注意：本文完全摘抄于簡書：iTRAQ定量蛋白質(zhì)組筆記(上)

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前言

這篇筆記是騰訊課堂上的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析教程的筆記杆煞，教程的全稱是《iTRAQ定量蛋白質(zhì)組》教程中涉及到的蛋白質(zhì)譜使用的方法是iTRAQ，分析的物種是玉米腐泻，雖然與我的方向不一致决乎，但是原理與數(shù)據(jù)分析的思路都是相通的，這一部分僅是背景知識派桩。

這個視頻教程筆記分2篇构诚，上篇主要是蛋白質(zhì)譜背景知識介紹，以及文獻(xiàn)中的常規(guī)思路分析铆惑。

下篇主要是進行案例訓(xùn)練范嘱。

蛋白質(zhì)組知識背景

蛋白質(zhì)組(proteome)：由一個細(xì)胞、一個組織或一個機體的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)员魏，是一個整體的概念丑蛤。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)：以蛋白質(zhì)組為研究對象，從蛋白質(zhì)整體水平來認(rèn)識重合活動規(guī)律的科學(xué)逆趋，是后基因組計劃的重要組成部分盏阶。

蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平闻书、翻譯后的修飾名斟、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病機理魄眉、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識砰盐。

蛋白質(zhì)組學(xué)分類

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常用的是非標(biāo)Label Free，以及標(biāo)記的iTRAQ分板技術(shù)坑律。

定量蛋白組學(xué)

定量蛋白組學(xué)：研究不同條件下蛋白表達(dá)水平的變化（上下調(diào)情況）岩梳。

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iTRAQ知識背景

iTRAQ的全稱是Isobaric tag for relative and absolute quantitation，翻譯為中文就是同重元素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)晃择。這是由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同重同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)冀值。該技術(shù)利用同位素試劑可同時標(biāo)記8個多肽樣品，標(biāo)記的多肽樣品等量混勻后宫屠，經(jīng)液相色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析列疗，可得到各肽段的一、二級質(zhì)譜信息浪蹂。

在一級質(zhì)譜中抵栈，不同樣品來源的同一肽段表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比；

在二級質(zhì)譜中坤次，化學(xué)鍵斷裂釋放出iTRAQ報告離子古劲，在質(zhì)譜低質(zhì)量區(qū)產(chǎn)生了8個報告離子峰，其強度反應(yīng)了該肽段在不同樣品中的相對表達(dá)量信息缰猴，另外二級質(zhì)譜中的肽段碎片離子峰質(zhì)荷比反應(yīng)了該肽段的序列信息产艾；這些質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，可得到蛋白質(zhì)的定性和相對定量信息滑绒。

iTRAQ技術(shù)在微生物抗協(xié)迫機制和動植物發(fā)育分化機理研究及醫(yī)學(xué)生物標(biāo)記物篩選領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用胰舆。

iTRAQ：采用4種或8種同位素標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團蹬挤，進行串聯(lián)質(zhì)譜分析從而比較不同樣本中蛋白質(zhì)的相對含量缚窿，其特點是：

蛋白通量高，覆蓋度高焰扳；
定量準(zhǔn)確倦零，可信度高；
分離能力強吨悍、分析范圍廣扫茅，定性結(jié)果可靠；
自動化程度高育瓜、分析時間快葫隙，分離效果好。

定量蛋白質(zhì)組原理

iTRAQ試劑

iTRAQ試劑是可與氨基酸末端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標(biāo)記的同位素元素躏仇；
iTRAQ試劑由三部分組成：報告基團恋脚、質(zhì)量平衡基團和肽反應(yīng)標(biāo)記試劑基團腺办；
報告基因：常見4標(biāo)或8標(biāo)，可同時標(biāo)記4組或8組樣品糟描，報告基團有8種分子量怀喉，范圍從113到121（無120）；
平衡基因：保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同船响，平衡基團也8有種不同的分子量躬拢，與不同的報告基團搭配，能保證被標(biāo)記的不同來源的同一肽段在一級質(zhì)譜中具有相同的質(zhì)荷比见间，就是下圖中右側(cè)的部分聊闯，在上圖，也就是a圖中米诉，它們的荷質(zhì)比都是145.10菱蔬，在下圖，也就是b圖中荒辕，荷質(zhì)比都是305.10汗销；
肽反應(yīng)標(biāo)記基團：可與肽段N端及辣氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價連接，從而標(biāo)記上肽段抵窒。

