轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptionfactor宫莱，TF)是一種能與特異DNA序列結(jié)合的蛋白丈攒，可以單獨(dú)或與其他蛋白形成復(fù)合體，提高或阻斷特定基因?qū)NA聚合酶的招募授霸，調(diào)控基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)是它包含一個(gè)或多個(gè)DNA結(jié)合域（DNA-binding domain际插，DBDs）碘耳，通過這些結(jié)合域與基因附近的DNA序列結(jié)合，從而完成調(diào)控框弛。下面結(jié)合文章介紹轉(zhuǎn)錄因子的研究方法辛辨。

01??案例文章簡介

案例文章：

Ahr-Foxp3-RORt axis controls?gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）

GPR15是一種趨化因子受體，在T細(xì)胞向大腸歸巢的過程中發(fā)揮重要作用瑟枫。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)小鼠大腸Treg中的GPR15表達(dá)水平最高斗搞，芳香烴受體（Ahr）可通過增加GPR15的表達(dá)促進(jìn)Treg向大腸的歸巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介導(dǎo)的GPR15表達(dá)上調(diào)中分別起到正向及負(fù)向調(diào)控作用慷妙。另外僻焚，在人結(jié)腸Treg中也可重復(fù)上述發(fā)現(xiàn)。該研究提示膝擂，Ahr-Foxp3-RORγt軸可通過調(diào)控GPR15的表達(dá)調(diào)節(jié)Treg的腸道歸巢虑啤，從而影響腸道免疫穩(wěn)態(tài)。

02??案例文章的研究內(nèi)容

GPR15在小鼠大腸Treg中表達(dá)量最高架馋，并且受Ahr控制狞山。GPR15是一種孤兒鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G蛋白）偶聯(lián)趨化劑受體（GPCR），最初是基于其與其它GPCR家族成員的相似性而被發(fā)現(xiàn)的叉寂，也被稱為HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受體萍启。最近有研究表明，GPR15對小鼠和人的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）的腸道歸巢至關(guān)重要屏鳍。芳香烴受體（Ahr）是一種環(huán)境傳感器勘纯，可檢測外源性配體，如環(huán)境毒素（如二惡英）孕蝉，以及宿主細(xì)胞屡律、微生物群和飲食（如色氨酸代謝物）產(chǎn)生的內(nèi)源性配體。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測GPR15蛋白在各種T細(xì)胞中的表達(dá)水平降淮，發(fā)現(xiàn)Treg中GPR15的表達(dá)水平最高超埋。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T細(xì)胞中搏讶，GPR15的表達(dá)水平降低。而在在Ahr過量表達(dá)小鼠的CD4+ T細(xì)胞中霍殴，GPR15的表達(dá)水平升高媒惕。

Ahr通過直接與Gpr15基因座結(jié)合調(diào)節(jié)GPR15表達(dá)。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Gpr15基因是Ahr最重要的全基因組靶點(diǎn)之一来庭。Ahr在Gpr15基因座具有兩個(gè)實(shí)質(zhì)性的結(jié)合峰（在距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)+15和+17 kb處）妒蔚。

Foxp3與Ahr協(xié)同作用，正調(diào)節(jié)GPR15的表達(dá)月弛。在CD4+ T 細(xì)胞中用shRNA干擾Foxp3肴盏，GPR15的表達(dá)水平降低。在來自Ahr+/+小鼠的iTregs細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Foxp3可顯著提高其GPR15的表達(dá)帽衙，在來自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs細(xì)胞中卻沒有這種效果菜皂。在TH0條件下培養(yǎng)的分選CD4+T細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表達(dá)，而Foxp3單獨(dú)表達(dá)并不影響GPR15的表達(dá)厉萝。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的結(jié)合位點(diǎn)與Ahr相同（距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)+15和+17 kb處）恍飘。Ahr缺陷不影響Foxp3在Gpr15位點(diǎn)的結(jié)合，但是在iTreg中敲低Foxp3后谴垫，Ahr向Gpr15基因座的招募減少章母。

RORγt負(fù)向調(diào)節(jié)GPR15表達(dá)。在RORγt缺陷Treg中翩剪，GPR15的表達(dá)增加乳怎。RORγt和GPR15表達(dá)的負(fù)相關(guān)系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明顯。此外肢专，與來自RORγt充足的CD4+ T細(xì)胞分化的iTregs和TH17細(xì)胞相比舞肆，來自RORγt缺陷的CD4+ T細(xì)胞具有更高的GPR15表達(dá)。

RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA結(jié)合博杖。在從RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17細(xì)胞中椿胯，Gpr15基因座的Ahr募集顯著增強(qiáng)，而在沒有Ahr的情況下剃根，Gpr15基因座的RORγt結(jié)合顯著增加哩盲，提示Ahr和RORγt與Gpr15基因座結(jié)合存在競爭。此外在RORγt缺陷iTregs中表達(dá)RORγt抑制GPR15表達(dá)狈醉。

