Basic Information

• 英文標題： Spatiotemporal single-cell analysis decodes cellular dynamics underlying different responses to immunotherapy in colorectal cancer
• 中文標題：空間時間單細胞分析解讀了結(jié)腸直腸癌不同對免疫療法反應(yīng)下的細胞動態(tài)
• 發(fā)表日期：NA
• 文章類型：Article
• 所屬期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Yuqing Chen | Zemin Zhang
• 文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610824002344

Highlights

Para_01

• 在PD-1阻斷下的人類結(jié)直腸癌的全面跨組織單細胞景觀

• 局部協(xié)調(diào)的細胞程序展現(xiàn)出與反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的動力學(xué)特性

• 較高的基線Ttr樣細胞浸潤與更好的治療反應(yīng)相關(guān)

• 增加與血液相關(guān)的Ttr樣細胞水平有利于提高治療效果

Summary

Para_01

1. 為了擴大免疫檢查點封鎖（ICB）在結(jié)直腸癌（CRC）中的療效衬潦，我們需要全面了解治療反應(yīng)性蜡励。
2. 在這里，我們分析了來自22名接受PD-1封鎖治療的患者的多個連續(xù)單細胞樣本锦担，以繪制CRC患者局部和全身免疫的演變俭识。
3. 在腫瘤中，我們發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)出不同治療關(guān)聯(lián)的協(xié)調(diào)細胞程序洞渔。
4. 具體來說套媚，耗竭型T細胞（Tex）或腫瘤反應(yīng)樣CD8+ T細胞（Ttr-like）與治療效果密切相關(guān)，而Tex細胞在PD-1封鎖后與其他多種腫瘤富集的細胞類型顯示出相關(guān)比例變化磁椒。
5. 此外堤瘤，我們揭示了腫瘤中血液相關(guān)的Ttr-like細胞較少耗竭的表型，并發(fā)現(xiàn)它們較高的豐度預(yù)示著更好的治療結(jié)果浆熔。
6. 最后本辐，基線時循環(huán)CD8+ T細胞中較高水平的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II相關(guān)特征與較好的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
7. 我們的研究為理解新輔助PD-1封鎖后CRC中時空細胞動力學(xué)提供了見解医增。

Graphical abstract

Keywords

• eoadjuvant immunotherapy; sequential multi-model single-cell sequencing; systemic immunity

Introduction

Para_01

1. 有效的免疫檢查點封鎖（ICB）為基礎(chǔ)的人類癌癥治療方法能激發(fā)以T細胞為中心的有效抗腫瘤反應(yīng)师郑，這些反應(yīng)伴隨局部腫瘤微環(huán)境（TME）的重塑及全身性免疫的變化。
2. 針對結(jié)直腸癌（CRC）累積的臨床試驗已經(jīng)證明了ICB顯著的成功调窍，特別是對于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）或錯配修復(fù)（MMR）缺陷的患者宝冕。
3. 然而，大多數(shù)CRC患者表現(xiàn)出微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）表型邓萨。
4. 同時地梨，盡管高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-high）是廣泛接受的預(yù)測ICB響應(yīng)性的生物標志物菊卷，但并非所有MSI-high的患者都能經(jīng)歷持久的響應(yīng)，而在一些MSS的結(jié)腸腫瘤中也觀察到了病理響應(yīng)宝剖。
5. 因此洁闰，對ICB治療下的細胞和分子動態(tài)進行全面理解將有助于開發(fā)新的策略，使更廣泛的CRC患者受益万细。

Para_02

1. 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)由多種細胞類型構(gòu)成扑眉，代表了一個異質(zhì)性但高度有序的群體。
2. 局部腫瘤微環(huán)境(TME)中的不同細胞類型可能在治療干預(yù)下同時受到調(diào)控赖钞，此類伴隨重塑事件在多種癌癥類型中已被揭示腰素，包括乳腺癌、腎細胞癌雪营、肝細胞癌以及錯配修復(fù)缺陷型結(jié)腸癌弓千。
3. 然而，大多數(shù)研究分別調(diào)查了離散的細胞群献起，然后探索潛在的細胞間相互作用洋访，缺乏對治療干預(yù)下TME細胞成分協(xié)調(diào)或共同進化行為的系統(tǒng)圖譜繪制。

Para_03

1. 主要地谴餐，ICB管理的作用在于恢復(fù)T細胞介導(dǎo)的腫瘤消除姻政。
2. 在腫瘤浸潤T細胞亞群中，腫瘤反應(yīng)性CD8+ T (Ttr) 細胞因其能夠特異性靶向癌細胞上的抗原而與癌癥免疫療法的有效性密切相關(guān)岂嗓。
3. 越來越多的證據(jù)表明扶歪，在腫瘤微環(huán)境中，Ttr細胞代表了一系列具有不同程度分化的表型摄闸，從前體耗竭 (Texp) 到終末分化的CD8+ T細胞。
4. 在治療前的腫瘤中妹萨，Ttr細胞通常表現(xiàn)出終末耗竭的表型年枕。
5. 而有效的ICB為基礎(chǔ)的治療能夠重新激活Ttr細胞的功能，并且與腫瘤組織中的Texp群體密切相關(guān)乎完。
6. 對Ttr群體進行深入研究熏兄，特別是關(guān)注基線和整個治療過程中它們的功能亞型，有可能揭示CRC患者對ICB響應(yīng)的細胞機制

Para_04

1. 此外树姨，ICB的功效可能受到周圍免疫系統(tǒng)的影響摩桶。
2. 我們和其他人已經(jīng)證明，在PD-1阻斷期間帽揪，來自周圍環(huán)境的招募T細胞對于加強局部腫瘤部位的Ttr池以及維持長期抗腫瘤免疫反應(yīng)具有關(guān)鍵作用硝清。
3. 然而，人類癌癥中转晰，在抗PD-1干預(yù)下芦拿，Ttr群體的表型如何變化士飒，伴隨它們被招募和滲透到腫瘤中的過程仍然不清楚。
4. 此外蔗崎，腫瘤與周圍環(huán)境之間的通訊演變尚未完全理解酵幕。
5. 尤為重要的是，這些動態(tài)如何參與對治療反應(yīng)不同的CRC患者中仍然是一個謎缓苛。
6. 我們預(yù)計芳撒，通過抗PD-1治療后從同一患者匹配的血液和腫瘤組織樣本，結(jié)合配對的轉(zhuǎn)錄組和T細胞受體(TCR)譜系信息未桥，可以解決這些挑戰(zhàn)笔刹，并激發(fā)協(xié)調(diào)全身免疫力的潛在策略。
7. 最后钢属，周圍環(huán)境與腫瘤之間的密切溝通表明徘熔，血液本身可以作為治療相關(guān)免疫反應(yīng)的可能指標

Para_05

1. 在這里，我們利用多模態(tài)單細胞RNA和TCR測序來解析接受新輔助PD-1阻斷治療的結(jié)直腸癌（CRC）患者體內(nèi)治療誘導(dǎo)的變化淆党。
2. 我們在整個治療過程中多個時間點收集了血液酷师、鄰近正常組織和腫瘤組織中的169份匹配樣本。
3. 在腫瘤中染乌，我們的長期監(jiān)測和連續(xù)取樣揭示了基線浸潤水平與響應(yīng)相關(guān)性以及不同細胞亞型的時間動態(tài)變化山孔，并定義了不同響應(yīng)狀態(tài)下的協(xié)調(diào)細胞程序。
4. 此外荷憋，我們還捕捉到了Ttr樣細胞群體沿周邊到腫瘤浸潤過程中的轉(zhuǎn)錄變化台颠，并且值得注意的是，在完全緩解者中觀察到血液相關(guān)的Ttr樣細胞豐度更高勒庄。
5. 另外串前，我們發(fā)現(xiàn)了一個基于循環(huán)CD8+ T細胞的標志物，能夠在基線狀態(tài)下區(qū)分完全緩解者和部分緩解者实蔽。
6. 綜上所述荡碾，我們的研究提供了在CRC中使用抗PD-1新輔助免疫療法期間局部和全身免疫系統(tǒng)的大規(guī)模時空特征描述，解碼了ICB響應(yīng)性的細胞和分子基礎(chǔ)局装，并指導(dǎo)了CRC免疫治療的潛在優(yōu)化策略坛吁。

Results

The dynamic single-cell cross-tissue landscape of human CRC following PD-1 blockade

PD-1阻斷后人CRC的動態(tài)單細胞跨組織景觀

Para_01

1. 我們追蹤了接受系統(tǒng)性抗PD-1免疫治療的患者及其后續(xù)必要手術(shù)的整個治療過程（圖1A和補充圖S1；星號方法部分）铐尚。
2. 共招募了20名結(jié)直腸癌(CRC)患者和兩名額外的十二指腸癌患者拨脉。
3. 除P02外的所有患者均接受了新輔助免疫治療，而對于不可切除轉(zhuǎn)移性CRC的P02來說宣增，僅可行二線免疫治療玫膀。
4. 治療后對所有患者的臨床反應(yīng)進行了綜合評估，這包括腫瘤大小的退縮程度和臨床反應(yīng)級別（圖1B和1C爹脾；補充表S1）匆骗。
5. 具體而言劳景，腫瘤退縮被量化為一個連續(xù)變量，代表治療過程中腫瘤大小的相對減少（星號方法部分）碉就。
6. 臨床上盟广，我們的隊列包括未響應(yīng)者（表現(xiàn)為"疾病穩(wěn)定"，SD瓮钥，N = 3）筋量，以及進一步分為"完全響應(yīng)"（CR，N = 12）或"部分響應(yīng)"（PR碉熄，N = 7）的響應(yīng)者（圖1B和1C）桨武。
7. P02被歸類為SD，但在隨訪期間去世锈津。
8. 到目前為止呀酸，所有其他患者都還活著，其中P01的生存時間超過4年琼梆。
9. 在響應(yīng)者中沒有報告復(fù)發(fā)病例性誉，表明他們具有持久的反應(yīng)。
10. 值得注意的是茎杂，兩名微衛(wèi)星穩(wěn)定性(MSS)患者達到了CR（P01和P09）错览，而六名微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)患者保持為PR（P15、P17煌往、P19和P24）或甚至對PD-1阻斷不敏感（P16和P25）倾哺。

• 圖1. 新輔助抗PD-1治療期間CRC患者的動態(tài)單細胞景觀 (A) 對接受新輔助抗PD-1治療的22名患者進行動態(tài)追蹤。
• (B) 入組患者的臨床特征刽脖。
• (C) 樣本的代表性磁共振成像(MRI)圖像羞海。紅色圓圈標記腫瘤區(qū)域。
• (D) 實驗設(shè)計概覽(頂部)和分析方法(底部)曲管。
• (E) 統(tǒng)一流形近似與投影(UMAP)圖顯示了精細的細胞簇却邓。每個細胞的主要組分身份顯示在左側(cè)的插圖中。
• (F) 盒形圖顯示了基線比例(左)和時間動態(tài)(右)的腫瘤組織中的T細胞數(shù)量翘地。每個點代表一名患者。采用雙側(cè)t檢驗(兩組間)和ANOVA(三組間)癌幕。所有主要免疫細胞類型的錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)進行了調(diào)整衙耕。更多信息見補充圖S1和S2；補充表S1勺远、S2和S3橙喘。

Para_01

1. 我們總共獲得了169個樣本，每位患者在基線時（治療前）采樣一次胶逢，在首次給藥后采樣一次或多次（圖S1）厅瞎。
2. 值得注意的是饰潜，有三位患者在四個時間點進行了采樣，八位患者在三個時間點進行了采樣和簸。
3. 這樣的采樣安排使我們既能進行基線關(guān)聯(lián)分析與療效的關(guān)系彭雾，又能追蹤治療干預(yù)下腫瘤微環(huán)境（TME）的縱向動態(tài)變化。
4. 為了全面繪制局部和系統(tǒng)的動態(tài)變化锁保，我們同時對周邊血液和伴隨腫瘤內(nèi)鏡/手術(shù)活檢的鄰近正常組織進行了采樣（圖1D）薯酝。
5. 新鮮采集的樣本接受了配對的單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞TCR測序（scTCR-seq）處理。

