質(zhì)譜

質(zhì)譜圖的基本概念

在質(zhì)譜圖中，橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比（m/z）值氧映，從左到右質(zhì)荷比的值增大轧坎，對(duì)于帶有單電荷的離子亿絮，橫坐標(biāo)表示的數(shù)值即為離子的質(zhì)量；縱坐標(biāo)表示離子流的強(qiáng)度强胰，通常用相對(duì)強(qiáng)度來表示翘簇，即把最強(qiáng)的離子流強(qiáng)度定為100%缠沈，其它離子流的強(qiáng)度以其百分?jǐn)?shù)表示摩渺，有時(shí)也以所有被記錄離子的總離子流強(qiáng)度作為100%，各種離子以其所占的百分?jǐn)?shù)來表示剂邮。

主要離子峰

分子離子峰

• 分子受電子束轟擊后失去一個(gè)電子而生成的離子M+稱為分子離子摇幻，例如：M+e¨→M+ + 2e¨

• 在質(zhì)譜圖中由M+ 所形成的峰稱為分子離子峰。因此挥萌，分子離子峰的m/z值就是中性分子的相對(duì)分子質(zhì)量Mr绰姻，而Mr是有機(jī)化合物的重要質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

• 分子離子峰的強(qiáng)弱引瀑，隨化合物結(jié)構(gòu)不同而異狂芋，其強(qiáng)弱一般為：芳香化合物>共軛鏈烯>烯烴>脂環(huán)化合物>直鏈烷烴>酮>胺>酯>醚>酸>支鏈烷烴>醇。分子離子峰的強(qiáng)弱可以為推測(cè)化合物的類型提供參考信息憨栽。

• 一般來說最大質(zhì)量數(shù)的峰就是分子離子峰帜矾，分子離子含奇數(shù)個(gè)電子，也稱母峰,它的質(zhì)量就是分子量屑柔。一般位于質(zhì)譜圖質(zhì)荷比最高位置的一端,它的質(zhì)量數(shù)是化合物的分子量

  • 奇電子離子：含有一個(gè)未成對(duì)電子的離子屡萤；
  • 偶電子離子：不含未成對(duì)電子(即電子全配對(duì))的離子。
  • 相對(duì)于奇電子離子而言繼續(xù)斷裂失去自由基可形成偶電子離子掸宛。奇電子離子常作為分子離子峰的判定死陆。

• 分子離子峰的判定

  • (1)氮規(guī)則

    由C,H,O組成的有機(jī)化合物，分子量一定是偶數(shù)

    不含氮或者含偶數(shù)氮的有機(jī)物的相對(duì)分子量為偶數(shù)唧瘾；

    含奇數(shù)氮的有機(jī)物的相對(duì)分子量為奇數(shù)措译。

    分子離子峰與相鄰峰的質(zhì)量差必須合理

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• (2)質(zhì)譜中常見的中性碎片和自由基

  分子離子峰能夠合理的丟失碎片(中性碎片和自由基)，與其相鄰的質(zhì)荷比較小的碎片關(guān)系合理饰序。而常見的碎片如下表和圖所示

  
  
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  有些化合物沒有分子離子峰领虹。

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- (3)衍生物比較

  不同衍生物的分子離子峰不同。

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- (4)降低電子流電壓

  碎片離子峰強(qiáng)度下降菌羽、分子離子峰強(qiáng)度增加掠械。

- (5)用高分辨質(zhì)譜

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• 分子離子峰強(qiáng)度與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

  (1)碳鏈越長由缆，分子離子峰強(qiáng)越弱。

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(2)存在支鏈有利于分子離子峰的裂解猾蒂，且峰很弱均唉。

正碳離子的穩(wěn)定性：

叔正碳離子>仲正碳離子>伯正碳離子

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(3)飽和醇類、胺類化合物的分子離子峰很弱

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(4)環(huán)狀分子一般有較強(qiáng)的分子離子峰

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碎片離子峰

• 當(dāng)電子轟擊的能量超過分子離子電離所需要的能量時(shí)(約為50~70eV)肚菠，可能使分子離子的化學(xué)鍵進(jìn)一步斷裂舔箭，產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)較低的碎片，稱為碎片離子蚊逢。在質(zhì)譜圖上出現(xiàn)相應(yīng)的峰层扶，稱為碎片離子峰。碎片離子峰在質(zhì)譜圖上位于分子離子峰的左側(cè)烙荷。