這幾個試劑的結(jié)構(gòu)如下所示：

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（圖片來源于：Aggarwal S., Yadav A.K. (2016) Dissecting the iTRAQ Data Analysis. In: Jung K. (eds) Statistical Analysis in Proteomics. Methods in Molecular Biology, vol 1362. Humana Press, New York, NY,277）

iTRAQ的實驗流程原理

在質(zhì)譜峰圖中弛针，雖然不同樣本帶有不同的同位素標(biāo)簽，但是經(jīng)過質(zhì)量平衡基因的平衡李皇，任何一種試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白多肽表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比削茁，從而形成單一的峰。

在串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果中掉房，經(jīng)過激光通量轟擊肽段茧跋，iTRAQ試劑的三部分之間的鍵斷裂，平衡基因斷裂卓囚，平衡基團丟失瘾杭，不同同位素標(biāo)簽的同一多肽的離子信號表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比的峰，因此可根據(jù)波峰的高度和面積比較同一蛋白不同處理的定量信息哪亿，如下所示：

（圖片出處為：Aggarwal S., Yadav A.K. (2016) Dissecting the iTRAQ Data Analysis. In: Jung K. (eds) Statistical Analysis in Proteomics. Methods in Molecular Biology, vol 1362. Humana Press, New York, NY粥烁，P278）

一級質(zhì)譜：

二級質(zhì)譜：

常規(guī)實驗流程

實驗流程如下所示：

第一步：蛋白酶解樣本，也就是將蛋白樣本酶解為肽段蝇棉；

第二步：使用iTRAQ同位素標(biāo)記讨阻，也就是使用不同的iTRAQ標(biāo)簽來標(biāo)記不同的肽段樣本；

第三步：SCX預(yù)分級篡殷，使用強陽離子交換SCX（HPLC）將肽段分為多個組分钝吮；

第四步：使用LC-MS對每個組分進行質(zhì)譜檢測。

質(zhì)譜儀的組成部分

蛋白質(zhì)譜的核心就質(zhì)譜，原理就是樣本在特定條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚龠\動的離子奇瘦，根據(jù)離子質(zhì)荷比的不同在靜電場和磁場作用下進行分離棘催，再用特定檢測器記錄不同質(zhì)荷比的各離子的相對強度并形成質(zhì)譜圖。

質(zhì)譜儀

質(zhì)譜儀：在真空狀態(tài)下分析離子的質(zhì)荷比m/z链患，質(zhì)譜儀主要是由離子源巧鸭、質(zhì)量分析器和離子檢測器組成瓶您，iTRAQ技術(shù)中常用LC-MS/MS麻捻，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜。

離子源：將蛋白或多肽變成氣態(tài)的帶電離子呀袱，常用的有2類：①電噴霧電泳ESI贸毕；②基質(zhì)輔助激光解吸電離MALDI（脈沖方式使用樣本離子化0；
質(zhì)量分析器：將離子源形成的離子按質(zhì)荷比大小分開：常見有的5類：①四級桿(Quadrupole)夜赵；②離子阱(Ion trap)明棍；③飛行時間(TOF)；④傅里葉(FTICR)寇僧；⑤軌道阱(Qrbitrap)摊腋。

質(zhì)量分析器的參數(shù)

質(zhì)量分析器的質(zhì)量范圍是指測定質(zhì)荷比范圍，它決定了能檢測到的離子范圍嘁傀，例如ESI離子源可產(chǎn)生許多質(zhì)荷比大于3000的離子兴蒸，但是如果質(zhì)量分析器的上限達(dá)不到3000，則就無法檢測大于3000的離子细办。