Para_02

1. 經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制后爽柒，獲得了975,275個高質(zhì)量單細胞的轉(zhuǎn)錄組（詳細方法見星號標記的方法部分）吴菠。
2. 無監(jiān)督聚類結(jié)合經(jīng)典標志物注釋揭示了六種主要細胞類型：T細胞、B細胞浩村、固有淋巴細胞（ILCs）做葵、髓系細胞、基質(zhì)細胞和上皮細胞（圖1E）心墅。
3. 隨后對每個主要細胞區(qū)室進行單獨的子聚類酿矢，產(chǎn)生了91個細粒度的細胞亞群，這些細胞亞群均以其獨特的表達譜以及在血液嗓化、鄰近正常組織和腫瘤組織中的分布模式為特征（補充表S2和S3棠涮；星號標記的方法部分；補充圖S2A和S2B）刺覆。
4. 對于每種主要和細粒度的細胞類型严肪，計算了基礎(chǔ)細胞豐度和細胞動態(tài)（定義為治療后與基礎(chǔ)水平之間的差異）（星號標記的方法部分）。
5. 在腫瘤中谦屑，我們觀察到了四種主要免疫細胞類型的響應(yīng)關(guān)聯(lián)性存在差異驳糯。
6. 在基礎(chǔ)狀態(tài)下，響應(yīng)組（完全緩解和部分緩解組）的腫瘤中T細胞浸潤水平高于非響應(yīng)者（疾病穩(wěn)定組）（圖1F）氢橙，表明基礎(chǔ)響應(yīng)者的T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強酝枢。
7. 值得注意的是，兩位經(jīng)歷顯著腫瘤退縮并達到完全緩解的微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSS）患者相比其他患者的T細胞比例相對較高悍手。
8. P01的特點是具有POLE突變帘睦，而P09沒有DNA修復(fù)缺陷，并且具有較低的腫瘤突變負擔（TMB）坦康，每兆堿基僅有4.75個突變（補充表S1）竣付。
9. 這些發(fā)現(xiàn)表明，T細胞浸潤水平可以補充微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）/微衛(wèi)星穩(wěn)定性狀態(tài)滞欠，用于預(yù)測治療效果古胆。
10. 在其他主要免疫細胞類型的基礎(chǔ)狀態(tài)下未發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性的響應(yīng)關(guān)聯(lián)（補充圖S2C）。
11. 接下來筛璧，我們研究了PD-1阻斷后腫瘤組織中主要免疫細胞類型的動態(tài)變化（圖1F和補充圖S2D）逸绎。
12. 具體而言惹恃，髓系細胞在疾病穩(wěn)定組腫瘤中的豐度出現(xiàn)了獨特升高。
13. 對于B細胞和T細胞棺牧，在完全緩解和部分緩解者之間觀察到了不同的豐度偏差巫糙。
14. PD-1阻斷后，完全緩解腫瘤中的T細胞比例下降陨帆，而部分緩解腫瘤中的T細胞比例增加曲秉，而B細胞則表現(xiàn)出相反的趨勢。
15. 綜合來看疲牵，這些觀察結(jié)果證明了響應(yīng)者和非響應(yīng)者之間承二，以及粗略描述的響應(yīng)患者內(nèi)部存在的固有細胞異質(zhì)性。

Coordinated cellular programs in the tumor ecosystem

腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的協(xié)調(diào)細胞程序

Para_01

1. 對于每種組織富集的精細細胞類型纲爸，我們使用了先前提出的基于線性回歸的預(yù)測指數(shù)（Pi）和治療指數(shù)（Ti）來定量評估基線細胞豐度和細胞動力學(xué)與響應(yīng)的相關(guān)性（STAR 方法亥鸠；表 S3；圖 S3A）识啦。
2. 正的 Pi 或 Ti 值表明較高的基線比例或更大的動態(tài)變化分別與有利的響應(yīng)相關(guān)聯(lián)负蚊。
3. 較大的絕對值意味著與腫瘤消退更強的相關(guān)性。
4. 令人驚訝的是颓哮，我們在抗 PD-1 治療后觀察到了多種細胞類型的協(xié)同動力學(xué)變化（圖 2A家妆；表 S3 和 S4）。
5. 對于幾種腫瘤富集的細胞類型冕茅，包括耗竭性 CD8 T 細胞（Tex伤极，c23_CD8_Tex_LAYN），4-1BB+ 調(diào)節(jié)性 T 細胞（c13_CD4_Treg_TNFRSF9）和 c70 內(nèi)皮 COL4A1 細胞姨伤，其豐度下降與有效治療相關(guān)哨坪，這由它們的負 Ti 值揭示。
6. 而那些正常組織富集的細胞類型乍楚，包括 c05_CD4 中心記憶 T 細胞（GPR183）和 IgA 漿細胞（c46_PlasmaB_IGHA1）当编，則顯示出了相反的趨勢（圖 2A 和 S3B）。
7. 這些觀察結(jié)果啟發(fā)我們系統(tǒng)地檢查可能在 PD-1 阻斷后協(xié)同作用的潛在細胞模塊徒溪。

• 圖2. 展示了與響應(yīng)性具有不同關(guān)聯(lián)的協(xié)調(diào)性腫瘤微環(huán)境細胞程序忿偷。（A）散點圖顯示了每種細胞類型的時間和組織富集情況。每個點代表一種細胞類型臊泌，顏色如圖1E所示鲤桥。F檢驗。時間指數(shù)（Ti）是通過擬合治療后腫瘤退縮率與細胞動力學(xué)之間的線性模型計算得出的缺虐，其中r2量化了這種關(guān)聯(lián)芜壁。（B）腫瘤微環(huán)境中的非負矩陣分解（NMF）基細胞程序礁凡。x軸代表腫瘤微環(huán)境中的細胞類型高氮，y軸表示每種細胞類型在每個程序中的載荷量慧妄。（C）箱形圖顯示了三種選定細胞程序在腫瘤中的活動動力學(xué)。中間線表示中位數(shù)剪芍，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25百分位和第75百分位塞淹，須狀線表示四分位距的1.5倍。每個點代表一個患者罪裹。雙側(cè)t檢驗（兩組間）和方差分析（三組間）饱普。所有NMF程序中的相同成對比較進行了FDR調(diào)整。（D）雷達圖顯示了每個響應(yīng)性患者在不同治療階段選定程序的活動情況状共。從圓心到點的距離代表了按比例縮放的程序活動（范圍從0到1）套耕。（E）代表性多重免疫熒光染色顯示次級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）。在主視圖和放大視圖中峡继，標尺分別對應(yīng)500 μm和100 μm冯袍。（F）折線圖顯示了腫瘤樣本中次級淋巴結(jié)構(gòu)的面積（左）和數(shù)量（右）。每個點代表一個腫瘤樣本碾牌。線條表示配對樣本康愤。雙側(cè)t檢驗。另見圖S3舶吗；表S1征冷、S3和S4

Para_01

1. 我們采用基于非負矩陣分解（NMF）的方法來捕捉腫瘤微環(huán)境中精細細胞亞群的協(xié)同細胞程序，并考察這些程序是否與治療效果相關(guān)（具體方法見STAR Methods）誓琼。
2. 對于腫瘤樣本检激，我們識別出了五個細胞程序（NMF1-5）（圖2B和補充圖S3C；具體方法見STAR Methods）踊赠。
3. NMF2包括類似濾泡輔助T細胞（c08_CD4_Tfh_IL6ST）呵扛、生發(fā)中心B細胞（c44_GCB_MKI67）、初始T細胞（c16_CD8_Tn_SELL）和初始B細胞（c40_NaiveB_IGHD）筐带，類似于三級淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的傳統(tǒng)組成部分今穿，因此被命名為"TLS樣程序"。
4. NMF5富含多種正常組織豐富的細胞類型伦籍，包括c21_CD8_Trm_XCL1蓝晒、c18_CD8_Tcm_ANXA1、各種成纖維細胞和內(nèi)皮細胞亞型以及IgA漿細胞（補充表S3）帖鸦，因此被稱為"組織重建程序"芝薇，可能代表了恢復(fù)過程中重新建立的類似正常組織的微環(huán)境。
5. 最后作儿，鑒于多種腫瘤富集細胞類型的聚集洛二，如Tex（c23）、4-1BB+調(diào)節(jié)性T細胞（c13）、Th17（c07_CD4_Th17_CTSH）晾嘶、LAMP3+樹突狀細胞（c60_cDC_LAMP3）和IgG+漿B細胞（c47_PlasmaB_IGHG1）（補充表S3）妓雾，NMF4被標記為"腫瘤富集程序"。
6. 為了驗證鑒定出的程序的穩(wěn)定性和一致性垒迂，我們評估了每個細胞程序中單個腫瘤微環(huán)境細胞類型的頻率變化械姻，發(fā)現(xiàn)不同細胞類型在整個治療過程中大致表現(xiàn)出與程序一致的比例變化趨勢（補充圖S3D）。
7. 此外机断，我們還進行了基于CellChat的細胞間相互作用分析健盒，以探究每個程序背后的分子事件（具體方法見STAR Methods）椭住。
8. 組織重建程序中富含細胞外基質(zhì)受體介導(dǎo)的相互作用，而TLS樣程序和腫瘤富集程序則觀察到相對較強的直接細胞接觸（補充圖S3E）。
9. 需要進一步的研究來解碼復(fù)雜的協(xié)調(diào)信號呜魄，包括程序內(nèi)的交叉對話和外部因素赏陵，這些信號可能共同塑造每個細胞程序的組成窥浪。

Para_02

1. 我們隨后檢查了這些細胞程序是否與治療效果有關(guān)聯(lián)镊逝。
2. 每個樣本都被分配了一個對應(yīng)于每個細胞程序的活動評分。
3. 類似于細胞類型動態(tài)旺拉，可以通過計算基線和治療后腫瘤樣本之間的活動評分差異來評估每個程序的活動動態(tài)产上。
4. 值得注意的是，在不同響應(yīng)狀態(tài)的患者中蛾狗，這些程序呈現(xiàn)出多樣化的模式（圖2C晋涣、2D、S3F和S3G）沉桌。
5. 對于TLS樣程序谢鹊，響應(yīng)者在治療后顯示出活動性偏好的增加。
6. 我們通過多重免疫熒光染色在17名患者中證實了TLS樣程序的響應(yīng)者特異性增加（表S1）留凭，發(fā)現(xiàn)完全緩解(CR)和部分緩解(PR)患者在治療后TLS區(qū)域和計數(shù)增加（圖2E和2F）佃扼。
7. 然而，CR和PR腫瘤在組織重建程序和腫瘤富集程序方面表現(xiàn)出不同的動態(tài)蔼夜。
8. 治療后兼耀，CR腫瘤中觀察到組織重建程序的信號更強，而腫瘤富集程序的信號較弱求冷，這與有效根除惡性細胞以及在CR患者中重建類似正常組織的環(huán)境相協(xié)調(diào)瘤运。
9. 相比之下，PD-1阻斷對PR腫瘤在這兩個程序上產(chǎn)生了相反的影響匠题。
10. 對每位患者的這三個程序進行時間追蹤提示了相似的發(fā)現(xiàn)（圖2D和S3G）拯坟。
11. 有趣的是，在部分響應(yīng)者中韭山，與MSI患者相比郁季，MSS患者在基線時觀察到組織重建程序的活性較高冷溃，而腫瘤富集程序的活性較低（圖S3H），表明前者的腫瘤微環(huán)境中免疫反應(yīng)更為受限梦裂。
12. 綜合來看秃诵，這些分析支持了這樣的觀點：抗PD-1治療在我隊列中誘導(dǎo)了多個細胞類型在TME中的豐度變化趨勢相似，正如我們的細胞程序所捕捉到的一樣塞琼。
13. 在不同的響應(yīng)組中觀察到它們的動態(tài)差異可能反映了與治療相關(guān)的抗腫瘤過程的不同維度。