同位素離子峰

• 在組成有機(jī)化合物的常見十幾種元素中镜会，有幾種元素具有天然同位素,如C,H,N,O,S,Cl,Br等。所以终抽，在質(zhì)譜圖中除了最輕同位素組成的分子離子所形成的M+峰外戳表，還會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)重同位素組成的分子離子峰，如昼伴、匾旭、等，這種離子峰叫做同位素離子峰圃郊。對(duì)應(yīng)的m/z為M+1价涝、M+2、M+3表示持舆。

• 人們通常把某元素的同位素占該元素的原子質(zhì)量分?jǐn)?shù)稱為同位素豐度色瘩。==同位素峰的強(qiáng)度與同位素的豐度是相對(duì)應(yīng)的==，下表列出了有機(jī)化合物中元素的同位素豐度及峰類型逸寓。

  由下表可見泞遗，S、Cl席覆、Br等元素的同位素豐度高史辙，因此，含S佩伤、C聊倔、Br等元素的同位素其M+2峰強(qiáng)度較大。一般根據(jù)M和M+2兩個(gè)峰的強(qiáng)度來判斷化合物中是否含有這些元素生巡。

重排離子峰

• 分子離子裂解成碎片時(shí)耙蔑，有些碎片離子不是僅僅通過鍵的簡單斷裂有時(shí)還會(huì)通過分子內(nèi)某些原子或基團(tuán)的重新排列或轉(zhuǎn)移而形成離子，這種碎片離子稱為重排離子,質(zhì)譜圖上相應(yīng)的峰稱為重排峰孤荣。
• 重排的方式很多甸陌，其中最重要的是麥?zhǔn)现嘏?/a>(Mclafferty Rearrangement)须揣。可以發(fā)生麥?zhǔn)现嘏诺幕衔镉?a target="_blank" rel="nofollow">醛钱豁、酮耻卡、酸、酯等牲尺。這些化合物含有C=X(X為O,S,N,C)基團(tuán)卵酪，當(dāng)與此基團(tuán)相連的鍵上具有γ氫原子時(shí)，氫原子可以轉(zhuǎn)移到X原子上谤碳，同時(shí)β鍵斷裂溃卡。例如，正丁醛的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)很強(qiáng)的m/z=44峰蜒简，就是麥?zhǔn)现嘏潘纬傻?/li>

亞穩(wěn)離子峰

• 前面所闡述的離子都是穩(wěn)定的離子瘸羡。實(shí)際上，在電離搓茬、裂解最铁、重排過程中有些離子處于亞穩(wěn)態(tài)。例如垮兑，在離子源中生成質(zhì)量為m1的離子，在進(jìn)入質(zhì)量分析器前的無場(chǎng)飛行時(shí)發(fā)生斷裂漱挎，使其質(zhì)量由m1變?yōu)閙2系枪，形成較低質(zhì)量的離子。這類離子具有質(zhì)量為m1離子的速度磕谅，進(jìn)入質(zhì)量分析器是具有m2的質(zhì)量私爷，在磁場(chǎng)作用下，離子運(yùn)動(dòng)的偏轉(zhuǎn)半徑大膊夹，它的表觀質(zhì)量m*=[m2]^2/m1衬浑，這類離子叫亞穩(wěn)離子，m*形成的質(zhì)譜峰叫亞穩(wěn)離子峰放刨，在質(zhì)譜圖上工秩，==m*峰不在m2處，而出現(xiàn)在比m2更低的m*處==进统。

• 由于在無場(chǎng)區(qū)裂解的離子m不能聚焦與一點(diǎn)助币，故在質(zhì)譜圖上m峰弱而鈍一般可能跨2~5個(gè)質(zhì)量單位，并且m/z常常為非整數(shù)螟碎，所以m*峰不難識(shí)別眉菱。