分辨率：觀測到的質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比/半峰高處的峰寬(FWHM)橙凳。

不同類型質(zhì)量分析器的比較

不同質(zhì)量分析器有不同的分辨率，其中傅里葉>軌道阱>時間飛行>離子阱>四級桿笑撞，具體的參數(shù)如下所示：

市場上不同型號質(zhì)譜儀的比較：

其中在使用iTRAQ分析時岛啸，比較常用的是Thermo的Q-Exactive與Q-Exactive HF。

離子檢測器：①直接檢測器茴肥；②電子倍增器坚踩；③閃爍檢測器。
液相色譜LC：利用物質(zhì)在流動相和固定相中的分配系數(shù)差異瓤狐，進行分離檢測瞬铸。
質(zhì)譜MS：把不同質(zhì)荷比的離子分開排列成譜。

實驗方案設(shè)計

教學(xué)視頻中的案例是植物方向芬首，其實原理跟動物方向一樣的赴捞，以下的都是植物蛋白質(zhì)譜的實驗設(shè)計。

方案設(shè)計-生物學(xué)重復(fù)

至少設(shè)置3個以上的生物學(xué)重復(fù)郁稍；
為了增加實驗結(jié)果的可靠性赦政，可通過增加質(zhì)譜的技術(shù)重復(fù)上機次數(shù)；
嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炌ǔ＿M行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，也就是一共9批MS數(shù)據(jù)恢着；
出于經(jīng)費考慮桐愉，有的文獻(xiàn)也只進行2-3次技術(shù)重復(fù)（在動物實驗方面，技術(shù)重復(fù)就是同一個樣本上3針質(zhì)譜即可）掰派。

方案設(shè)計-不同組樣本的標(biāo)記選擇和上機組合

兩組樣品

常見的組合包括2組从诲，3組，4組靡羡，5組系洛，6組樣本，現(xiàn)在以植物干旱無罪推定研究為例說明一下略步。

假設(shè)我們有2組樣本描扯，對照組這里用CK表示，它表示正常澆水趟薄；實驗組使用Treatment不勝感激绽诚，它表示不澆水3天，現(xiàn)在有2個方案：

第一個方案：每組2個生物學(xué)重復(fù)杭煎，1個3標(biāo)恩够；

第二個方案：第組3個生物學(xué)重復(fù)，1個6標(biāo)羡铲，如下所示：

三組樣本

現(xiàn)在將實驗擴展一下蜂桶，我們使用3組：

對照組：CK，正常澆水犀勒；

干預(yù)組不澆水屎飘，包括2組：

不澆水3天：T1

不澆水6天：T2

第一個方案：每組兩個生物學(xué)重復(fù)，1個6標(biāo)贾费；

第二個方案：每組3個生物學(xué)重復(fù)钦购，3個4標(biāo)或1個9標(biāo)，如下所示：

四組樣本

對照組：CK褂萧，正常澆水

處理組：Treatment

不澆水3天：T1

不澆水6天：T2

不澆水9天：T3

方案一：每組2個生物學(xué)重復(fù)押桃，1個8標(biāo)；

方案二：每組3個生物學(xué)重復(fù)导犹，3個4組唱凯，如下所示：

五組樣本

對照組：CK，正常澆水

處理組：Treatment

不澆水1天：T1

不澆水2天：T2

不澆水3天：T3

不澆水4天：T4

方案一：每組3個生物學(xué)重復(fù)谎痢，3個5標(biāo)磕昼；

方案二：每組3個生物學(xué)重復(fù)，3個6標(biāo)节猿，如下所示：

六組樣本

對照組：CK票从，正常澆水

處理組：

不澆水1天：T1

不澆水2天：T2

不澆水3天：T3

不澆水4天：T4

不澆水5天：T5，如下所示：

實驗方案小結(jié)

