A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波長,最佳測量值的范圍為0.1至1.0笤休。如果不在此范圍尖飞,稀釋或濃縮樣品,使之在此范圍內(nèi)店雅;如果吸光度小于0.05政基,檢查是否存 在操作因素(如移液不準(zhǔn)確,樣品內(nèi)有懸浮物等)影響闹啦。DNA樣品的A260 吸光度值是否>0.1沮明。(請注意,這個值跟儀器無關(guān)窍奋,核酸的吸光度必需大于0.1荐健,其值才有效和可靠,因為樣品中的雜質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常 會對光有一定吸收琳袄,其值<0.1)江场;A280nm, A270nm
是蛋白最高吸收峰的吸收波長,比值可進行核酸樣品純度評估:純DNA的A260/A280比值為1.8窖逗,純RNA為2.0址否。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚類物質(zhì)的污染碎紊,需要純化樣品佑附。比值=1.5相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm用含。A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長,比值可進行核酸樣品純度評估:純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5帮匾。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染痴鳄,需要純化樣品瘟斜。A230產(chǎn)生負值主要是由 于在很低DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個測定中痪寻,需要降低樣品的稀釋度螺句,A230的負值會被校正。
4. A320nm或A340nm
為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子橡类。該值應(yīng)該接近0.0蛇尚。如果不是,標(biāo)明溶液中有懸浮物顾画,需要純化樣品取劫。純樣品的A320一般是 0。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸純度的指示值研侣。純度好的DNA或RNA谱邪,在pH7-8.5 下A260 / A280的比值應(yīng)該在2.0 或2.5。 純凈的樣品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)庶诡。如果比值低于1.8 或者2.0惦银,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物末誓,如碳水化合物扯俱、鹽(胍鹽)等,較純凈的核酸A260/A230的比值 大于2.0 喇澡。
當(dāng) 0.5%BSA蛋白質(zhì)污染時迅栅,蛋白污染會導(dǎo)致260和280的數(shù)值都下降,其凈結(jié)果是260/280比值下降撩幽,但260/280的比值變化并不顯著库继,正如 分子克隆3所說。但蛋白殘留會導(dǎo)致230的數(shù)值顯著上升窜醉,顯著影響260/230的比值宪萄。也就是說,如果RNA樣品的260/280=1.7榨惰,260 /230=0.5拜英,那么就應(yīng)該考慮污染原因不是胍鹽殘留,而是蛋白殘留.
酚的最大吸收峰在270琅催。酚的殘留會顯著的增加230居凶、260和280的數(shù)值虫给,同時酚的吸收峰與核酸的吸收峰合并后,最大吸收峰向270方向偏移侠碧, 也就是說最大吸收峰在270附近抹估。也就是說,如果RNA樣品的260/280=1~1.5, 260/230=1~1.5弄兜,那么污染原因就應(yīng)該考慮是酚殘留药蜻。