系列筆記基于達(dá)澈生物講座視頻烫沙，從中初步學(xué)習(xí)了解生信分析中常遇到的組學(xué)分析技術(shù)。
ChIP-seq和 CUT&Tag隙笆、CUT&RUN講座視頻筆記 - 簡書
ATAC-seq講座視頻筆記 - 簡書
CLIP锌蓄、RIP-seq講座視頻筆記 - 簡書
Ribo-seq講座視頻筆記 - 簡書
RIC-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
(eccDNA)circle-seq講座視頻學(xué)習(xí) - 簡書
1、背景
1.1撑柔、RNA的特征
簡略介紹下RNA的相關(guān)知識(shí)参淹，感興趣可深入查閱教材截珍、文獻(xiàn)等
- RNA有著多種多樣的功能，可在遺傳編碼、翻譯梢薪、調(diào)控、基因表達(dá)等過程中發(fā)揮作用友瘤；通常由DNA經(jīng)由轉(zhuǎn)錄生成挤土。
- 其中，mRNA（信使RNA）為遺傳訊息的傳遞者肢扯，它能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成妒茬。
- 因?yàn)閙RNA有編碼蛋白質(zhì)的能力，它又被稱為編碼RNA蔚晨。而其他沒有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA則被稱為非編碼RNA（ncRNA）乍钻，主要包括tRNA與rRNA
- 相比DNA，RNA最大的區(qū)別有：單鏈铭腕，較短银择，由于存在互補(bǔ)序列通過折疊形成雙鏈接構(gòu)。
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RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs) 對(duì)RNA功能具有重要作用累舷，例如RNA運(yùn)輸浩考、可變剪切，翻譯等等析孽；具體可以見wiki的介紹
image from wiki -
RNA修飾(RNA modification)是指對(duì)RNA核糖核酸化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變（通常是接了一些基團(tuán)）袜瞬，可能會(huì)改變其功能或穩(wěn)定性。
以下圖m7G為例就是指在RNA鳥嘌呤(G)的第七位N上加上甲基的甲基化修飾
common RNA modification
1.2拍鲤、CLIP殿漠、RIP-seq
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CLIP绞幌、RIP-seq兩種技術(shù)莲蜘，我覺得就可以簡單理解為RNA版本的ChIP-seq
encode - 即主要研究特定RNA binding protein（RBP）在RNA上的分布以及RNA特定修飾的情況票渠。從而達(dá)到以下目的--
（1）驗(yàn)證RNA與靶蛋白的直接相互作用及精確的結(jié)合位點(diǎn)问顷；
（2）在全基因組范圍內(nèi)鑒定RNA與RBP的相互作用網(wǎng)絡(luò)杜窄；
（3）lncRNA/circleRNA功能機(jī)制研究以及miRNA靶標(biāo)鑒定塞耕。
也可以檢測出RNA間的相互作用（例如lncRNA與miRNA）
- 下面就簡單了解下這兩種技術(shù)扫外。
2廓脆、Clip-seq
- ultraviolet cross-linking and immunoprecipitation 紫外交聯(lián)停忿，免疫沉淀（2003年）
- 特征之一就是使用紫外交聯(lián)方式，RNA與附著的蛋白（RBP）以共價(jià)鍵形式綁在一起厚柳，用于研究RNA結(jié)合蛋白在體內(nèi)與眾多RNA靶標(biāo)（片段）的結(jié)合模式沐兵。
實(shí)驗(yàn)步驟
參考下圖
- 1~2：紫外照射扎谎，使RNA與蛋白之間形成共價(jià)結(jié)合毁靶；然后降解RNA非蛋白結(jié)合區(qū)域预吆；
- 3：使用RBP對(duì)應(yīng)的特異性抗體拐叉，捕捉目標(biāo)蛋白R(shí)NA復(fù)合物
- 4~5：RNA兩端修飾
- 6~9：富集扇商、純化、去蛋白蔬芥，再修飾笔诵、純化
- 10~11：反轉(zhuǎn)錄姑子、加接頭壁酬，PCR建庫
- 12：測序
升級(jí)過程
自2003年提出clip方法以來舆乔，出現(xiàn)很多改進(jìn)的版本
（1）iclip 2010年
- individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation希俩；
能夠以單堿基的分辨率，來展示RNA-蛋白互作的詳細(xì)信息 - 關(guān)鍵技術(shù)在于中間的 cDNA環(huán)化
（2）eclip 2015年
- enhanced clip
相比clip-seq璃搜，RBPs靶標(biāo)識(shí)別率提高了2-3倍 - 不同之處主要體現(xiàn)在RNA文庫制備步驟
在免疫沉淀的磁珠上添加一個(gè)3'RNA接頭用于和RNA片段交聯(lián)；并且添加一個(gè)3'單鏈DNA接頭用于反轉(zhuǎn)錄之后交聯(lián)
（3）hiclip 2017年
- hybrid and individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation吊档；
在全轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定與RBP結(jié)合的特定RNA復(fù)合體的方法 - 特征之一：若rbp同時(shí)結(jié)合兩個(gè)rna鏈怠硼，均可以捕獲出來香璃；
通過連接酶將雙鏈RNA的兩端壁進(jìn)行連接
2舟误、RIP-seq
- RNA immunoprecipitation sequencing
- 通過免疫沉淀目標(biāo)蛋白來捕獲蛋白體內(nèi)結(jié)合的RNA（基本類似chip-seq）
- 即主要利用能夠特異識(shí)別某一RBP或者某一RNA修飾的抗體嵌溢；
實(shí)驗(yàn)步驟（以m6A-MeRIP-seq為例）
參考下圖
- 首先提取total RNA堵腹，將RNA片段化（100nt左右）
- 使用帶有m6A抗體的免疫磁珠對(duì)發(fā)生m6A甲基化修飾的RNA片段進(jìn)行富集；
- 然后純化富集到的RNA片段旱易；
- 最后上機(jī)測序阀坏。
關(guān)于RIP與clip-seq的比較
image.png
3忌堂、數(shù)據(jù)分析
- 基本流程分析還是類似于chip-seq士修；
- 數(shù)據(jù)質(zhì)控→ 找peak → peak 分析棋嘲；
- 新的研究思路還是需要閱讀相關(guān)文獻(xiàn)沸移。
最后推薦一個(gè)研究RNA結(jié)構(gòu)的必備網(wǎng)站：ENCORI网沾，里面有很多公共clip-seq數(shù)據(jù)等