需要比較的差異分組放在同一組標(biāo)記中浸间；
不同組織部位不要放在一組標(biāo)記中檢測魁蒜；
生物學(xué)重復(fù)可分批上機，此時可不需要內(nèi)參兜看；
可將所有樣本混合作為內(nèi)參仿野，分析時可通過內(nèi)參間接找到有無變化的蛋白質(zhì)她君。

蛋白數(shù)據(jù)分析流程

iTRAQ定量蛋白組數(shù)據(jù)分析流程如下所示：

從質(zhì)譜儀上拿到的數(shù)據(jù)是原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)脚作，然后要將原始數(shù)據(jù)進行一個數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后缔刹，要進行搜庫來鑒定蛋白質(zhì)球涛，這一步是要看找到了多少個蛋白質(zhì)，隨后對找到的蛋白進行蛋白定量校镐。

定量后就是各種分析亿扁，包括GO，KEGG鸟廓，蛋白相互作用等从祝。

[一]搜庫

搜庫是指通過實驗得到的譜圖與數(shù)據(jù)庫中的理論譜圖進行匹配，得到可能的肽段序列引谜，從而鑒定蛋白質(zhì)牍陌，進行搜庫的操作就是將質(zhì)譜儀得到的譜圖輸入到搜庫軟件，常用的搜庫軟件包括：

ProteinPilot(AB SCIEX)
Proteome Discoverer(Thermo scientific)
Mascot（這個軟件是上述2個軟件的核心）

數(shù)據(jù)的產(chǎn)生其實就是：蛋白->肽段->譜圖员咽；而數(shù)據(jù)分析就是這個過程的逆過程毒涧，即譜圖->肽段->蛋白。

整個流程如下所示：

搜庫的原理

搜庫軟件運行的主要步驟包括：

從數(shù)據(jù)庫中選擇分子量與輸入值相等的肽段贝室；
形成理論碎片契讲，并進一步生成理論譜圖；
將實驗譜圖與理論譜圖進行匹配滑频；
對匹配進行打分捡偏；
按打分進行排序，通過統(tǒng)計學(xué)分析峡迷，確定最佳的匹配結(jié)果并導(dǎo)出银伟。

流程示意圖如下所示：

搜庫數(shù)據(jù)庫的選擇

數(shù)據(jù)庫的選擇是基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)鑒定策略中的重要一步售葡，最終鑒定到的蛋白序列都來源于被選擇的數(shù)據(jù)庫挟伙。

如果是已經(jīng)測序的生物，直接選用該物種蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI)介却，或同批樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的蛋白庫齿坷。
如果是非測序生物，則選擇與被測樣本最為相關(guān)的大類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫遂蛀；
NCBInr分類庫李滴，包括動物全庫、植物全庫包竹、微生物全庫周瞎、細(xì)菌全部庫等。
SwissProt/UniProt分類庫彼乌，動物全庫慰照、植物全庫稚铣、微生物全庫惕医、細(xì)菌庫等抬伺。

蛋白質(zhì)譜鑒定的結(jié)果

定量蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目一般在幾千左右，遠(yuǎn)少于轉(zhuǎn)錄組檢測的表達(dá)的基因數(shù)目和參考基因組的基因數(shù)目，如下所示：

右上圖是根據(jù)分析量來確定的蛋白數(shù)據(jù)，右下圖是根據(jù)肽段來確定的鑒定的蛋白數(shù)目统锤。蛋白鑒定的數(shù)目跟轉(zhuǎn)錄鑒定的基因不在一個數(shù)量級上饲窿，這是因為蛋白質(zhì)譜在實驗的通量，數(shù)據(jù)庫腻脏，實驗技術(shù)方面都有一定的局限做鹰。

[二]蛋白質(zhì)功能注釋

通過搜庫對蛋白質(zhì)進行鑒定后钾麸，接著就是對這些搜到的蛋白進行功能注釋肯腕，這有助于了解蛋白的功能，從而解析樣本相關(guān)表型帖池，常用于功能注釋的數(shù)據(jù)庫有：GO肴甸、COG原在、KEGG、NR浮庐、Pfam、Swiss-Prot斑举，下圖是一個玉米的項目璧坟，玉米的蛋白在各個數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果：