Response associations of exhausted CD8+ T cells in tumors

腫瘤中耗竭的CD8+ T細胞的響應(yīng)關(guān)聯(lián)

Para_01

1. 在治療過程中觀察到CR組和PR組之間存在不同的動態(tài)模式禁舷，這促使我們進一步研究與抗腫瘤過程差異相關(guān)的關(guān)鍵細胞類型彪杉。
2. 我們主要關(guān)注腫瘤富集程序（NMF4）。
3. 在所有TME細胞類型中牵咙，Tex（c23）派近、內(nèi)皮（c71、c70）和Th17（c07）細胞在這個程序中表現(xiàn)出最高的載荷洁桌，表明這些細胞類型對定義NMF4有顯著貢獻渴丸。
4. 此外，對于腫瘤富集程序中的每種細胞類型另凌，我們根據(jù)它們在治療過程中的頻率變化訓(xùn)練了分類器來區(qū)分CR和PR患者谱轨。
5. 值得注意的是，Tex細胞顯示出最高的曲線下面積（AUC）值吠谢，其次是pDC（c55）和周細胞（c81）土童。
6. 這一發(fā)現(xiàn)與Tex細胞動力學(xué)與治療效果之間的強烈關(guān)聯(lián)一致。
7. 結(jié)合Tex細胞明顯表達PDCD1和其他與耗竭相關(guān)的基因的事實工坊，包括LAYN献汗、ENTPD1和HAVCR2，我們將研究重點縮小到了這一群體王污。

• 圖3. 疲勞T細胞與治療效果的相關(guān)性 (A) UMAP圖顯示組織富集的CD8+ T細胞亞型罢吃，排除了血液富集的亞型（血液中的Ro/e > 1）。 (B) UMAP圖顯示跨治療階段和反應(yīng)組別的組織CD8+ T細胞密度昭齐。 (C和D) 散點圖顯示腫瘤退縮比率與基線相關(guān)性尿招，展示了腫瘤組織中Tex頻率 (C) 和基線克隆擴增水平 (D)。每個點代表一位患者阱驾。F檢驗泊业。 (E和F) PD-1阻斷后，由細胞豐度 (E) 和克隆擴增水平 (F) 表征的腫瘤內(nèi)c23_CD8_Tex_LAYN的動力學(xué)變化啊易。每個點代表一位患者吁伺。雙側(cè)t檢驗。 (G和H) 在NSCLC患者中租谈，由細胞豐度 (G) 和克隆擴增水平 (H) 表征的終末期Tex的動力學(xué)變化篮奄。'高'和'低'分類源自原始NSCLC研究捆愁。中心線表示中位值，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25和第75百分位數(shù)窟却，須部分表示1.5倍四分位距昼丑。每個點代表一位患者。雙側(cè)t檢驗夸赫。參見補充圖S4菩帝。

Para_01

1. 進一步評估了腫瘤浸潤Tex細胞與臨床的相關(guān)性，不僅考慮了它們在所有CD8+ T細胞中的比例茬腿，還考慮了克隆擴增程度呼奢，后者由我們先前開發(fā)的STARTRAC指標進行量化。
2. 基線時切平，完全緩解(CR)腫瘤中浸潤的Tex細胞在CD8+ T細胞中的比例高于反應(yīng)較差的腫瘤（圖3B和輔助圖S4B）握础，這與基線時CR患者的CD8+ T細胞中T細胞耗竭相關(guān)基因表達較高一致（輔助圖S4C至S4I）。
3. 此外悴品，基線時的Tex細胞流行率和克隆擴增程度均與腫瘤退縮有關(guān)聯(lián)（圖3C和3D）禀综。
4. 值得注意的是，4名微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)部分緩解(PR)患者的Tex細胞豐度與其他PR患者非常吻合苔严。
5. P09是一名微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)的完全緩解患者定枷，他在所有完全緩解患者中顯示出最強的Tex細胞擴增（圖3D）。
6. 這些觀察進一步表明届氢，細胞組成和狀態(tài)作為補充微衛(wèi)星不穩(wěn)定/微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)的可靠臨床反應(yīng)指標的潛力依鸥。

Para_02

1. 接下來，我們旨在探究藥物治療后 Tex 細胞的時間動態(tài)變化悼沈。
2. 雖然在術(shù)后 SD 腫瘤中檢測到的 Tex 細胞豐度與基線相比僅有輕微偏差（圖 3E）贱迟，但我們觀察到了 CR 和 PR 組之間存在不同的模式（圖 3E 和 3F）。
3. 在 CR 腫瘤中絮供，Tex 細胞通常顯示出治療后的豐度下降以及克隆擴增水平降低衣吠。
4. 然而，患者間存在著異質(zhì)性的動態(tài)變化壤靶。
5. 例如缚俏，在 P20 的治療過程中，Tex 細胞豐度經(jīng)歷了一個顯著的升高隨后大幅下降贮乳，最終的水平仍高于基線水平（圖 3E）忧换。
6. 值得注意的是，在其他幾位 CR 患者的治療過程中也觀察到了類似的變化趨勢向拆，盡管幅度各不相同亚茬，這可能反映出強烈的 Tex 基礎(chǔ)抗腫瘤免疫反應(yīng)在初次給藥后迅速被激發(fā)，然后隨著有效清除腫瘤而減弱浓恳。
7. 對于大多數(shù) PR 腫瘤刹缝，我們識別出 Tex 細胞頻率顯著增加碗暗，并伴隨著強烈的克隆擴增程度（圖 3E 和 3F），表明成功的治療誘導(dǎo)免疫刺激梢夯。
8. 一致地言疗，利用我們先前的非小細胞肺癌（NSCLC）數(shù)據(jù)集，盡管沒有可用的 CR 或 PR 信息颂砸，但響應(yīng)性腫瘤如果在基線時 Tex 比例較高噪奄，則在 PD-1 阻斷后表現(xiàn)出此類比例的下降；而那些基線時比例較低的腫瘤則經(jīng)歷了顯著的增加（圖 3G）人乓。
9. 進一步重新分析 NSCLC 隊列中的 TCR 信息勤篮，發(fā)現(xiàn)了類似的克隆擴增趨勢（圖 3H）。
10. 簡而言之撒蟀，我們的動態(tài)景觀展示了不同響應(yīng)性腫瘤群體中 Tex 細胞進化的分級路徑。

Different dynamics of tumor reactive-like CD8+ T cells during PD-1 blockade reflected the treatment efficacy

PD-1阻斷期間腫瘤反應(yīng)性CD8+ T細胞的不同動態(tài)反映了治療效果

Para_01

1. 除了上述組成和表型分析之外温鸽，我們的轉(zhuǎn)錄組和TCR序列的平行分析使我們能夠在抗PD-1治療后在同一譜系內(nèi)明確追蹤表型保屯。
2. 之前，我們提出了一種生物信息學(xué)策略涤垫，根據(jù)Tex（c23）細胞的耗竭表型和CXCL13的表達來追蹤潛在的Ttr細胞克隆姑尺。
3. 這一程序在我們的隊列中檢索到了395個克隆，總共覆蓋了來自腫瘤蝠猬、血液和鄰近正常組織中的8,116個類似Ttr細胞（圖S5A和S5B切蟋；STAR方法部分）。
4. 然后我們將研究中的腫瘤來源的類似Ttr細胞與已確立的真實腫瘤反應(yīng)性細胞進行了比較榆芦。
5. 通過使用Celltypist51并參照Caushi等人提供的數(shù)據(jù)集柄粹，我們發(fā)現(xiàn)研究中的大多數(shù)類似Ttr細胞被注釋為"MANA特異性"（新抗原特異性）（圖S5C和S5D；STAR方法部分）匆绣，這表明它們與那些真實腫瘤反應(yīng)性細胞具有相似的表型驻右。
6. 值得注意的是，在不同的患者中觀察到不同數(shù)量的類似Ttr細胞崎淳，并且它們在腫瘤中的頻率與治療反應(yīng)顯示出類似的相關(guān)性（圖S5E至S5H）堪夭，與Tex（c23）細胞的情況相同（圖3E）。
7. 為進一步驗證拣凹，我們在一個擴大的16名患者的隊列中對治療前/后的腫瘤活檢樣本進行了多重免疫熒光染色森爽。
8. 蛋白質(zhì)水平的證據(jù)證實了基線CR腫瘤和治療后PR腫瘤中含有大量的CD8+ CXCL13+細胞（圖4A至4C）。
9. SD腫瘤顯示持續(xù)的類似Ttr細胞缺乏（圖4A和S5E至S5H）嚣镜。

• 圖4. 在PD-1阻斷下的腫瘤反應(yīng)樣CD8+ T細胞 (A) 腫瘤活檢樣本中CD3+ CD8+ CXCL13+細胞的代表性多重免疫熒光染色爬迟。箭頭表示CD3+ CD8+ CXCL13+細胞。虛線框指示放大的視圖菊匿。主視圖和放大的視圖中的標尺分別對應(yīng)200 μm和20 μm雕旨。 (B) 盒形圖顯示CXCL13+ CD3+ CD8+細胞占CD3+細胞的比例扮匠。中心線表示中位值，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25百分位和第75百分位凡涩，須狀線表示1.5倍的四分位距棒搜。每個點代表一個腫瘤樣本。雙側(cè)t檢驗活箕。 (C) 折線圖顯示(B)中七個患者在接受治療匹配樣本時CXCL13+ CD3+ CD8+細胞比例的變化力麸。每個點代表一個腫瘤樣本。 (D) UMAP圖顯示所有組織類型中的Ttr樣亞型（左側(cè)）以及代表性基因的表達（右側(cè)）育韩。 (E) UMAP圖顯示不同治療階段Ttr樣亞型的分布克蚂。 (F) 盒形圖顯示Texp和Text細胞占全部Ttr樣細胞（頂部）及腫瘤內(nèi)T細胞（底部）的比例。中心線表示中位值筋讨，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25百分位和第75百分位埃叭，須狀線表示1.5倍的四分位距。每個點代表一個患者悉罕。雙側(cè)t檢驗（對于所有Ttr樣細胞亞群在腫瘤中的相同配對比較進行了FDR調(diào)整）及ANOVA檢驗（對于三個組別中的所有Ttr樣細胞亞群在腫瘤中進行了FDR調(diào)整）赤屋。 (G) 餅狀圖顯示代表性克隆（考慮所有組織類型）在不同治療階段的Ttr樣亞型組成壁袄。參見補充圖S5和S6类早；補充表S1。

Para_01

1. 在克隆水平上嗜逻，我們追蹤了個體Ttr樣克隆在腫瘤組織治療過程中的進化模式涩僻，并將腫瘤內(nèi)的Ttr樣克隆分為四類：(1) 新出現(xiàn)的克隆，在基線時未被檢測到栈顷，但在后續(xù)采樣時間點出現(xiàn)逆日；已存在的克隆，包括 (2) 在治療過程中相對于基線克隆大小增加的克绿逊铩屏富；(3) 相對于(2)，克隆大小減少的縮小克峦苈薄狠半；以及 (4) 只能在基線時檢測到的消失克隆。
2. 所有類別在完全緩解(CR)和部分緩解(PR)組中均有大量識別（圖S5I）颤难，這表明治療不僅影響已存在的克隆神年，還招募了新成員。
3. 然而行嗤，這些類別的分布模式在CR和PR腫瘤之間存在差異已日，CR腫瘤中大部分由消失克隆(4)占據(jù)，而PR腫瘤則以新出現(xiàn)克隆(1)的廣泛擴展為特征（圖S5I）栅屏。
4. 這些分析進一步支持了響應(yīng)性腫瘤在治療誘導(dǎo)的Ttr樣動態(tài)變化中存在顯著差異的觀點飘千。