  例如,在十六烷的質(zhì)譜圖中，有若干個(gè)亞穩(wěn)離子峰掉分，其m/z分別位于32.9俭缓、29.5克伊、28.8、25.7华坦、21.7處愿吹。m/z=29.5的m*，因41^2/57≈29.5季春，所以m*=29.5表示存在如下裂解機(jī)理：C4H9+→C3H5+ + CH4

  m/z=57 m/z=41

  由此可見洗搂，根據(jù)m1和m2就可計(jì)算m*，并證實(shí)有m1+→m2+的裂解過程载弄，這對(duì)解析一個(gè)復(fù)雜質(zhì)譜圖很有參考價(jià)值耘拇。

基峰

在質(zhì)譜圖中相對(duì)強(qiáng)度最大的碎片離子峰

質(zhì)譜圖解析的一般步驟

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CID

二級(jí)質(zhì)譜中的誘導(dǎo)碰撞解離（Collision-Induced Dissociation）方式。通過與中性分子碰撞將能量傳遞給離子的過程宇攻。能量傳遞足以導(dǎo)致鍵的開裂和重排惫叛。

通過CID會(huì)產(chǎn)生碎片，碎裂過程如下：ABCD+→ABC+ + D（中性碎片）

電荷保留在質(zhì)子親和勢(shì)較高的碎片上

質(zhì)譜與色譜

色譜圖

Basepeak 圖

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Basepeak圖是色譜分離過程中將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)==最強(qiáng)的肽段的強(qiáng)度值==連續(xù)描繪得到的圖譜逞刷。圖中峰多信號(hào)強(qiáng)說明樣品復(fù)雜度高量也足嘉涌。由于上機(jī)的樣品是蛋白質(zhì)酶解后的肽段，所以如果你要問小編能否將鑒定到的蛋白質(zhì)在basepeak圖上標(biāo)出來夸浅，答案是不能!!!

TIC圖

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全稱為Total ion chromatogram仑最，即總離子流圖，相比Basepeak圖是用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度最高的母離子繪制的圖譜帆喇，TIC則是樣品中所有離子的色譜圖警医。

XIC圖

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全稱是Extracted ion chromatogram，即提取離子流色譜圖,為某個(gè)特定母離子的色譜圖坯钦，XIC圖的峰面積可以用于蛋白定量分析预皇。

質(zhì)譜

一級(jí)質(zhì)譜圖是一次質(zhì)譜全掃描內(nèi)所有母離子的信號(hào)分布圖，二級(jí)質(zhì)譜圖是特定母離子在高能碎裂后產(chǎn)生的二級(jí)離子的信號(hào)分布圖婉刀，樣品經(jīng)質(zhì)譜鑒定后生成的質(zhì)譜文件實(shí)質(zhì)是數(shù)萬張一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖的疊加吟温。

原始二級(jí)質(zhì)譜圖，如下圖(m/z=377.54)突颊，為實(shí)際檢測(cè)到的二級(jí)離子的質(zhì)荷比的分布圖鲁豪，只有一個(gè)個(gè)孤獨(dú)的峰，代表一個(gè)個(gè)孤單的子離子律秃，沒有歸屬呈昔，只有將其大小與宗氏族譜(理論的肽段序列碎裂后生成的二級(jí)離子分布)匹配后，方能知道其名姓(肽段序列)友绝。匹配后的圖就是文章里提到的有注釋信息的二級(jí)圖堤尾，也叫做b,y離子匹配圖。修飾組學(xué)及一段肽的蛋白發(fā)文章時(shí)可能會(huì)被要求提供b,y離子匹配圖迁客。

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將實(shí)際檢測(cè)到的二級(jí)離子的質(zhì)荷比分布與肽段序列斷裂后理論形成的子離子匹配后的圖譜

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肽段在能量作用下斷裂后會(huì)生成一個(gè)個(gè)b,y離子對(duì)郭宝。左面的碎片為b離子辞槐，右邊的碎片為y離子，以上圖為例粘室，KTQAASVEAVK理論生成的b,y離子對(duì)為：

第一個(gè)氨基酸與第二個(gè)氨基酸中間斷開(K|TQAASVEAVK)榄檬，則生成b1=K(從左往右數(shù)1)，y10=TQAASVEAVK(從右往左數(shù)10);

第二個(gè)與第三個(gè)氨基酸中間斷開(KT|QAASVEAVK)衔统，生成b2=KT,y9= QAASVEAVK;其他位置斷開鹿榜，依次類推。

本肽段中如果第一個(gè)氨基酸K上發(fā)生了泛素化修飾(已經(jīng)標(biāo)紅)锦爵，我們應(yīng)該如何找出該位點(diǎn)被修飾的證據(jù)呢?