數(shù)據(jù)庫介紹

NR

全稱是Non-redundant protein sequences，包含GenBank所有編碼序列褐澎，以及PDB工三，swissprot俭正，PIR掸读，PRF數(shù)據(jù)庫的所有編碼序列的一個非冗余數(shù)據(jù)庫澡罚，其數(shù)據(jù)庫完整度高留搔；這是一個氨基酸序列數(shù)據(jù)庫。

Pfam

全稱是Protein families database括眠，通過蛋白序列的比對建立了每個家族的氨基酸序列的HMM統(tǒng)計模型，是最全面的蛋白結(jié)構(gòu)域注釋的分類系統(tǒng)萌业；通過識別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域序列婴程，可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能桌粉。

Swiss-Prot

這是上EBI維護的數(shù)據(jù)庫，主要收錄人工注釋的序列及其相關(guān)文獻(xiàn)信息和經(jīng)過計算機輔助分析的序列押逼；注釋結(jié)果包括對蛋白質(zhì)功能挑格、酶學(xué)特性雾消、剪接異構(gòu)體、相關(guān)疾病信息的注釋等待桑腮，注釋結(jié)果無冗余到旦。

COG

全稱是Clusters of Orthologous Groups of proteins，這是一個蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫巨缘。通過對菌類添忘，藻類和真核生物等66個完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進化關(guān)系構(gòu)建而成若锁。這對于預(yù)測單個蛋白的功能和整個基因組中蛋白質(zhì)的功能具有重要的作用搁骑。

GO與KEGG

常見，不介紹又固。

[三]定量

蛋白定量原理回顧

先來了解一下iTRAQ蛋白質(zhì)定量的原理仲器，如下所示：

iTRAQ試劑是等量的，因此不同同位素在標(biāo)記同一多肽后在一級質(zhì)譜檢測中，分子量完全相同蔚晨。
在一級質(zhì)譜檢測到前體離子后進行碰撞誘導(dǎo)解離欢摄，產(chǎn)物離子通過二級質(zhì)譜進行分析。
在二級質(zhì)譜中裁赠，報告基團、質(zhì)量平衡基團和多肽反應(yīng)基團之間的鍵斷裂逐哈，質(zhì)量平衡基團丟失羞芍，產(chǎn)生低質(zhì)荷比(m/z)的報告離子。
由于二級質(zhì)譜可分析相對分子質(zhì)量相差為1的報告基團蜀涨，不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標(biāo)記的多肽相對豐度。
多肽內(nèi)的酰胺鍵斷裂逊移，形成一系列b離子和y離子钳吟，得到離子片段的質(zhì)量數(shù)思喊，通過搜庫就可以鑒別出相應(yīng)蛋白質(zhì)吊宋。

蛋白定量分析工具

常用的軟件前面已經(jīng)提了，包括：IQuant(BGI), ProteinPilot(AB SCIEX)、Proteome Discoverer(Thermo scientific)
IQuant：整合了Mascot算法星澳，采用機器學(xué)習(xí)算法自動對搜索結(jié)果進行重新打分，提高結(jié)果的鑒定率。

核心的值有3個：

在譜圖/肽段水平進行1%FDR的過濾(PSM-level PDF<=0.01)耍鬓，獲得顯性性鑒定的譜圖和肽段列表证薇。
基于簡約原則(the parsimony principle)先慷，利用肽段進行蛋白組裝踊跟，并生產(chǎn)一系列的蛋白組御铃。
在蛋白質(zhì)水平以FDR 1%再次進行過濾(Protein-level FDR<=0.01)碴里，以控制蛋白的假陽性。

IQuant的工作流程為：

蛋白質(zhì)過濾 --> 報告基團標(biāo)簽純度校正 --> 定量值歸一化 --> 缺失值補全 --> 蛋白定量值計算 --> 統(tǒng)計檢驗上真。

