學(xué)習(xí)資料：陳巍學(xué)基因：https://www.bilibili.com/video/av79295678?from=search&seid=11730831477922519685
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原理解讀：三種主流單細(xì)胞RNAseq的建庫策略
單細(xì)胞RNA需要解決兩個難題
1、單細(xì)胞中RNA含量非常少床估。一個人類細(xì)胞中總RNA的含量為10pg含滴，而其中rRNA占95%左右，而mRNA占2%-3%丐巫，大概是0.2pg谈况，而測序?qū)τ诤怂崃康男枨鬄閡g級別勺美，因此需要通過PCR等方法將核酸擴增百萬倍。如何在擴增中不引入過多的PCR偏差碑韵，則是一個大問題赡茸。PCR偏差是指PCR過程中只擴增序列特異的序列
2、如何可以盡可能高效得到mRNA文庫祝闻。
技術(shù)介紹
1占卧、Smart-seq2
是由clonetech公司開發(fā)，全名為switching mechanism at 5‘ end of RNA template联喘，其核心技術(shù)是兩個特殊引物加MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄起始引物：一段通用序列（用于PCR擴增的引物識別序列）+dT+V(A/G/C)+N(A/G/T/C)华蜒，其中dT保證了其可以捕獲mRNA，而V保證了序列可以結(jié)合mRNA3’ployA的末端豁遭，即從非A的位置開始擴增叭喜，N保證了序列可以完成所有mRNA的擴增。 這樣就可以保證該引物引起的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)起始于mRNA 3‘的序列終止位置
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶：進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)蓖谢，同時在轉(zhuǎn)錄到mRNA5’末端時會產(chǎn)生幾個ployC捂蕴，這樣保證了可以獲得完整的mRNA序列，同時方便上游引物的結(jié)合闪幽。
上游引物：3‘端存在幾個非脫氧的G堿基啥辨，即RNA的G堿基，可以與上述過程新合成的ployC末端進行互補盯腌，之后重新發(fā)揮MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用溉知，將序列逆轉(zhuǎn)錄，獲得左右添加了PCR序列的完整的序列腕够。這條cDNA序列可以通過正常的PCR擴增進行建庫着倾。
技術(shù)特點：
1、先用一個定位引物（起始引物）燕少，保證cDNA的合成是從mRNA的3’末端開始的，同時讓合成的cDNA加上通用PCR引物序列
2蒿囤、利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在新合成的cDNA的3‘端客们，多加幾個C的特點，再用含有3個G的上游引物進行第二鏈的合成材诽，這就保證了只有完整的第一鏈的cDNA才能合成第二鏈底挫，即只有完整的cDNA才能合成第二鏈。
3脸侥、保證了PCR效率的一致性建邓。由于5’和3‘引入了同一PCR序列（每個序列都相同），這樣就減少了PCR自身的偏好性睁枕。
下圖為smart-seq2的原理圖官边，是smart-seq的改進版沸手，但基本原理不變。具體過程參考上述鏈接
2注簿、10X genomics 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
是由10X genomics公司開發(fā)的一項基于油包水乳濁液酶反應(yīng)原理的分子生物學(xué)分析系統(tǒng)契吉，它把微珠加DNA標(biāo)簽、微滴反應(yīng)诡渴、酶反應(yīng)和高通量測序等過程結(jié)合捐晶，目前該系統(tǒng)可以做兩件事情：1、可以做一群細(xì)胞中每個單細(xì)胞的RNA表達情況的定量分析妄辩；2惑灵、可以做染色體的單倍體長片段的組裝
一張芯片是4X8共32個孔，一次可處理8個樣本眼耀，從下到上依次為油孔英支、樣本孔、微珠孔和回收乳濁液的孔畔塔。
工作原理
1潭辈、預(yù)制微珠的構(gòu)成：微珠+read1+10xbarcode(16bp,共400萬種，相當(dāng)于微珠的身份證澈吨，每個barcode差至少存在兩個堿基的不同)+UMI（unique multiplex index把敢，10bp，每一個DNA分子理論對應(yīng)一個UMI谅辣，可以通過對UMI種類的計數(shù)修赞，排除PCR bias,相當(dāng)于DNA的身份證）+dT +VN(捕獲mRNA)
2、油包水模型：微珠（水平）+ 細(xì)胞和酶（垂直1）+油（垂直2）桑阶，排放到油相環(huán)境中柏副，形成外油內(nèi)水的小液滴，每個小液滴理論上由一個微珠+細(xì)胞（0/1/2）+酶體系構(gòu)成蚣录，包含細(xì)胞的個數(shù)服從泊松分布
3割择、液滴中細(xì)胞破裂，釋放RNA萎河，并在酶環(huán)境下與珠子上的引物結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)荔泳，產(chǎn)生cDNA，并帶上上述標(biāo)簽
4虐杯、水相全部抽出玛歌，混合后加測序接頭，高通量測序
5擎椰、一個樣本細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)在一萬以下支子，效果最好（防止產(chǎn)生多細(xì)胞入一個珠子的情況）
6、一般來說达舒，每個細(xì)胞檢測的read數(shù)目達到300k左右值朋，即飽和叹侄，每個細(xì)胞的umi數(shù)目在40k到80k比較合理。