Para_02

1. 為了破譯PD-1阻斷在不同響應(yīng)群體中的相關(guān)效應(yīng)堂鲜，我們接下來檢查了所有組織類型中Ttr樣群體的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。
2. 對Ttr樣池進行無監(jiān)督聚類識別出了六個具有獨特功能狀態(tài)的子群集（圖4D和S6A）护奈。
3. 與其他子群集區(qū)分的是缔莲，Ttr06代表血液富集的循環(huán)群體（圖S6B）。
4. Ttr04是一個增殖群體霉旗，而Ttr05高度表達了干擾素刺激基因（圖S6B）痴奏。
5. 在其他子集中，Ttr01細胞被標記為Texp厌秒，因為它們的耗竭程度最小且已建立的Texp特征活性最高（圖S6B和S6C读拆；STAR方法）。
6. Ttr02和Ttr03的特點是比其他子集表達更高的LAYN（圖S6B）鸵闪。
7. 值得注意的是檐晕，Ttr02特異性地高表達終末耗竭標志物（ENTPD1、TIGIT和LAG3）（圖S6B）蚌讼，因此將其定義為終末Tex（Text）細胞辟灰。
8. 此外，我們還單獨分析了來自個體患者的T細胞克隆啦逆，以證實這些Ttr樣亞群共存的事實伞矩。
9. 來自PR和CR患者的十大最大Ttr樣克隆包含了各種類型的Ttr樣子集笛洛。
10. 值得注意的是夏志，我們在兩個群體之間以及腫瘤治療過程中的Ttr樣子集分布并不均勻（圖S6D），表明PD-1阻斷以響應(yīng)相關(guān)的方式誘導(dǎo)了Ttr樣群體表型的轉(zhuǎn)變苛让。

Para_03

1. 因此沟蔑，我們研究了Ttr樣亞群的動力學(xué)變化，以區(qū)分CR組和PR組之間的潛在差異（圖4E狱杰、4F瘦材、S6E和S6F）。
2. 治療后仿畸，在PR腫瘤中觀察到Texp和Text細胞顯著積累食棕。
3. 相比之下，基線CR組中大量的Text和增殖的Tex細胞在治療后主要被Texp細胞取代（圖4E错沽、4F簿晓、S6E和S6F）。
4. 通過追蹤治療過程中單個克隆內(nèi)Ttr樣亞群的分布千埃，進一步證實了CR組與PR組之間Ttr樣細胞的不同轉(zhuǎn)變（圖4G和S6G）憔儿。
5. 此外，我們在NSCLC隊列中重新評估了Ttr樣群體放可，觀察到了GZMK+ NR4A2+ Texp比例治療誘導(dǎo)動力學(xué)的類似變化（圖S6H）以及單個克隆內(nèi)Ttr樣亞群分布的相似情況（圖S6I）谒臼。
6. 綜合分析表明朝刊，在有效的治療干預(yù)下，腫瘤中的Ttr樣細胞經(jīng)歷了群體加強蜈缤。
7. 在最有利的情況下拾氓，當絕大多數(shù)腫瘤被清除時，Texp細胞不再經(jīng)歷終末耗竭劫樟，導(dǎo)致Text細胞逐漸減少痪枫，這可能是由于耗竭相關(guān)的免疫抑制信號急劇下降；然而叠艳，在部分響應(yīng)的情況下奶陈，PD-1阻斷促進了Texp和Text群體的積累，同時未能完全阻止向終末耗竭的過程附较。

Peripheral association of tumor-reactive-like CD8+ T cells under effective therapy intervention

在有效治療干預(yù)下腫瘤反應(yīng)性樣CD8+ T細胞的周圍關(guān)聯(lián)

Para_01

1. 有效的癌癥免疫療法需要協(xié)調(diào)一致的全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)吃粒。
2. 我們通過在多個治療階段、不同解剖部位進行匹配的單細胞RNA測序(scRNA-seq)和單細胞T細胞受體測序(scTCR-seq)拒课，得以建立組織富集T細胞局部變化與其相應(yīng)的全身性免疫之間深入的聯(lián)系徐勃。
3. 我們首先追蹤了在血液中可檢測到的克隆的T細胞受體(TCR)，并將來自這些克隆的腫瘤或正常組織衍生細胞定義為"與血液相關(guān)的Ttr樣"細胞（圖5A早像；STAR方法）僻肖。
4. 檢查與血液相關(guān)的Ttr樣克隆在組織中的分布揭示了它們在腫瘤或正常組織中的克隆大小與血液中的克隆大小之間的相關(guān)性（補充圖S7A）。
5. 接下來卢鹦，我們檢查了治療后與血液相關(guān)的Ttr樣克隆在血液中首次可檢測的時間臀脏。
6. 令人驚訝的是，這些克隆的起源貫穿了整個治療過程冀自，包括基線水平（圖5B）揉稚，盡管scTCR-seq捕獲TCR的敏感性有限。
7. 這些觀察進一步支持了PD-1阻斷可能有助于從周圍環(huán)境中招募既有的和新出現(xiàn)的Ttr樣克隆進入腫瘤微環(huán)境的觀點熬粗。

• 圖5. 在PD-1阻斷下的腫瘤反應(yīng)樣CD8+ T細胞的周圍關(guān)聯(lián) (A) UMAP圖顯示Ttr樣細胞的解剖部位（左）和血液關(guān)聯(lián)（右）搀玖。
• (B) 直方圖顯示治療后血液相關(guān)Ttr樣克隆最早可檢測到的階段。僅顯示了具有可檢測治療后血液相關(guān)Ttr樣細胞的完全緩解和部分緩解患者驻呐。
• (C) 熱圖顯示代表性標志基因在Ttr樣亞群和循環(huán)非Ttr樣細胞中的表達情況灌诅。
• (D) UMAP圖顯示PD-1阻斷后Ttr樣亞群的動力學(xué)變化。
• (E) 箱線圖顯示不同治療階段腫瘤中血液相關(guān)Ttr樣細胞的比例含末。中心線表示中位值猜拾，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25和第75百分位數(shù)，而須狀線表示1.5倍的四分位距答渔。單側(cè)t檢驗关带。另見補充圖S7。

Para_01

1. 我們的跨組織單細胞測量使我們能夠追蹤細胞在浸潤腫瘤過程中的表型變化。
2. 我們將來源于腫瘤的Ttr樣細胞（包括與血液相關(guān)和不相關(guān)的Ttr樣細胞）與循環(huán)中的Ttr樣細胞進行了比較宋雏，同時還將其他循環(huán)CD8+ T細胞作為額外對照芜飘。
3. 這種比較可能作為分析Ttr樣群體在癌癥免疫周期中縱向分化的替代方法，在人類臨床樣本中磨总。
4. 循環(huán)中的Ttr樣細胞表現(xiàn)出PDCD1的中間表達水平嗦明，隨后是腫瘤中與血液相關(guān)的Ttr樣細胞的更高表達水平，而與血液不相關(guān)的Ttr樣細胞則表現(xiàn)出PDCD1的最高表達水平（圖5C）蚪燕。
5. 同樣地娶牌，從循環(huán)中的Ttr樣細胞到與血液相關(guān)的Ttr樣細胞，再到與血液不相關(guān)的Ttr樣細胞馆纳，耗竭標志基因的表達也逐漸增加（圖5C）诗良。
6. 我們還使用MC38-OVA小鼠模型驗證了循環(huán)和來源于腫瘤的Ttr樣細胞之間的表型差異，在該模型中鲁驶，觀察到來源于腫瘤的CD8+ T細胞中PD-1+細胞的比例更高鉴裹，而在這些PD-1+ CD8+ T細胞中，較未耗竭的人群（TCF1+）在外周血中的比例更高（補充圖S7B和S7C）钥弯。
7. 相比之下径荔，與血液不相關(guān)的Ttr樣細胞相比，與血液相關(guān)的Ttr樣細胞中GZMK和CCL4的表達更高（圖5C）脆霎。
8. 一致地总处，差異表達分析推斷出與血液相關(guān)的Ttr樣細胞表現(xiàn)出耗竭相關(guān)基因（如ENTPD1和LAYN）的較低表達水平，但GZMK睛蛛、GZMH鹦马、CCL4和CCL4L2的表達水平較高（補充圖S7D）。
9. 先前已有報道表明玖院，GZMH+ CD8+ T細胞人群處于向終末功能障礙過渡的狀態(tài)菠红。
10. 此外第岖，CCL4已與多種免疫細胞類型的招募有關(guān)聯(lián)难菌，且CD8+ T細胞在抗原暴露后會上調(diào)CCL4的表達。
11. 同時蔑滓，與循環(huán)中的細胞相比郊酒，在來源于腫瘤的Ttr樣細胞中觀察到了IFNG和多個主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II相關(guān)基因的顯著高表達，其中與血液相關(guān)的Ttr樣細胞顯示出最高的表達水平（圖5C）键袱。
12. 因此燎窘，與血液相關(guān)的Ttr樣細胞傾向于具有抗原經(jīng)驗但較少耗竭的表型。
13. 值得注意的是蹄咖，在治療后褐健，與血液相關(guān)的Ttr樣細胞維持了GZMK和CCL4的高表達（補充圖S7E），并且這一人群的前體標志物表達更高，耗竭程度更低蚜迅，超過了基線水平（補充圖S7F）舵匾。
14. 綜合來看，盡管存在患者間的異質(zhì)性谁不，這些觀察提供了證據(jù)表明與血液相關(guān)的Ttr樣細胞可能是被激活的坐梯、類似前體的細胞，代表了介導(dǎo)有效抗腫瘤免疫反應(yīng)的腫瘤Ttr樣細胞的有效增援刹帕。

Para_02

1. 我們隨后通過計算不同患者腫瘤樣本中血源性Ttr樣細胞在所有Ttr樣細胞中的比例吵血，考察了這些細胞的響應(yīng)關(guān)聯(lián)。
2. 總體而言偷溺，完全緩解(CR)腫瘤的血源性Ttr樣細胞比部分緩解(PR)腫瘤更豐富蹋辅，貫穿整個治療過程（圖5D和S7G），特別是在基線時（p = 0.046，圖5E）蔽豺。
3. 值得注意的是盖文，在某些CR病例中，這些血源性前體細胞在治療后仍然存在淋肾，此時大部分惡性細胞已被清除，這表明PD-1阻斷誘導(dǎo)的Ttr樣細胞介導(dǎo)的免疫保護具有持久性爸邢。
4. 相比之下樊卓，大多數(shù)PR患者的血源性關(guān)聯(lián)較弱，提示在部分緩解者中系統(tǒng)性的參與有限杠河。
5. 為進一步揭示調(diào)控這些不同強化模式背后的分子和細胞機制碌尔，進行深入研究至關(guān)重要。

Peripheral T cell characteristics were indicative of response to PD-1 blockade

外周T細胞特征表明對PD-1阻斷有反應(yīng)

Para_01

1. 最后券敌，我們將分析擴展到探索循環(huán)免疫細胞與新輔助抗-PD-1治療反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)唾戚。
2. 大多數(shù)血液富集細胞亞群的細胞比例，無論是在基線時還是治療后待诅，僅在不同的反應(yīng)組間顯示出微妙的變化叹坦，并且與腫瘤大小的退縮僅有微弱的相關(guān)性（補充表 S3）。
3. 盡管如此卑雁，我們?nèi)匀粰z測到了某些細胞與臨床反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)募书。
4. 例如，在基線時髓系細胞隔室中較高的c50_Mono_FCGR3A細胞比例與有利的腫瘤退縮相關(guān)聯(lián)（補充圖 S7H）测蹲。
5. 有趣的是莹捡，先前的研究也已經(jīng)證明了單核細胞與治療效果之間的關(guān)聯(lián)。

