我真的當(dāng)下捯飭不出來啊扰法。簡(jiǎn)單說一下事后的想法，1.樣本標(biāo)簽來源于聚類分析毅厚，眾所周知聚類分析就是把相似的樣本放到一起塞颁，在類中心的樣本肯定是符合類的特性，在類邊緣的樣本很可能就偏離較遠(yuǎn)吸耿，無法確定樣本分類祠锣，就比如一個(gè)色譜，你告訴我藍(lán)色和紅色中間的顏色是屬于藍(lán)色還是紅色咽安。樣本亞型本就是聚類概念伴网，哪來的準(zhǔn)確的陰性陽(yáng)性。2.作者用的公布的標(biāo)簽我認(rèn)為是在臨床研究中生存率或者其他臨床指標(biāo)能確定小于0.05有顯著性妆棒，用這些結(jié)果的分類標(biāo)簽應(yīng)該還是有意義的澡腾。3.我們數(shù)據(jù)分析在確定聚類的類的個(gè)數(shù)的時(shí)候，是按照組內(nèi)組間差異大小確定的募逞，所以不可能讓組內(nèi)完全沒有差異蛋铆，只能是讓差異最小（完全沒差異放接，直接個(gè)性化治療不完了么刺啦，分什么型）。這件事讓我想到的問題就是纠脾，我們永遠(yuǎn)帶著質(zhì)疑站在對(duì)立面玛瘸，去看東西接受東西，從不曾融入文獻(xiàn)去學(xué)東西苟蹈，學(xué)佛和修佛的區(qū)別糊渊。站在對(duì)立面永遠(yuǎn)不知道里邊怎么回事，我更喜歡站在作者角度想慧脱，作者為什么認(rèn)為可以這么做渺绒。而不是這人這么做肯定不對(duì)嘛。

1.4Nanostring數(shù)據(jù)最小預(yù)測(cè)模型的開發(fā)

圖12

圖13

? ? 終于把作者自己的樣本們放出來了菱鸥，上邊的分類模型兩個(gè)一起用宗兼，我們能得到Kappa=0.92的結(jié)果，所以我們用上邊兩個(gè)模型分別對(duì)作者自己的Nanostring樣本做分類得到一致性的樣本標(biāo)簽作為標(biāo)準(zhǔn)氮采。重新做分類模型殷绍。找到最小的基因集。一致的樣本共3030個(gè)鹊漠。

????在Trainning set中1487個(gè)樣本中來自于8個(gè)study主到，8個(gè)study做n-fold交叉驗(yàn)證茶行。1.我們使用booststrap方法重新取樣500次，2.在每500個(gè)重采樣中登钥，我們使用所有基因和三種不同的模型（Randomforest,Lasso,Adaboost）3.在每一中算法和500次重采樣中畔师，我們通過隨機(jī)森林和adaboost的基尼特征重要性排序，以及對(duì)lasso的非0系數(shù)的基因進(jìn)行計(jì)數(shù)怔鳖，計(jì)算基因的重要性4.考慮每個(gè)基因在前100個(gè)重要基因中的比例茉唉，得到最終排名固蛾，共三組5.按照前100重要基因结执，從第四個(gè)基因開始，按照步長(zhǎng)為5艾凯，逐步加入基因献幔。中間還有詳細(xì)的熵計(jì)算，這個(gè)建議看原文趾诗，我只是把過程搞出來了蜡感。

圖14

1.第一個(gè)表是訓(xùn)練集包含1135個(gè)樣本,準(zhǔn)確率100%

2.第二個(gè)表格確認(rèn)集1，共817個(gè)樣本恃泪，準(zhǔn)確率96%

3.第三個(gè)表格驗(yàn)證集1郑兴，共719個(gè)樣本，準(zhǔn)確率95%

4.第四個(gè)表格驗(yàn)證集2贝乎，共283個(gè)樣本情连，準(zhǔn)確率94%

5.第五個(gè)表格overlap集共76個(gè)樣本，準(zhǔn)確率100%

圖15

原諒后邊的潦草览效，有問題我們交流啊~十一假期寫到18:00却舀，也是夠夠的了哈哈哈哈~下班嘍~~~~給祖國(guó)母親慶生去啦~

中秋佳節(jié)快樂~