ARGs_OAP_v2.0（步驟1）：https://github.com/biofuture/Ublastx_stageone
ARGs-OAP在線分析網(wǎng)站（步驟2）： http://smile.hku.hk/SARGs

無(wú)處不在的抗性基因

圖片.png

環(huán)境中抗生素抗性基因（ARGs）的來(lái)源：
隨機(jī)突變或表達(dá)潛在抗性基因等方式使細(xì)菌體內(nèi)基因組上存在的抗性基因原型提佣、準(zhǔn)抗性基因或潛在抗性基因被表達(dá)出來(lái)叉趣，從而使細(xì)菌獲得的抗生素抗性。
抗生素在人和動(dòng)物腸道內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌社裆，這些編碼ARGs的耐藥菌經(jīng)由糞便排出并進(jìn)入環(huán)境中，是環(huán)境中ARGs的重要來(lái)源点寥。
抗性基因的水平轉(zhuǎn)移是抗性基因在環(huán)境中傳播的的主要機(jī)制崭倘，通過(guò)將包含抗性基因的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子悦析、整合子作為載體寿桨，通過(guò)細(xì)菌之間細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，將抗性基因從載體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。

如何檢測(cè)環(huán)境中抗生素抗性基因（ARGs）：

• PCR技術(shù)---定性亭螟。
• qPCR技術(shù)---定量挡鞍。
• 宏基因組測(cè)序：以環(huán)境樣品中的整個(gè)微生物群體基因組為研究對(duì)象，檢測(cè)環(huán)境樣本微生物中的物種組成预烙、豐度墨微，基因預(yù)測(cè)、基因豐度扁掸，利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋翘县，得到樣本中ARGs的種類和豐度與樣本的相關(guān)性。

• ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)：主要包含細(xì)菌病原菌的多種抗性基因數(shù)據(jù)谴分，不能為環(huán)境樣本宏基因組數(shù)據(jù)提供詳細(xì)的ARG概況（即對(duì)每個(gè)檢測(cè)到的ARG提供type/subtype的ARG分類信息和豐度信息）锈麸。
• CARD數(shù)據(jù)庫(kù)：以Antibiotic Resistance Ontology（ARO）為分類單位的形式所構(gòu)建，ARO用于關(guān)聯(lián)抗生素模塊及其目標(biāo)牺蹄、抗性機(jī)制忘伞、基因變異等信息。
  ResFinder：需要較長(zhǎng)的查詢r(jià)eads沙兰。對(duì)于在ResFinder中被檢測(cè)為ARG的序列氓奈，其必須至少覆蓋數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配ARG長(zhǎng)度的五分之二，具有不小于50％的相似性鼎天。
• ARGO：側(cè)重于萬(wàn)古霉素和β-內(nèi)酰胺抗性基因舀奶。
  ARG-ANNOT：設(shè)計(jì)用于檢測(cè)細(xì)菌基因組中的ARG而不是環(huán)境樣品。

構(gòu)建ARG綜合數(shù)據(jù)庫(kù)SARG v1.0

1. 整合CARD和ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)
   CARD數(shù)據(jù)庫(kù)2,513條序列斋射；
   ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)7,828條序列育勺；
   去除586條共享序列；
   SARG包含4246條ARGs參考序列绩鸣。
2. 去除非ARG序列
3. 去除冗余序列（完整蛋白質(zhì)序列具有100％同一性）
4. 去除與SNP相關(guān)的ARG序列
5. 去除描述為“假定蛋白質(zhì)”或“未命名蛋白質(zhì)”的序列
6. 構(gòu)建結(jié)構(gòu)化ARG數(shù)據(jù)庫(kù)SARG

構(gòu)建ARG綜合數(shù)據(jù)庫(kù)SARG v2.0

圖片.png

1. 使用SARG v1.0作為從NCBI-NR獲取潛在ARG序列的種子怀大。
2. NCBI-NR序列BLASTP比對(duì)SARG v1.0數(shù)據(jù)庫(kù)（e-value:1e-7, identity: 90％、80％呀闻、70％）化借； levels: Accurate, Moderate and Loose 。
3. 基于序列相似度或關(guān)鍵字匹配將ARG序列分配給不同的Subtype捡多。
4. 合并時(shí)蓖康，刪除有多個(gè)分類結(jié)果的序列，只保留具有匹配分類（type和subtype）的序列垒手。

Number of ARGs reference genes in core SARG database (column ‘core SARG’) and updated SARG database using different cut off of identity (90%, 80% and 70%) for retrieving. A is the profile before using parallel classification to seat each sequence into hierarchical structure. B is the results of sequences amount after being classified into specific ARGs types and subtypes.