[四]差異蛋白篩選

對蛋白進行定量后咬腋，需要對蛋白的差異進行篩選，篩選的內(nèi)容包括3個睡互，如下所示：

根據(jù)實驗設(shè)計來設(shè)置差異分析根竿，例如A_VS_B；
顯示差異蛋白選擇的閾值湃缎，F(xiàn)old Change > 1.2或1.5和Q-value < 0.05犀填；
統(tǒng)計學(xué)方法：t-test或ANOVA。

現(xiàn)在來看一個差異計算后的結(jié)果：

第1列是蛋白名稱嗓违；

第2列到第4列是3個生物學(xué)重復(fù)九巡；

第5列與第6列是FC與pvalue。

[五]富集分析

富集分析常見的就是GO分析與KEGG分析蹂季，不介紹冕广。

[六]表達(dá)聚類和蛋白互作

表達(dá)聚類分析的核心就是熱圖與聚類圖，不介紹偿洁。

蛋白相互作用通常使用的數(shù)據(jù)庫是STRING數(shù)據(jù)庫撒汉，它能分析預(yù)測差異蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系，這個數(shù)據(jù)庫的主要信息如下

STRING是一個搜索已知蛋白之間和預(yù)測蛋白之間相互作用系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫涕滋，包括蛋白質(zhì)直接物理的相互作用睬辐，也包括蛋白質(zhì)之間間接功能相關(guān)性；
數(shù)據(jù)包括：實驗數(shù)據(jù)宾肺、從PubMed摘要中挖掘結(jié)果溯饵，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測的結(jié)果；
通過打分對不同方法得來的結(jié)果給予一定權(quán)重锨用，得到綜合打分丰刊，且可根據(jù)打分結(jié)果繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，它的網(wǎng)絡(luò)圖如下所示：

案例解析

先來看一篇文獻(xiàn)增拥，文獻(xiàn)內(nèi)容如下所示：

Liancheng Wu, Shunxi Wang, Lei Tian, Liuji Wu, Mingna Li, Jun Zhang, Pei Li, Weiqiang Zhang, Yanhui Chen
Comparative proteomic analysis of the maize responses to early leaf senescence induced by preventing pollination,Journal of Proteomics,Volume 177,2018,Pages 75-87,ISSN 1874-3919.

研究背景

玉米是一種一年生作物啄巧，葉片衰老的過早或過晚都可能會影響產(chǎn)量寻歧，在成熟后期，營養(yǎng)物質(zhì)的再活化受到負(fù)面影響秩仆，導(dǎo)致幼葉的光合作用受損和系列能力下降码泛，相反，過早的葉片衰老則阻礙了植物生長并降低其CO2的同化能力逗概。葉片衰老是一個高度調(diào)控的過程弟晚，由幾個稱為衰老相關(guān)基因(SAGs)的基因介導(dǎo)，然后在蛋白質(zhì)水平上僅鑒定了少數(shù)SAG逾苫。目前，使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析全體蛋白質(zhì)波動比功能分析的轉(zhuǎn)錄組學(xué)更有效枚钓，因為蛋白質(zhì)與功能更直接相關(guān)铅搓。本研究的目的是，研究玉米阻斷授粉誘導(dǎo)葉片衰老過程中蛋白質(zhì)的全局差異積累和代謝物質(zhì)的變化搀捷。

葉片衰老的生理特征

葉片衰老通常與植物衰老以及開花和種子形成有關(guān)星掰。葉色也與葉片衰老有關(guān)，是植物重合周期階段的可見指標(biāo)嫩舟。葉片衰老時會出現(xiàn)一系列的生理過程，包括葉綠素分解、光合作用停止鄙皇、蛋白質(zhì)和核酸降解褐奥、分解代謝和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，以及細(xì)胞死亡反應(yīng)饭于，從而導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)到新發(fā)育的營養(yǎng)器官和生殖器官蜀踏。