Ahr通過調(diào)節(jié)GPR15促進(jìn)Tregs向腸道歸巢廉油。在大腸（LI）和小腸（SI）中，歸巢的Ahr缺陷iTreg相對于WT對照組減少了大約三倍苗傅。GPR15的強(qiáng)制表達(dá)顯著增強(qiáng)了Ahr缺陷Treg向LI的歸巢抒线，但不增強(qiáng)到包括SI在內(nèi)的其他器官的歸巢，這與GPR15在Treg大腸歸巢中的關(guān)鍵作用一致渣慕。此外嘶炭， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢復(fù)表達(dá)的Ahr缺陷iTreg的歸巢能力相當(dāng)（而不是在SI中）抱慌，這表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表達(dá)受損是其向LI歸巢缺陷主要機(jī)制。在Ahr缺陷的iTregs中強(qiáng)制表達(dá)GPR15促進(jìn)其在炎癥期間歸巢至LI眨猎。此外抑进，強(qiáng)制表達(dá)GPR15的Ahr缺陷iTreg的過繼性轉(zhuǎn)移顯著抑制了腸道炎癥，表現(xiàn)為減輕了腸道組織學(xué)變化和降低了促炎細(xì)胞因子（即Tnf和Il1b）的表達(dá)睡陪。

Ahr信號促進(jìn)GPR15在人Treg中表達(dá)寺渗。與之前的報(bào)告顯示GPR15在人類Treg中的低表達(dá)不同，本研究檢測到GPR15在所有患者樣本中的表達(dá)兰迫。與外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）相比信殊，結(jié)腸Treg的 GPR15表達(dá)顯著增高。人Treg中Ahr mRNA表達(dá)的增加與Gpr15表達(dá)的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表達(dá)增加有關(guān)汁果，這與Ahr促進(jìn)Gpr15表達(dá)的作用相一致鸡号。此外，通過蛋白質(zhì)染色分析GPR15和Foxp3的表達(dá)须鼎，發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達(dá)與人CD127-CD25+ T細(xì)胞中GPR15的表達(dá)呈正相關(guān)。加入Ahr的配體FICZ顯著增強(qiáng)了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表達(dá)府蔗，但不增強(qiáng)Ahr的表達(dá)晋控，而用一種特異性Ahr拮抗劑CH223191治療可消除人iTregs中GPR15的表達(dá)。

03??轉(zhuǎn)錄因子研究的技術(shù)手段

??雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合姓赤，這些特異性的序列被稱為順式作用元件赡译，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)非共價(jià)結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起增強(qiáng)或抑制的作用不铆。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（dual luciferase assay）是檢測轉(zhuǎn)錄因子和靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段蝌焚，通過檢測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的改變對熒光素酶基因表達(dá)水平的影響，分析轉(zhuǎn)錄因子能否作用于啟動(dòng)子誓斥。

其原理簡述如下：

（1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到螢光素酶編碼序列上游的報(bào)告基因質(zhì)粒只洒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒劳坑、干擾質(zhì)帘锨矗或者siRNA與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。通常會(huì)用另一種螢光素酶作為內(nèi)參距芬，避免轉(zhuǎn)染效率對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響涝开。

（3） 加入特定的螢光素酶底物，螢光素酶與底物反應(yīng)框仔，發(fā)光舀武，通過檢測發(fā)光強(qiáng)度可以測定螢光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與靶啟動(dòng)子片段有作用离斩。

??染色質(zhì)免疫共沉淀

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) (chromatin immunoprecipitation assay银舱，ChIP)被廣泛用于研究體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子上特異性核苷酸序列的結(jié)合瘪匿，并已成為研究染色質(zhì)水平基因表達(dá)調(diào)控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白-DNA復(fù)合物纵朋，并將其隨機(jī)切斷為一定長度的染色質(zhì)小片段柿顶，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段操软。通過對目的片斷的純化與檢測嘁锯，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序聂薪，篩選與目的蛋白互作的DNA信息家乘。ChIP-PCR用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子上，而ChIP-seq用于篩選轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合的靶基因藏澳，探究轉(zhuǎn)錄因子的作用元件仁锯。

??電泳遷移率改變試驗(yàn)

電泳遷移率改變試驗(yàn) (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也稱凝膠阻滯試驗(yàn)翔悠，DNA 在凝膠中的遷移率與相對分子質(zhì)量及構(gòu)型有關(guān)业崖。裸露DNA與含有結(jié)合蛋白的DNA- 蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳時(shí)，裸露 DNA 遷移率主要取決于DNA本身蓄愁，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物由于體積較大而滯留在較后位置双炕。電泳遷移率改變試驗(yàn)用于體外分析轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合。將一系列序列不同的DNA片段與轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行電泳遷移率改變試驗(yàn)撮抓，可以探究轉(zhuǎn)錄因子的體外結(jié)合序列妇斤。