ARGs-OAP概述

ARGs-OAP是一個(gè)抗生素抗性基因分析平臺(tái)蒜焊、在線分析工具。

ARGs-OAP可以從宏基因組數(shù)據(jù)集中快速鑒定并定量分析抗生素抗性基因科贬。
ARGs-OAP中包含一個(gè)結(jié)構(gòu)化ARG數(shù)據(jù)庫(kù)SARG（type--subtype--reference sequence）泳梆。

ARGs-OAP 1.0版包括CARD及ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)的序列鳖悠， 2.0版新納入了NCBI-NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的ARG序列。

使用ARGs-OAP 進(jìn)行注釋后优妙，對(duì)獲得的ARGs：可以通過(guò)總reads數(shù)乘综、16S rRNA基因拷貝數(shù)和細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行ARGs豐度標(biāo)準(zhǔn)化；2.0版優(yōu)化了細(xì)胞數(shù)量定量分析過(guò)程套硼。

ARGs-OAP在線工具使用步驟

1.本地計(jì)算機(jī)預(yù)先篩選潛在的ARG序列卡辰，以減少上傳序列文件的大小邪意；
2.使用在線平臺(tái)注釋/分類ARG序列九妈。

對(duì)于宏基因組數(shù)據(jù)，快速預(yù)篩選可去除總序??列> 99.3％的不相關(guān)序列雾鬼，顯著減少上傳文件的大小并加速在線BLASTX分析萌朱。

步驟2：上傳預(yù)篩選后的ARG序列數(shù)據(jù)至online pipeline。
ARGs_OAP_v2.0（步驟1）：https://github.com/biofuture/Ublastx_stageone
ARGs-OAP在線分析網(wǎng)站（步驟2）： http://smile.hku.hk/SARGs

The output files can be downloaded as tables listing the abundances of ARGs types/subtypes in different units:
“ppm” (number of ARGs sequences in one million sequences) ;
“copies of ARG per copy of 16S rRNA” ;
“copies of ARG per prokaryote’s cell” .

當(dāng)數(shù)據(jù)集包含新ARG時(shí)（即數(shù)據(jù)集2）：identity cutoff 設(shè)置為高于60％呆贿，則MCC值顯著下降（圖4a和4b）嚷兔，此水平下靈敏度也顯著降低（圖3d和4e），數(shù)據(jù)庫(kù)的不完整性對(duì)注釋精度影響不大（圖4g和4h）做入。
E-value 對(duì)這三個(gè)評(píng)估指標(biāo)的影響：MCC值和精度隨著E-value的減小而增加，但靈敏度沒(méi)有太大變化同衣。
評(píng)估序列長(zhǎng)度的影響：較長(zhǎng)的讀長(zhǎng)導(dǎo)致較高的MCC和靈敏度（圖3b和3c ）竟块。
最佳E-value 和 identity cutoff 值：與E值相比， identity值顯示出更大的影響耐齐。藍(lán)色箭頭表示在以前ARGs注釋（ E-value為1e-5浪秘， identity為90％）中對(duì)短讀數(shù)宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，MCC值和靈敏度較低假陰性率很高埠况，并且錯(cuò)過(guò)了許多ARG樣序列耸携。為了揭示更全面的ARG概況，基于使用模擬數(shù)據(jù)集2所示的MCC結(jié)果辕翰，如紅色箭頭所示夺衍，建議的最佳identity cutoff 為60％，E-value為1e-7喜命。

序列覆蓋度小于85％時(shí)沟沙，靈敏度和MCC值幾乎沒(méi)有影響。
序列覆蓋度從85％增加到100％時(shí)壁榕，靈敏度和MCC值急劇下降矛紫。
更嚴(yán)格的序列覆蓋度會(huì)錯(cuò)過(guò)更多類似ARG的序列。

參考文獻(xiàn)：
Yang Y, Jiang X, Chai B, et al. ARGs-OAP: online analysis pipeline for antibiotic resistance genes detection from metagenomic data using an integrated structured ARG-database[J]. Bioinformatics, 2016, 32(15):2346.
Yin X, Jiang X T, Chai B, et al. ARGs-OAP v2.0 with an Expanded SARG Database and Hidden Markov Models for Enhancement Characterization and Quantification of Antibiotic Resistance Genes in Environmental Metagenomes[J]. Bioinformatics, 2018.