分子機制研究進展

葉片衰老可以通過許多環(huán)境和內(nèi)源信號來調(diào)節(jié)，包括年齡掰吕、發(fā)育信號和植物生長調(diào)節(jié)劑果覆。植物激素與植物中的各種生物過程（包括葉片衰老）相關(guān)，如外源施用脫落酸(ABA)可促進葉片衰老殖熟，內(nèi)源ABA水平在幾種植物葉片衰老后增加局待。

水楊酸(SA)是另一種對葉片衰老正調(diào)控的植物激素，而生長素菱属、細(xì)胞分裂素和赤霉素對葉片衰老有負(fù)調(diào)控作用钳榨。

糖代謝是與葉片衰老相關(guān)的另一因素，如糖類直接應(yīng)用于擬南芥的葉細(xì)胞會導(dǎo)致早衰照皆。

表型分析－糖

實驗材料：授粉(POL)和不授粉(NPNPOL)的玉米自交系Yu816重绷。

發(fā)育時間：吐絲扣6天到21天(DAS)。

參數(shù)檢測：葉片的可溶性糖含量和淀粉含量膜毁。

分析結(jié)果：

可溶性糖昭卓，6-18 DAS兩種材料中均增加愤钾；21 DAS和POL中稍微下降，而NONPL的大量下降候醒。

淀粉：趨勢與可溶性糖類似能颁，數(shù)據(jù)如下所示：

表型分析-葉片形態(tài)和葉綠素分析

穗葉和上部的葉片；
兩組材料在6-14 DAS時一樣保持綠色倒淫。
NONPOL組伙菊，18 DAS時葉脈積累紅色色素，尖端變黃且干燥敌土；21 DAS時穗葉的三分之二變黃镜硕；27 DAS時葉片完全干燥。
POL組返干，僅在27 DAS時表現(xiàn)出輕微黃色兴枯。
葉綠素含量：
NONPOL組，穗葉尖端在6-27 DAS顯著下降（相對中部和基部）矩欠，而同時POL組只是稍微一些辭職财剖。
相同的趨勢也發(fā)生在穗葉的中部和基部。
在兩組中Chl含量隨著發(fā)育而下降癌淮，但是NONPOL組比POL組下降得更快躺坟，數(shù)據(jù)如下所示：

iTAAQ蛋白組實驗設(shè)計

樣本數(shù)目：7組樣本，8標(biāo)乳蓄，每個3個生物學(xué)重復(fù)

實驗材料：玉米自交系Yu816

實驗處理：授粉(POL)咪橙、不授粉(NONPOL)

取樣部位：葉片

取樣時間點：吐絲后6天(DAS)、14天栓袖、18天和21天

生物學(xué)重復(fù)：3個

方法與儀器：iTRAQ匣摘、LC-MS/MS(Thermo Fisher Scientific, Q-exactive)

流程如下所示：

蛋白質(zhì)組整體分析

文章的附件中列出了蛋白質(zhì)譜的一些數(shù)據(jù)，得到了959464個廣譜裹刮，其中150650匹配上肽段譜圖音榜，通過Mascot軟件匹配上已知多肽，且28605個匹配上唯一多肽捧弃。

鑒定了6941個蛋白赠叼，其中4371個唯一蛋白時至少有兩個以上肽段匹配的，數(shù)據(jù)如下所示：

篩選差異蛋白分析

文獻(xiàn)中使用了ANOVA來篩選差異蛋白(DAP)违霞，其中閾值為：FC大于1.2或小于0.83(0.83其實就是1.2的倒數(shù))嘴办，p值小于0.05。
POL組有700個顯著差異積累的蛋白买鸽，NONPOL組有1832個涧郊；
其中261中僅在POL中顯著積累，1393個只在NONPOL組中顯著積累眼五，而439個在兩組均顯著積累妆艘；
分析不同時間誘導(dǎo)的衰老：A1 VS B1彤灶， A2 vs B2， A3 VS B3批旺；1443個顯著差異積累幌陕，其中809個僅在NONPOL中顯著差異積累，然后進一步分析在14 DAS汽煮、18 DAS和21 DAS的做好心理情況下搏熄，以及上下調(diào)情況；
通過比較本研究和之前文獻(xiàn)報告的玉米自交系B73阻斷授粉誘導(dǎo)衰老的轉(zhuǎn)錄組研究暇赤，發(fā)現(xiàn)兩個數(shù)據(jù)集僅有154個重疊的基因心例，這說明在Yu816中有著相對不同的調(diào)控機制：