泛素化是指泛素（一類低分子量的蛋白質(zhì)）分子在一系列特殊的酶作用下舱殿，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子险掀，并對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程

肽段碎裂后檢測(cè)的b3(KTQ),b4(KTQA)離子可能帶有修飾集團(tuán)沪袭，以b3為例，如果K上發(fā)生修飾樟氢，則b3的分子量應(yīng)該比不帶修飾的b3(KTQ)理論分子量(376.22-18.01(QA連接是脫了水的)=358.21)多一個(gè)修飾集團(tuán)glygly-的分子量(114.04)冈绊，即=358.21+114.04=472.25埠啃，而我們檢測(cè)到的b3離子的分子量剛好為472.25，說明b3(KTQ)離子攜帶了泛素化修飾集團(tuán).因泛素化常發(fā)生在K上毅该，推測(cè)應(yīng)為K發(fā)生了泛素化修飾。

區(qū)分同位素峰和不同價(jià)態(tài)的峰

• 同位素峰：從多電荷譜圖中選一個(gè)峰拉開叹螟，即為同位素峰。同位素峰的帶電荷量==通通相等==（即價(jià)態(tài)相同）罢绽。

? 同位素峰之間的==質(zhì)量M==不同静盅，因?yàn)橥凰胤N類良价，數(shù)量不同所造成的。

• 不同價(jià)態(tài)的峰蒿叠，即多電荷譜圖中所呈現(xiàn)的明垢。比如A峰和B峰痊银，==質(zhì)量M相等施绎，但帶電荷量不同==贞绳≈孪。可設(shè)電荷為n，聯(lián)立方程算出n抖单。

• 無論從同位素峰還是不同價(jià)態(tài)峰來算n矛绘，最終目的都是求質(zhì)量M！

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以1137.0597拉開后的同位素峰中的1137.0455與1137.2958為例羹应，1137.2958-1137.0455=0.2503 次屠，1/Z=0.2503 , Z=4, 所以M=4×==1136.5450===4546.18 ==要以第一個(gè)原型峰來算M!!== 所以1137.0597為4價(jià)，物質(zhì)質(zhì)量為4546.18

但裸违，4546.18不準(zhǔn)本昏，它還帶了4個(gè)H，所以要減去這個(gè)重量怔昨，所以精確的M=4546.18-4×1.0078=4542.1488

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? 設(shè)1654.3103所帶電荷為n宿稀，則1819.6238所帶電荷為n-1,聯(lián)立方程得：1654.3103n=1819.6238(n-1)祝沸，n=11.007(n的值一定要接近整數(shù)，小數(shù)位后要夠小罩锐，若為11.500左右則不行)

所以M=n×1654.3103-11×1.0078

功能肽因子的氨基酸組成及序列鑒定

• 在質(zhì)譜分析中奉狈，物質(zhì)被離子化后按離子的質(zhì)荷比 (m/z) 大小進(jìn)行分離涩惑，通過測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而達(dá)到分析的目的。電噴霧電離 (ESI) 屬于最軟的電離方式蟀拷，通常只產(chǎn)生分子離子峰问芬，適宜中等極性到強(qiáng)極性化合物分子的分析，能分析小分子肽及大分子蛋白等此衅。ESI 電離小分子得到 [M+H]+ 或 [M+Na]+等單電荷離子挡鞍，而電離生物大分子（如蛋白質(zhì)和 DNA 等）則產(chǎn)生多電荷離子。通常來說道媚，正離子掃描模式適合于堿性樣品翘县，樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考慮使用正離子模式；負(fù)離子掃描模式適合于酸性樣品镀脂，樣品中含有較多的強(qiáng)負(fù)電性基團(tuán)如含 CI忘伞、Br 等時(shí)可使用負(fù)離子模式。