Para_02

1. 隨后我們將注意力轉(zhuǎn)向CD8+ T細胞扣甲，以探索外周響應(yīng)相關(guān)的信號篮赢。
2. 分析克隆狀態(tài)揭示了響應(yīng)者（完全緩解和部分緩解患者）與非響應(yīng)者（疾病穩(wěn)定患者）之間循環(huán)CD8+ T細胞克隆多樣性的顯著差異，其中非響應(yīng)者表現(xiàn)出明顯較低的多樣性（圖6A），這與他們較少的初始T細胞數(shù)量一致（補充圖S7I和S7J）启泣。
3. 此外媒咳，在將分析限制于治療誘導(dǎo)擴增的CD8+ T細胞克隆時觀察到了克隆計數(shù)與腫瘤退縮之間的正相關(guān)性，包括(1)新出現(xiàn)的克隆和(2)在治療期間血液中克隆大小增加的克轮衷丁（圖6B）涩澡。
4. 考慮到血液相關(guān)Ttr樣細胞在腫瘤微環(huán)境中的響應(yīng)關(guān)聯(lián)，我們接下來檢查了外周的Ttr樣細胞（圖6C）坠敷。
5. 與其它循環(huán)CD8+ T細胞相比妙同，在循環(huán)的Ttr樣群體中觀察到更大的克隆大小（圖6D）膝迎。
6. 然后我們研究了循環(huán)Ttr樣細胞的具體表型粥帚。
7. 血液中Ttr樣與非Ttr樣CD8+ T細胞之間的差異表達分析表明，循環(huán)Ttr樣群體表達了更高水平的某些與細胞毒性相關(guān)的基因限次，如GZMB和PRF1芒涡；與白細胞招募相關(guān)的基因，如CCL5卖漫；與增殖相關(guān)的基因费尽，如MKI67；以及與抗原呈遞相關(guān)的基因羊始，如HLA-DRA和CD74（圖6E和補充圖S7K旱幼；補充表S5）。
8. 此外突委，在基線時柏卤，Ttr樣群體中MHC II相關(guān)途徑的富集程度高于其它循環(huán)CD8+ T細胞（圖6F和補充圖S7L）。
9. 然而匀油，Ttr樣群體僅占血液中CD8+ T細胞的一小部分缘缚，這限制了我們直接利用其比例來區(qū)分不同響應(yīng)組的能力。

• 圖6. 與CRC治療反應(yīng)相關(guān)的外周特征 (A) 盒圖顯示循環(huán)CD8+ T細胞的克隆多樣性敌蚜。中心線表示中位值桥滨，下鉸鏈和上鉸鏈分別代表第25百分位和第75百分位，須狀線表示四分位距的1.5倍范圍钝侠。每個點代表一個患者该园。雙側(cè)t檢驗酸舍。
• (B) 腫瘤退縮與循環(huán)CD8+ T細胞中擴增或新出現(xiàn)的克隆計數(shù)之間的相關(guān)性帅韧。每個點代表一個患者。F檢驗啃勉。
• (C) UMAP圖顯示循環(huán)CD8+ T細胞的亞型（左）和腫瘤反應(yīng)性（右）忽舟。
• (D) 密度圖顯示循環(huán)CD8+ T細胞克隆的克隆大小分布。
• (E) 火山圖顯示循環(huán)CD8+ T細胞中Ttr樣細胞與非Ttr樣細胞之間差異表達的基因。紅色點表示調(diào)整后的p值小于0.05的單個基因叮阅，雙側(cè)t檢驗刁品。
• (F) 基線時循環(huán)Ttr樣和非Ttr樣CD8+ T細胞中富集的途徑。NES浩姥，標準化富集得分挑随。
• (G) 在我們的CRC隊列（左）和一個外部HNSCC數(shù)據(jù)集（右）中預(yù)測評分的受試者工作特征（ROC）曲線。
• (H) 盒圖顯示我們CRC隊列（左）和一個外部HNSCC數(shù)據(jù)集（右）中的基線預(yù)測評分勒叠。雙側(cè)t檢驗兜挨。對于HNSCC數(shù)據(jù)集，比較是在病理反應(yīng)高（N=7）和中位（N=10）的患者間進行眯分。
• (I) 盒圖顯示PD-1阻斷后預(yù)測評分的變化拌汇。雙側(cè)t檢驗。
• (J) 代表性直方圖顯示外周CD3+ CD8+ 細胞HLA-DR的熒光強度弊决。
• (K) 盒圖顯示外周CD3+ CD8+ 細胞HLA-DR的平均蛋白表達水平噪舀。每個點代表一個樣本。雙側(cè)t檢驗飘诗。另見圖S7与倡；表S1、S3和S5昆稿。

Para_02

1. 因此蒸走，我們檢查了在整個血液CD8+ T細胞庫中循環(huán)Ttr樣細胞提供的表型線索，并檢查是否存在與反應(yīng)相關(guān)的特定關(guān)聯(lián)貌嫡。
2. 令人驚訝的是比驻，在基線水平上，MHC II相關(guān)基因能夠有效區(qū)分CR組和PR組中的循環(huán)CD8+ T細胞岛抄，分類器達到了0.75的AUC值（圖S7M）别惦。
3. 為了獲得更簡潔的反應(yīng)預(yù)測標志物，我們對這些MHC II相關(guān)基因使用了Lasso回歸（STAR方法）夫椭，將候選基因列表縮小到HLA-DRA掸掸、HLA-DQA1、HLA-DQB1和CD74蹭秋。
4. 然后扰付，我們利用這些基因構(gòu)建了預(yù)測評分（STAR方法）。
5. 正如預(yù)期的那樣仁讨，該預(yù)測評分能夠在我們的CRC隊列中更好地區(qū)分基線水平上的CR和PR組羽莺，AUC達到0.798（圖6G和6H）。
6. 對于一個外部頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）數(shù)據(jù)集洞豁，AUC達到0.743來區(qū)分高反應(yīng)和中等反應(yīng)（圖6G和6H）盐固。
7. 這些結(jié)果表明荒给，這一評分可能為預(yù)測PD-1阻斷前的臨床反應(yīng)提供潛在的非侵入性方法。
8. 同時刁卜，我們跟蹤了治療過程中的循環(huán)CD8+ T細胞志电，并在部分反應(yīng)者中觀察到治療后這一預(yù)測評分顯著升高（圖6I）。
9. 為了進一步證實MHC II相關(guān)特征在循環(huán)CD8+ T細胞與臨床反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)蛔趴，我們分析了一個附加隊列的連續(xù)血液活檢樣本（表S1）挑辆，并通過流式細胞術(shù)評估了CD8+ T細胞中HLA-DR的平均表達水平。
10. 與轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)現(xiàn)一致孝情，基線水平上CD8+ T細胞中HLA-DR的平均表達量在CR患者中比PR患者更高（圖6J之拨、6K和S7N），而治療后僅在PR患者中觀察到顯著升高的平均表達量（圖6J和6K）咧叭。
11. 最后蚀乔，在部分反應(yīng)者的腫瘤和血液CD8+ T細胞中觀察到治療后MHC II相關(guān)基因的平行上調(diào)（圖S7O）。
12. 總之菲茬，外周具有作為響應(yīng)相關(guān)信號的重要儲存庫的潛力吉挣，這有助于區(qū)分分級反應(yīng)狀態(tài)。

Discussion

Para_01

1. 我們描繪了在人類結(jié)直腸癌（CRC）患者中婉弹，針對PD-1阻斷的不同臨床反應(yīng)所涉及的關(guān)鍵細胞和分子隔室的時空動態(tài)睬魂。
2. 在我們的隊列中納入了具有不同反應(yīng)的微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）CRC患者，使我們能夠觀察到微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和MSS患者之間在相同反應(yīng)狀態(tài)下的高度相似的細胞組成和轉(zhuǎn)錄表型镀赌。
3. 例如氯哮，P09是一名MSS完全應(yīng)答者，其特征是T細胞基線浸潤程度高商佛，并且在T細胞隔室內(nèi)相對擴增的耗竭性T細胞（Tex細胞）比例高喉钢。
4. 此外，該患者在接受治療期間也遵循與其他MSI完全應(yīng)答者相似的T細胞動態(tài)良姆。
5. 這些現(xiàn)象突顯了單細胞測量在彌合當前理解CRC患者異質(zhì)性反應(yīng)狀態(tài)方面潛力的重要性肠虽。
6. 盡管我們的研究主要強調(diào)了完全緩解（CR）與部分緩解（PR）之間的區(qū)別，但我們隊列中相對有限的疾病穩(wěn)定的（SD）患者數(shù)量限制了對非應(yīng)答性和原發(fā)抵抗機制的深入探索玛追。

Para_02

1. 有效的ICB治療引發(fā)了TME的系統(tǒng)性重塑税课。
2. 我們隊列中多種細胞類型的響應(yīng)相關(guān)動態(tài)高度相關(guān)，這激發(fā)了我們探索不同細胞類型在治療過程中的模塊化行為痊剖。
3. 通過基于NMF的分析韩玩，我們識別出幾個與不同響應(yīng)狀態(tài)相關(guān)的細胞程序（圖7A）。
4. 腫瘤富集程序和組織重建程序之間觀察到了幾乎相反的動態(tài)變化陆馁，可能代表了PD-1阻斷操縱抗腫瘤反應(yīng)所涉及的基本正交過程找颓。
5. CR腫瘤在治療過程中表現(xiàn)出腫瘤富集程序活性的明顯下降，而組織重建程序得到增強氮惯，表明經(jīng)過最佳治療后正常組織環(huán)境的復(fù)蘇叮雳。
6. 此外想暗，探索細胞程序內(nèi)各種細胞類型的協(xié)調(diào)行為可以為未來的治療策略提供有價值的線索妇汗。
7. 例如帘不，據(jù)報道LAMP3+樹突狀細胞能夠招募Tex細胞和調(diào)節(jié)性T細胞，因此它相應(yīng)地參與了腫瘤富集程序杨箭。
8. LAMP3+樹突狀細胞中包括PD-L1在內(nèi)的多種共抑制配體的高表達以及該程序在部分響應(yīng)者治療后的特異性富集表明寞焙，操控這些細胞以消除相應(yīng)的免疫抑制信號可能會提高治療效果。
9. 需要進一步的功能探索來更好地理解程序內(nèi)細胞類型之間的作用和相互作用互婿。

• 圖7. 在PD-1阻斷下的CRC局部和全身免疫模型（A-D）在PD-1阻斷下的CRC局部和全身免疫模型捣郊。
• 在局部TME中，協(xié)調(diào)的細胞程序（由虛線標記）顯示了不同基線活性和不同反應(yīng)組PD-1阻斷后的治療誘導(dǎo)變化（A）慈参。
• 在克隆水平上呛牲，Ttr樣亞型在腫瘤中顯示出不同的基線富集和動態(tài)模式，以及在CR和PR組治療后不同的血液相關(guān)性（B）驮配。
• Ttr樣細胞從血液浸潤到腫瘤組織伴隨表型變化（C）娘扩。
• 循環(huán)CD8+ T細胞能夠在基線時區(qū)分CR和PR組（D）。

