學(xué)習(xí)小組DAY07--CGJ

了解測序

測序目前已經(jīng)發(fā)展到了第三代原献，但是我個人感覺用的最多的還是二代測序。

一代測序

20世紀70年代埂淮，F(xiàn)rederic Sanger 發(fā)明了雙脫氧終止反應(yīng)法姑隅，通過加入ddNTP在擴增過程中結(jié)合到相應(yīng)位置，然后利用電泳分開擴增的片段倔撞，讀出一個一個的堿基讲仰，準確路十分高，但是低通量痪蝇。

二代測序

二代測序鄙陡，高通量冕房，速度快，但是錯誤率增加趁矾。
主要的平臺包括：　
1.羅氏454公司的GS FLX sequencer
2.Illumina solexa genome analyzer
3.ABI公司的SOLiD sequencer

流程

第一步

首先是建庫耙册，將DNA用超聲波打斷，然后用酶將末端補平毫捣，然后再3‘端加入一個A堿基详拙，在兩端加上互補配對的adapter，再通過PCR擴增達到一定濃度蔓同，構(gòu)成單鏈DNA文庫溪厘。

第二步

上樣至flowcell（流動池中，里面有不同的lane）牌柄，DNA片段與lane表面的短序列配對畸悬，進行橋式PCR擴增

擴增

加入堿性液體解聚，沖刷掉未共價結(jié)合的DNA模板鏈珊佣，繼續(xù)擴增

擴增

最終形成簇

擴增

橋式PCR完成后蹋宦，通過切割，沖洗形成單鏈DNA咒锻。

第三步

接下來進行測序冷冗，加入測序引物以及含疊氮基團及熒光基團的dNTP，這樣邊合成邊測序惑艇，加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并使dNTP 3’ 疊氮基團變成羥基蒿辙，繼續(xù)進行下一步合成直至所有測完。
完成之后進行index1的測序滨巴，通過index1的引物來測定思灌，之后再測index2序列。

index測序

之后就再進行橋式PCR恭取，只不過這次最后留下來的是Reverse模板鏈泰偿，就相當(dāng)于反向測序一次，這樣就完成了雙端測序蜈垮。

三代測序

三代測序發(fā)展方向太多耗跛，人們希望提高測序效率、提高測序通量攒发、提高測序準確率调塌、避免PCR擴增和避免熒光檢測等等。但準確率同樣變低惠猿。
三代測序包括：
Pacific BioSciences公司的實時單分子測序（real-time single-molecule）和complete genomics公司的復(fù)合探針-錨定連接技術(shù)（combinatorial probe-anchor ligation羔砾，cPAL），都依靠熒光檢測來測序，但他們提高的是測序速度和通量蜒茄；
Life technologies公司的離子流探測測序設(shè)備（Ion torrent）使用離子流場效應(yīng)半導(dǎo)體感應(yīng)器（ion-sensitive field effect transistor）,依靠邊合成邊測序的中心概念唉擂，檢測每次添加堿基時候釋放出的離子流，從而避免了傳統(tǒng)第二代的熒光檢測檀葛；
Oxford nanopore公司的納米孔單分子測序技術(shù)玩祟，同樣也避免了熒光檢測和對主體DNA序列的PCR擴增。
三代測序?qū)Ρ热缦聢D（圖來自生信星球）