差異蛋白功能分析—GO和KEGG分析

對NONPOL組809個DAP進分別進行GO和KEGG分析，使用cytoscape鞋囊、Cluego和Cluepedia軟件繪制GO注釋和KEGG網(wǎng)絡(luò)圖契邀；
通過評分得到65條邊連接的36個Term，表明在鑒定的蛋白質(zhì)相互作用組中相當(dāng)多的富集(P<0.05)失暴；
顯著富集的Term：光合作用、光合作用光系統(tǒng)II微饥、生長素生物合成過程逗扒、JA代謝過程、器官衰老欠橘、絡(luò)氨酸代謝矩肩、脯氨酸生物合成過程；
從亞細(xì)胞定位角度來看肃续，顯著寶座的蛋白主要定位于葉綠體黍檩、光合體系、過氧化酶體和核糖體始锚，如下所示：

差異蛋白表達(dá)分析

表達(dá)分析的核心就是熱圖與聚類刽酱。

在誘導(dǎo)葉片衰老過程中，大多數(shù)核糖體蛋白質(zhì)豐度下降瞧捌，包括50S核糖體蛋白L5-1(B6SST7)棵里，其在14 DAS時稍微下降了0.98倍，在18 DAS時下降了0.8倍姐呐，但在21 DAS下降到了0.6殿怜。
NONPOL組蛋白酶豐度增加，如光胱氨酸蛋白酶1(B6TGM9)在14 DAS增加1.09倍曙砂，在18 DAS時增加1.43位头谜，21 DAS時增加到了2.89倍。
在差異積累的蛋白質(zhì)中鸠澈，29種與光合作用有關(guān)柱告，并且大部分光合作用相關(guān)蛋白豐度減少截驮，例如PSII反應(yīng)中心蛋白H(P24993)在14 DAS時減少了1.00倍，在18 DAS時為0.72倍末荐，在21 DAS時為0.46倍侧纯，如下所示：

糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)在NONPOL組中豐度增加，如淀粉合酶甲脏，和葉綠體/淀粉體蛋白（B6U167)在14 DAS時半圓了0.98倍眶熬，在18 DAS時增加了1.18倍，21 DAS的1.65倍块请；
參與ROS過程的蛋白質(zhì)娜氏，抗氧化蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)葉片衰老過程中豐度降低了，例如鐵氧還原蛋白(Q6JAD2)在14 DAs時減少了0.84位墩新，在18 DAS時減少了0.76倍贸弥，在21 DAS時減少了0.55倍；
但是氧化蛋白質(zhì)各類如脂氧合酶(Q8W0V2)在14 DAS時增加了0.87倍海渊，在18 DAS時增加了1.78倍绵疲，在21 DAS時增加了2.26倍；
ABA響應(yīng)蛋白(B6U8P6)在14 DAS時增加了0.88倍臣疑，在18 DAS時增加了1.32倍盔憨，在21 DAS時增加了1.5倍；但與生長素和赤霉素相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度降低讯沈，數(shù)據(jù)如下所示：

文章最后使用WB進行驗證郁岩，測序類文章中基本上都要有驗證，這一部分略去不表缺狠。

文章到此就結(jié)束了问慎，整個文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)分析思路如下所示：

簡化一下就是下圖：

參考資料

iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué).輝駿生物
iTRAQ(穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù))
iTRAQ? Reagents
[iTRAQ/TMT.MtoZ Biolabs Experit in Mass Spectrometry Analysis](iTRAQ/TMT.MtoZ Biolabs Experit in Mass Spectrometry Analysis)

定量蛋白組學(xué)分析流程