Para_02

1. 與先前的研究一致壮锻，我們的隊列證實了Ttr樣細胞為中心的免疫在影響PD-1阻斷治療效果中的關(guān)鍵作用琐旁。
2. 我們?nèi)娴慕Y(jié)直腸癌數(shù)據(jù)從多個方面加深了當前的理解。
3. 我們證明了Ttr樣細胞既包括前體細胞也包括終末分化的Tex細胞猜绣，并且Ttr樣群體的普遍存在和功能狀態(tài)與治療反應(yīng)有著密切的關(guān)系（圖7B）灰殴。
4. 具體而言，在治療過程中掰邢，SD腫瘤的特點是Ttr樣細胞數(shù)量稀少牺陶，而兩個響應(yīng)組則出現(xiàn)了根據(jù)治療效果分級的動力學(xué)變化。
5. CR腫瘤含有豐富的Ttr樣細胞辣之，包括基線水平的Text和Texp細胞义图，而在有效治療干預(yù)下，大多數(shù)Text細胞逐漸減少召烂，并由Texp細胞加強碱工。
6. 同樣，最近一項關(guān)于頭頸鱗狀細胞癌的研究報告稱奏夫，終末分化Tex細胞的顯著減少與病理反應(yīng)相關(guān)怕篷。
7. 相比之下，雖然基線時滲透有限酗昼，但在PR腫瘤中廊谓，Texp和Text細胞在接受治療后逐漸積累。
8. 因此麻削，可以合理推測基線CR腫瘤具有"熱"的免疫狀態(tài)蒸痹，引入PD-1抗體能有效地引發(fā)基于Ttr樣細胞的強大抗腫瘤反應(yīng)春弥，導(dǎo)致惡性細胞的清除。
9. 在PR的較不利情況下叠荠，PD-1阻斷促進了Ttr樣群體的積累匿沛，但未能阻止它們獲得耗竭表型，這可能是由于殘余腫瘤抗原或其他在腫瘤微環(huán)境中未受干擾的免疫抑制信號的刺激所致

Para_03

1. 此前榛鼎，我們將‘克隆替換’的概念擴展到了‘克隆復(fù)興’逃呼，強調(diào)了在外周T細胞在PD-1阻斷期間Ttr樣細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。
2. 在我們的隊列中觀察到了來自外周的新舊Ttr樣克隆的增強者娱。
3. 此外抡笼，跨組織的單細胞水平譜系追蹤使得我們能夠捕捉到Ttr樣群體從外周浸潤到腫瘤過程中表達的變化。
4. 最近黄鳍，在小鼠腫瘤模型中提出了CD8+ T細胞在淋巴結(jié)和腫瘤中的兩階段啟動和激活推姻。
5. 盡管我們的研究缺乏淋巴結(jié)樣本，但我們的結(jié)果揭示了PD-1阻斷下人類CRC中癌癥免疫周期中Ttr樣群體的表型演變框沟。
6. 重要的是藏古，我們發(fā)現(xiàn)與外周的對應(yīng)細胞相比，進入腫瘤組織的Ttr樣細胞IFNG顯著上調(diào)街望。
7. 此外校翔，腫瘤中的Ttr樣細胞，其TCR在外周群體中可檢測到灾前，呈現(xiàn)出比那些沒有在外周出現(xiàn)的細胞更少的耗竭表型防症。
8. 然而，為了推廣我們的發(fā)現(xiàn)哎甲，更大的樣本量是必要的蔫敲，特別是考慮到對于每個患者只能檢測到數(shù)量有限的與腫瘤中的Ttr樣細胞共享TCR的循環(huán)細胞。
9. 我們的采樣進一步揭示了不同響應(yīng)組中Ttr樣細胞血液關(guān)聯(lián)性的差異炭玫，完全緩解的腫瘤中觀察到了更高水平的血液相關(guān)Ttr樣細胞奈嘿。
10. 值得注意的是，在某些完全緩解患者治療后可以檢測到循環(huán)中的Ttr樣和Texp細胞吞加，表明有效的ICB治療后有可能持續(xù)保護防止腫瘤復(fù)發(fā)裙犹。
11. 類似的現(xiàn)象在外周肺癌患者中也有觀察。
12. 需要進一步的研究來解析不同組織來源對PD-1阻斷背景下腫瘤Ttr樣池調(diào)節(jié)的影響

Para_04

1. 在我們的隊列中衔憨，經(jīng)過一定劑量的新輔助治療后叶圃，大多數(shù)PR腫瘤可以進行手術(shù)切除。
2. 有趣的是践图，我們觀察到掺冠，治療后PR腫瘤的局部腫瘤微環(huán)境的多個方面與基線CR腫瘤相似，比如Ttr樣細胞的積累和腫瘤富集程序的豐富码党。
3. 然而德崭，在治療后的PR腫瘤中檢測到了邊緣周邊關(guān)聯(lián)性斥黑，表明循環(huán)Ttr樣細胞參與局部抗腫瘤反應(yīng)的效果欠佳。
4. 在這種情況下眉厨，Ttr樣細胞可能缺乏足夠的支持锌奴，導(dǎo)致腫瘤消除無效，盡管前體和耗竭Ttr樣細胞的局部擴增仍可能導(dǎo)致部分腫瘤消退缺猛。
5. 因此缨叫，推測繼續(xù)對PR腫瘤使用抗PD-1治療可能是有益的椭符，特別是在有額外幫助促進周圍Ttr樣細胞招募的情況下荔燎。
6. 最后，通過分析循環(huán)Ttr樣細胞的特征销钝，我們在血液CD8+ T細胞中識別出了一個MHC II相關(guān)的特征有咨，這能夠區(qū)分部分反應(yīng)者和完全反應(yīng)者（圖7D）。
7. 這一發(fā)現(xiàn)進一步突顯了CD8+ T細胞全身激活在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵作用蒸健。
8. 有趣的是座享，在與治療相關(guān)的CD8+人群中有MHC II相關(guān)基因表達升高的現(xiàn)象已經(jīng)在肺癌、乳腺癌和HNSCC中被觀察到似忧，盡管主要是在非血液組織類型中渣叛，且特征基因并不完全相同。
9. 我們期待未來更大規(guī)模的隊列研究和蛋白質(zhì)水平的驗證將鞏固MHC II相關(guān)特征的預(yù)測能力盯捌。

Para_05

1. 總之淳衙，我們的研究為不同治療反應(yīng)狀態(tài)下的抗PD-1新輔助免疫治療后的細胞和分子動態(tài)提供了高分辨率的描繪。
2. 值得注意的是饺著，區(qū)分完全緩解和部分緩解患者的臨床和科學(xué)價值至關(guān)重要箫攀，這可能有助于實現(xiàn)器官保護并減輕許多患者的生理負擔。
3. 盡管仍需進行功能驗證和擴大樣本量的研究幼衰，但我們的結(jié)果推進了當前對PD-1阻斷調(diào)控下的局部和全身抗腫瘤免疫的理解靴跛。
4. 這樣的資源，部分通過我們交互式的網(wǎng)絡(luò)門戶（http://crc-icb.cancer-pku.cn/）反映出來渡嚣，可能為我們提供針對結(jié)直腸癌患者更有效的治療方法的見解梢睛。

Limitations

限制條件

Para_06

1. 本研究的一個局限性在于患者隊列規(guī)模有限，包括用于驗證的MSS患者和PR患者识椰，這可能妨礙得出普遍性的結(jié)論绝葡。
2. 此外，由于特定治療方案下臨床樣本稀缺裤唠，本研究中的功能驗證受到限制挤牛。
3. 許多結(jié)論仍然是描述性的，為了進一步將我們的發(fā)現(xiàn)與臨床環(huán)境聯(lián)系起來种蘸，深入的機制理解是必要的墓赴。
4. 雖然我們的方法已經(jīng)在多種癌癥類型中得到先前驗證竞膳，但本研究缺乏真實腫瘤反應(yīng)性T細胞的直接實驗證據(jù)。
5. 考慮到現(xiàn)實臨床環(huán)境的復(fù)雜性诫硕，未來需要前瞻性設(shè)計的研究來進一步驗證坦辟。

STAR★Methods

Key resources table

關(guān)鍵資源表格

Resource availability

資源可用性

Lead contact

主要聯(lián)系人

Para_01

1. 更多信息和資源及試劑的請求應(yīng)發(fā)送至通訊作者張澤民（zemin@pku.edu.cn），他將負責處理這些請求章办。

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究未產(chǎn)生新的獨特試劑锉走。

Data and code availability

數(shù)據(jù)和代碼的可獲得性

Para_01

1. 本研究處理過的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)可從基因表達聚類庫（GEO）獲得，其訪問編號為GSE236581藕届。
2. HNSCC58和NSCLC31的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)分別可在GEO上通過訪問編號GSE200996和GSE179994獲取挪蹭。
3. 本研究中的原始FASTQ文件依據(jù)中國規(guī)定，在基因組序列檔案庫下的訪問編號PRJCA018173發(fā)布休偶。
4. 用于生成本研究結(jié)果的源代碼已存檔于GitHub倉庫https://github.com/yqq-chen/CRC_ICB中梁厉。

Experimental model and study participant details

實驗?zāi)Ｐ秃脱芯繀⑴c者詳情

Human specimens

人類樣本

Para_01

1. 本研究獲得了北京大學(xué)研究與倫理委員會的批準，并遵守所有相關(guān)的倫理規(guī)范踏兜。所有參與者均提供了書面知情同意词顾。
2. 本研究在北京腫瘤醫(yī)院的真實世界環(huán)境下招募了二十二名接受免疫治療的患者，其中二十一名患者接受了術(shù)前新輔助免疫治療碱妆，一名患者（P02）在一線化療卡培他濱聯(lián)合貝伐珠單抗失敗后接受了二線免疫治療肉盹。
3. 患者的納入標準如下：(1) 組織病理學(xué)診斷為局部晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸、直腸或十二指腸腺癌疹尾；(2) 無盆腔放療上忍、直腸切除、免疫治療航棱、需抗生素治療的系統(tǒng)性感染或免疫系統(tǒng)疾病的歷史睡雇；(3) 臨床評估表明適合進行抗 PD-1 免疫治療。
4. 由于本研究的真實世界性質(zhì)以及倫理考量饮醇，特別是對于條件 (3)它抱，在我們的隊列中納入大量病情穩(wěn)定（SD）的患者并不現(xiàn)實。
5. 因此朴艰，將 P02 這名四期患者观蓄，其不可切除的轉(zhuǎn)移性腫瘤在一線化療失敗后接受了二線免疫治療，保留于本研究中祠墅。
6. 患者在每個 21 天周期的第一天接受靜脈注射 200 毫克 PD-1 抑制劑侮穿，歷時 30 分鐘。
7. 其中毁嗦，十七名患者接受了單一 PD-1 阻斷劑治療亲茅，十名患者接受了化療聯(lián)合 PD-1 阻斷劑治療（表 S1）。

Para_02

1. iRECIST（實體腫瘤療效評價標準）被用于可測量的主要病灶。
2. 具體而言克锣，如果患者符合以下任一條件茵肃，則被認為達到完全緩解（CR）：(1) 最后一次結(jié)腸鏡檢查時沒有可觸及或可見的病灶，在MRI或PET/CT上沒有明確的生命信號袭祟，并且癌胚抗原檢測呈陰性（臨床CR验残；這些患者可以根據(jù)潛在風(fēng)險酌情選擇觀察等待策略，并不會接受手術(shù)巾乳。）您没；或(2) 新輔助治療后的手術(shù)中，原發(fā)腫瘤部位或淋巴結(jié)未發(fā)現(xiàn)殘留癌細胞（病理學(xué)CR）胆绊，或者術(shù)后標本的病理學(xué)檢查顯示原發(fā)腫瘤床內(nèi)剩余存活腫瘤＜10％（主要病理學(xué)反應(yīng)）氨鹏。
3. 相反，如果新輔助治療后的手術(shù)中辑舷，術(shù)后標本的病理學(xué)檢查顯示原發(fā)腫瘤床內(nèi)剩余存活腫瘤≥10％但＜50％（部分病理學(xué)緩解）喻犁，則將患者歸類為部分緩解（PR）槽片。
4. 如果放射學(xué)證據(jù)表明靶病變直徑減少不超過30％或增加不超過20％何缓，且未出現(xiàn)新的病灶，則患者被歸類為病情穩(wěn)定（SD）还栓。
5. 病理學(xué)上碌廓，該情況表現(xiàn)為＞50％的存活腫瘤、大量殘余癌癥以及缺乏纖維化剩盒，這與NCCN TRG3一致谷婆。

Para_03

1. 22名患者中，16名患者在接受治療后腫瘤縮小至適宜大小辽聊，隨后進行了旨在治愈的手術(shù)切除纪挎。
2. 4名患者（P08、P09跟匆、P11和P24）臨床完全緩解后采取了觀察等待策略异袄。
3. 1名患者（P25）因個人原因拒絕手術(shù)，在最后一次隨訪時被歸類為疾病穩(wěn)定玛臂。
4. 另1名患者（P02）在手術(shù)前去世烤蜕。
5. 本研究中定義的腫瘤退縮率是治療后最大腫瘤直徑的影像學(xué)減少量與基線時最大腫瘤直徑的比例。

Mouse models

小鼠模型

Para_01

1. 雄性 OT-1 小鼠購自賽業(yè)生物科技（蘇州）股份有限公司迹冤，并在無特定病原體環(huán)境中飼養(yǎng)讽营，可以自由獲取水和標準飼料。
2. 進行移植時小鼠年齡為 8 周泡徙。
3. 將 PBS 中的 MC38-OVA 細胞以每處移植 1×10^5 個細胞的數(shù)量皮下接種橱鹏。
4. 當腫瘤體積達到 600 mm3 時收集外周血和皮下腫瘤樣本。

Method details

方法詳情

Sample collecting and processing

樣本采集與處理

Para_01

1. 根據(jù)結(jié)直腸癌臨床實踐指南，從腫瘤組織和至少5厘米遠的匹配正常組織區(qū)域收集組織活檢樣本莉兰，并在每次結(jié)腸鏡檢查或手術(shù)時平行采集5毫升外周血樣本狡蝶。

Para_02

1. 對于組織樣本，收集的腫瘤或鄰近正持活檢樣本在切除后立即存放在組織儲存溶液中贪惹，并置于冰上轉(zhuǎn)移。
2. 樣本清洗兩次后寂嘉，切割成大約1-2毫米立方的小塊奏瞬，然后收集在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）中，根據(jù)制造商的協(xié)議泉孩，使用gentleMACS腫瘤分離試劑盒（Miltenyi Biotec）在37°C下的轉(zhuǎn)子上進行60分鐘的酶解消化硼端。
3. 消化后的細胞通過含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen）中的100微米SmartStrainer過濾，并以400 g離心5分鐘寓搬。
4. 去除上清液后珍昨，沉淀的細胞在1毫升紅細胞裂解緩沖液（TIANDZ）中重懸，并在冰上孵育1分鐘進行紅細胞裂解句喷，隨后用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen）終止反應(yīng)镣典。
5. 再次以400 g離心5分鐘后，細胞沉淀會在分選緩沖液（含1% FBS的PBS）中重懸唾琼。

Para_03

1. 血液樣本收集于含EDTA抗凝劑的試管中兄春，并置于冰上保存以便轉(zhuǎn)移。
2. 恢復(fù)至室溫并充分混合后锡溯，使用HISTOPAQUE-1077（Sigma-Aldrich）溶液分離外周血單核細胞（PBMCs）赶舆。
3. 具體步驟如下：小心地將外周血覆蓋在等體積的HISTOPAQUE-1077上，不要破壞血漿與HISTOPAQUE-1077之間的界面祭饭。
4. 在400g條件下離心30分鐘后芜茵，小心地將淋巴細胞層轉(zhuǎn)移到新的試管中，并用1倍磷酸鹽緩沖液（PBS倡蝙，Invitrogen）洗滌兩次九串。
5. 按照上述程序裂解紅細胞后，收集到的淋巴細胞再懸浮于分選緩沖液（含1%胎牛血清的PBS）中悠咱。

Single cell sorting and data generation

單細胞分選及數(shù)據(jù)生成

Para_01

1. 為了在后續(xù)文庫構(gòu)建前獲得高質(zhì)量的細胞池扫尺，從血液或組織樣本中收集的單細胞懸浮液用針對7AAD（賽默飛）和CD235a（生物傳奇）的抗體進行染色埠胖，用于流式細胞術(shù)分選（BD Aria III儀器）捷绑。
2. 通過選擇7AAD- CD235a- 細胞蓬豁，富集了活細胞，并排除了殘留的紅細胞眼坏。

Para_02

1. 通過顯微鏡手動計數(shù)拂玻，將篩選出的細胞分裝至1.5毫升低吸附管（Eppendorf）中酸些。
2. 單細胞懸浮液的濃度調(diào)整為500-1200細胞/升。
3. 對于10x Chromium單細胞5′和VDJ文庫構(gòu)建（10x Genomics）檐蚜，加載了10,000-18,000個細胞魄懂。
4. 后續(xù)步驟遵循制造商的標準協(xié)議進行。
5. 純化的文庫通過Illumina NovaSeq平臺使用150堿基對雙端測序進行了分析闯第。

Para_03

1. 為了驗證人類樣本外周血中的MHC II相關(guān)特征市栗，首先按照上述程序獲得PBMC懸浮液。
2. 隨后咳短，使用Zombie紫色染料（Invitrogen）對細胞進行染色以區(qū)分活細胞和已標記的死細胞填帽。
3. 用含2%胎牛血清的PBS洗滌后，細胞與人Fc阻斷劑（BD）孵育10分鐘咙好，然后加入熒光素標記的抗體篡腌，并在4°C下孵育30分鐘以標記細胞表面抗原。
4. CD8+ T細胞被定義為Zombie紫色-勾效、CD45+嘹悼、CD11b-、CD19-层宫、CD3+和CD8a+的細胞杨伙。
5. 數(shù)據(jù)通過LSRFortessa（BD）收集，并使用FlowJo（BD）進行分析卒密。

Para_04

1. 對于小鼠樣本缀台，首先按照上述程序獲取組織，然后根據(jù)說明書使用紅細胞裂解緩沖液處理血液樣本哮奇。
2. 通過 Zombie NIR 可固定活性試劑盒（Biolegend）區(qū)分死細胞。
3. 用含2%胎牛血清的PBS洗滌后睛约，將分離出的細胞在4°C下與抗體孵育30-60分鐘以標記細胞表面抗原鼎俘。
4. 對于細胞內(nèi)染色，細胞先在4°C下用4%多聚甲醛固定1小時辩涝，然后在-20°C下用甲醇透化過夜贸伐。
5. 隨后，在室溫下用純化的鼠抗小鼠CD16/CD32（BD）封閉細胞10分鐘怔揩，并在4°C下與細胞內(nèi)抗原的抗體孵育1小時捉邢。
6. 數(shù)據(jù)使用LSRFortessa（BD）收集，并使用FlowJo（BD）進行分析商膊。

Multiplex immunofluorescence assay

多重免疫熒光測定

Para_01

1. 石蠟包埋組織被切成5微米厚的切片伏伐，并放置在載玻片上。
2. 首先在二甲苯中脫蠟晕拆，然后依次在100%（兩次）藐翎、95%和70%的酒精中復(fù)水，隨后使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0）進行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)及非特異性結(jié)合阻斷。
3. 移除阻斷緩沖液后吝镣，在室溫下與一抗孵育1小時堤器，包括兔抗人CD3抗體（Proteintech，目錄號17617-1-AP末贾，稀釋比例1:1500）闸溃，鼠抗人CD8抗體（CST，目錄號70306拱撵，稀釋比例1:400）圈暗，兔抗人CXCL13抗體（Abcam，目錄號ab246518裕膀，稀釋比例1:1000）员串，兔抗人CD4抗體（Abcam，目錄號ab133616昼扛，稀釋比例1:500）寸齐，鼠抗人CD8抗體（CST，目錄號70306抄谐，稀釋比例1:400）渺鹦，以及兔抗人CD20抗體（Abcam，目錄號ab78237蛹含，稀釋比例1:250）毅厚。
4. 然后用1x TBST緩沖液清洗三次，并在室溫下與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育10分鐘浦箱。
5. 使用稀釋至1:400的酪胺信號放大工作溶液（Panovue）進行信號放大吸耿，并在室溫下孵育10分鐘，之后進行微波加熱處理酷窥。
6. 重復(fù)上述步驟直至所有感興趣的抗體均完成染色咽安。
7. 最后，細胞核用DAPI染色蓬推。
8. 染色后的載玻片使用Olympus VS200進行掃描妆棒，并使用OlyVIA分析軟件（版本3.3）進行分析。

scRNA-seq data processing

單細胞RNA測序數(shù)據(jù)處理

Para_01

1. 應(yīng)用 Cell Ranger 單細胞工具包（版本 6.1.2）將讀段與 GRCh38 人類參考基因組對齊沸伏，并生成初步的唯一分子標識符（UMI）矩陣糕珊。
2. 使用 R 軟件包 Seurat（版本 4.2.1）來分析單細胞 RNA 測序數(shù)據(jù)。
3. 我們基于三個指標進行了嚴格的質(zhì)控篩選毅糟，以剔除低質(zhì)量細胞红选，包括總 UMI 計數(shù)、檢測到的基因數(shù)目和線粒體基因 UMI 計數(shù)的比例留特。
4. 具體而言纠脾，剔除了（1）UMI 計數(shù)少于 600 或多于 25,000 的細胞玛瘸，（2）檢測到的基因數(shù)少于 600 的細胞，或（3）線粒體基因計數(shù)超過 5%（CD45- 細胞為 70%）的細胞苟蹈。
5. 然后糊渊，我們采用 Seurat 實現(xiàn)的 NormalizeData 函數(shù)進行文庫大小校正和對數(shù)轉(zhuǎn)換，所得表達矩陣用于下游分析慧脱。

Dimension reduction and unsupervised clustering

降維和無監(jiān)督聚類

• 待補充

scTCR-seq data processing

scTCR-seq數(shù)據(jù)處理

Para_01

1. scTCR-seq數(shù)據(jù)使用Cell Ranger工具包進行處理渺绒，該工具將讀段與GRCh38人類參考基因組對齊，并組裝TCR序列菱鸥。
2. 隨后宗兼，我們篩選出初步組裝的TCR α鏈和β鏈的CDR3核酸序列，只保留那些高度可信氮采、全長且具有活性的序列殷绍，并為每條序列分配一個有效的細胞條形碼和明確的鏈類型。
3. 對于每個細胞鹊漠，保留α鏈和β鏈UMI計數(shù)最高的那一對用于身份識別主到。
4. 具有相同TCR對的細胞被認為是同一克隆型。
5. 總計躯概，57.72%（277,198/480,238）的T細胞檢測到了高質(zhì)量的TCR α-β對登钥，形成了181,909種克隆型。
6. CD4+和CD8+ T細胞的克隆型大小范圍分別為1至264或1496娶靡，其中有17,443種克隆型包含多于一個細胞（圖S2E和S2F）牧牢。
7. 我們使用先前基于熵的STARTRAC指標來檢查CD8+ T細胞的克隆擴增。
8. 我們使用R軟件包Startrac（版本0.1.0）中的Startrac.run函數(shù)計算STARTRAC-expa指數(shù)姿锭。
9. 為了量化循環(huán)CD8+ T細胞的克隆多樣性塔鳍，我們使用R軟件包entropy（版本1.3.1）中的entropy函數(shù)計算了每個血液樣本中CD8+ T細胞克隆型分布的熵。

Proportion analysis

比例分析

Para_01

1. 在這項研究中艾凯，特定樣本中的主要免疫細胞類型（包括T細胞献幔、B細胞、髓系細胞和ILCs）的細胞豐度被計算為特定主要細胞類型的細胞計數(shù)與總免疫細胞計數(shù)的比例（圖1F趾诗、S2C和S2D）。
2. 精細粒度的細胞亞型的細胞豐度被計算為特定樣本中特定細胞亞型的細胞計數(shù)與相應(yīng)的主要細胞譜系的細胞計數(shù)之比蹬蚁。
3. 對于Ttr-like亞型的比例恃泪，分母在圖中表示（圖4F、S6E和S6F）犀斋。
4. 對于采集了四個時間點的患者贝乎，來自兩個"治療中"樣本的細胞被視為一個整體來計算細胞頻率。
5. 一種主要細胞類型或細胞亞型在治療后的動態(tài)變化被定義為基線樣本與治療后樣本之間細胞豐度的變化叽粹。
6. Pi和Ti是根據(jù)我們先前的研究通過擬合線性模型來計算的览效，線性模型的兩個變量分別是（1）腫瘤退縮比例却舀，以及（2）基線細胞豐度或治療后細胞動態(tài)變化。
7. 具體而言锤灿，我們采用了R函數(shù)lm挽拔，使用得到的r.squared來量化相關(guān)性

Differential expression analysis

差異表達分析

Para_01

1. 兩個細胞群體之間的差異表達分析使用了Seurat軟件包中的FindMarkers函數(shù)進行。
2. 具體來說但校，采用t檢驗來評估每個基因的顯著性螃诅，并利用Benjamini–Hochberg程序?qū)Χ嘀丶僭O(shè)進行了校正。
3. 調(diào)整后的p值小于0.05被用來區(qū)分顯著差異表達的基因状囱。

Tissue enrichment analysis

組織富集分析

Para_01

1. 對于每種細胞亞型术裸，我們通過計算Ro/e評估了其在血液、鄰近正常組織和腫瘤組織中的分布模式亭枷，計算方法如先前所述袭艺。
2. 具體而言，Ro/e是特定組合的細胞亞型和組織的實際細胞數(shù)與預(yù)期細胞數(shù)的比例叨粘。
3. 我們使用R函數(shù)chisq.test來獲取實際和預(yù)期的細胞數(shù)猾编，輸入包括細胞類型注釋向量和組織向量。
4. 簡而言之宣鄙，當Ro/e大于1時袍镀，表明某種細胞亞型在特定組織中的出現(xiàn)頻率高于隨機預(yù)期，因此認為該細胞亞型在該組織中富集冻晤。
5. 為了進一步量化給定細胞類型在腫瘤組織與鄰近正常組織之間的分布差異苇羡，我們使用Pearson殘差進行計算，如先前所述鼻弧，該值由僅包含這兩種組織類型的細胞作為輸入的chisq.test函數(shù)獲得设江。（圖2A）

NMF analysis for cellular program identification

用于細胞程序識別的NMF分析

Para_01

1. 為了識別腫瘤微環(huán)境(TME)中的細胞程序，我們首先計算了所有TME細胞類型（不包括上皮細胞）在其各自主要細胞類型中的比例攘轩，得到了每個腫瘤樣本的豐度矩陣V（細胞類型×樣本）叉存。假設(shè)我們有n個樣本和m種細胞類型，那么豐度矩陣將是：V屬于R的m×n次冪度帮。
2. 數(shù)學(xué)表示為：V屬于R的m×n次冪點歼捏。

Para_02

1. 值得注意的是，V 中的所有元素均為非負笨篷。
2. 之前曾使用基于PCA的方法從類似的矩陣中提取細胞共變模式瞳秽。
3. 在這里，我們利用NMF的加性和可解釋性來從豐度矩陣V中發(fā)現(xiàn)細胞模塊或程序率翅。
4. 具體而言练俐，豐度矩陣可以分解為兩個非負低秩矩陣：V = WH。
5. 其中W ∈ R??和H ∈ R??冕臭，而k是預(yù)定義的因素數(shù)量腺晾。
6. 矩陣W中的元素wij（i = 1,...,m; j = 1,...,k）記錄了細胞類型i在對應(yīng)因素j上的加載量燕锥。
7. 而系數(shù)矩陣H中的元素hpq（p = 1,...,k; q = 1,...,n）反映了樣本q在估計的NMF因素p上的活動得分。
8. 我們運行了R包NMF（版本0.25）中的nmf函數(shù)多次（默認為20次）悯蝉，以執(zhí)行NMF分析归形。
9. 根據(jù)NMF包的參考手冊建議，每次運行使用相同的種子123456泉粉，以確保多運行時的可重復(fù)性连霉。
10. 計算了符合系數(shù)以衡量穩(wěn)定性，并據(jù)此選擇了5作為分解秩（圖S3C）嗡靡。
11. 我們將每個NMF因素視為一個細胞程序跺撼。
12. 然后對W矩陣采用單鏈路法和歐幾里得距離進行層次聚類，以檢測每個細胞程序的代表性細胞類型讨彼。
13. 每個細胞程序的活動動態(tài)被計算為每位患者治療后與基線樣本之間的活動得分變化歉井，其中正的活動動態(tài)表示治療后細胞程序活動增加。

Cellular interaction analysis

細胞相互作用分析

Para_01

1. 我們使用 Cellchat（版本 1.6.1）推斷了每對 TME 細胞類型之間的相互作用哈误。
2. 具體而言哩至，我們使用了 subsetCommunication 函數(shù)來獲取配體-受體矩陣，該矩陣包含了每對源-靶細胞類型之間每對配體-受體的相互作用類型信息蜜自。
3. 特定程序（NMF1-5）內(nèi)的相互作用被定義為那些源細胞和靶細胞類型在同一特定細胞程序中的相互作用菩貌。
4. 不同程序間的相互作用則被定義為那些源細胞和靶細胞類型不在同一細胞程序中的相互作用。

Identification of tumor-reactive-like CD8+ T cells

識別腫瘤反應(yīng)性類似的CD8+ T細胞

Para_01

1. 我們根據(jù)先前研究的程序確定了Ttr樣細胞群體重荠。簡而言之箭阶，來源于腫瘤的c23_CD8_Tex_LAYN細胞被視為根細胞，它們的克隆型被用來從CD8+ T細胞（不包括腸上皮內(nèi)淋巴細胞和黏膜相關(guān)不變T細胞）中檢索出原始的Ttr樣克隆池戈鲁。
2. 為了減少無監(jiān)督聚類和單細胞RNA測序數(shù)據(jù)丟失可能帶來的偏差仇参，我們在每個克隆內(nèi)部對CXCL13的表達進行了平均，并排除了那些平均表達水平低的克隆婆殿。小型克隆也被排除在外诈乒。
3. 剩下的克隆被認為是潛在的Ttr樣克隆，總共包含8,116個Ttr樣細胞婆芦。具體來說怕磨，我們通過三個連續(xù)步驟來識別這一群體

• 根據(jù)腫瘤組織中Tex (c23)細胞的TCR序列，提取潛在的Tex譜系克隆消约。

• 排除大小小于等于3或CXCL13平均表達水平低于0.1的克隆癌压。

• 從(2)中檢索出在整個腫瘤、相鄰正常組織和外周血中剩余的高質(zhì)量克隆型的所有細胞荆陆。

Para_02

1. 為了進一步確認鑒定出的Ttr樣細胞并非由大型旁觀者克隆偏倚所致，我們評估了腫瘤組織內(nèi)初始Ttr樣細胞（來自步驟2）中耗竭相關(guān)基因的克隆水平平均表達量集侯。
2. 首先被啼，我們將Ttr樣克隆分為優(yōu)勢克轮南（那些大小位于前10%，且克隆大小超過44的克屡ㄌ濉）和其他非優(yōu)勢克隆泡挺。
3. 值得注意的是，無論是優(yōu)勢還是非優(yōu)勢克隆組命浴，耗竭相關(guān)基因以及CXCL13的克隆水平平均表達量均高于非Ttr樣克侣γā（圖S5B）。
4. 此外生闲，我們沒有觀察到優(yōu)勢克隆與其他克隆之間存在明顯差異媳溺。

Para_03

1. 后續(xù)對類似Ttr細胞亞群的分析遵循了上述的維度縮減和無監(jiān)督聚類程序。
2. 與血液相關(guān)的類似Ttr細胞被定義為與外周血細胞共享TCR的組織來源的類似Ttr細胞碍讯。

Phenotypical mapping of tumor-reactive-like CD8 T cells

腫瘤反應(yīng)樣CD8 T細胞的表型映射

• 待補充

Definition of CD8+ T cell signature scores

CD8+ T細胞特征分數(shù)的定義

Para_01

1. 我們利用先前研究中非小細胞肺癌(NSCLC)T細胞的特征定義了T細胞祖細胞(Texp)評分和耗竭評分悬蔽。
2. 具體而言，耗竭評分是通過HAVCR2捉兴、ENTPD1蝎困、LAYN和LAG3計算得出。
3. 上述NSCLC研究中Texp簇的差異表達基因被用來計算Texp評分倍啥。
4. 根據(jù)已發(fā)表的T細胞研究禾乘，根據(jù)PRF1、GZMB虽缕、GZMA始藕、GZMH、NKG7和GNLY的表達水平來計算細胞毒性評分彼宠。
5. 我們通過來自GO術(shù)語"MHC II蛋白復(fù)合體"的基因定義了一個MHC II相關(guān)特征評分鳄虱。
6. 所有評分都是通過Seurat函數(shù)AddModuleScore計算得出的。

Predictive score identification

預(yù)測得分識別

Para_01

1. 我們通過最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸優(yōu)化了循環(huán)CD8+ T細胞中的MHC II相關(guān)特征得分凭峡，以使用較少的基因獲得更高的預(yù)測能力拙已。
2. LASSO回歸能夠從MHC II基因（GO術(shù)語"MHC II蛋白復(fù)合體"）中挑選出簡潔的變量，從而平衡模型的可預(yù)測性和可解釋性摧冀。
3. 具體而言倍踪。

• 對于每位患者，基線循環(huán)CD8+ T細胞中每個MHC II相關(guān)基因的表達被平均化索昂，從而得到一個患者×基因的輸入表達矩陣建车。

• 隨后，基于交叉驗證中最佳的準確性表現(xiàn)選擇了最優(yōu)調(diào)參的λ椒惨。對于選定的λ缤至，每個變量（基因）都被賦予了一個系數(shù)。

• 那些具有正系數(shù)的基因（HLA-DRA康谆、HLA-DQA1领斥、HLA-DQB1 和 CD74）被提取作為最優(yōu)變量嫉到。

• 我們將細胞級別的預(yù)測器定義為通過Seurat函數(shù)AddModuleScore使用默認參數(shù)獲得的HLA-DRA、HLA-DQA1月洛、HLA-DQB1和CD74的特征分數(shù)何恶。值得注意的是，我們并沒有直接使用回歸模型來進行預(yù)測嚼黔，考慮到這些學(xué)習(xí)到的系數(shù)可能在這個CRC數(shù)據(jù)集上過度擬合了细层。

• 最后，對于每位患者唬涧，我們將所有循環(huán)中的 CD8+ T 細胞獲得的模塊評分進行平均疫赎，作為患者層面的預(yù)測指標。

Quantification and Statistical analysis

量化與統(tǒng)計分析

Statistical analysis

統(tǒng)計分析

Para_01

1. 統(tǒng)計分析按照圖例中描述的方法進行爵卒。
2. 使用皮爾遜相關(guān)系數(shù)來估算細胞亞群之間的相關(guān)性虚缎。
3. 通過單因素方差分析和帶有邦費羅尼校正的學(xué)生氏t檢驗來確定統(tǒng)計學(xué)意義。

Additional resources

附加資源

Para_01

1. 可以在 http://crc-icb.cancer-pku.cn/ 進行單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集的分析和可視化钓株。

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