作者：椰子糖
審稿：童蒙
編輯：amethyst
隨著單細胞測序技術(shù)的突破蛹头，單細胞測序的時代已然到來。2018年單細胞基因組學被science評為年度突破技術(shù)遮晚，2020年單細胞多組學技術(shù)被Nature Methods 評為2020年年度技術(shù)性昭。
其中10xGenomics作為單細胞測序方向上的佼佼者，持續(xù)致力于單細胞測序技術(shù)和新應(yīng)用的開發(fā)县遣，推動這單細胞測序時代的快速發(fā)展糜颠。目前應(yīng)用其技術(shù)已經(jīng)發(fā)表了2200+的文章，國內(nèi)達230+的文章萧求，其中大多數(shù)集中在人和動物方面括蝠，近年來，其在植物方向上的應(yīng)用也在逐步擴大饭聚，涉及的物種包括擬南芥、水稻搁拙，以及玉米秒梳，本文就帶大家一起看一下2021年1月4日由美國冷泉港實驗室發(fā)表的有關(guān)玉米穗單細胞的文章法绵。
一、文章概覽
作物生產(chǎn)力取決于分生組織的活動能力酪碘。分生組織發(fā)育成植物的組織朋譬，包括玉米穗的結(jié)構(gòu)。全面了解植物的發(fā)育過程需要洞察細胞類型和發(fā)育區(qū)域的多樣性以及它們所需的特定的基因網(wǎng)絡(luò)兴垦。到目前為止徙赢，這些發(fā)育的過程主要是通過形態(tài)學和傳統(tǒng)遺傳學的知識來鑒定的，而傳統(tǒng)遺傳學又受限于遺傳轉(zhuǎn)錄的冗余和多樣性探越。
文章研究了12525個來自玉米穗發(fā)育的單個細胞的轉(zhuǎn)錄譜狡赐。由此產(chǎn)生的發(fā)育圖譜提供了花序的單細胞RNA測序（scRNA-seq）圖譜。并通過mRNA原位雜交和熒光活化細胞分類（FACS）RNA序列驗證了我們的結(jié)果钦幔，并通過預(yù)測遺傳冗余枕屉、整合轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)和鑒定與作物產(chǎn)量性狀相關(guān)的候選基因，進一步展示了這些數(shù)據(jù)如何促進遺傳研究鲤氢。
文章概覽如下：
二搀擂、背景介紹
植物植株是由多能干細胞及其后代發(fā)育的分生組織發(fā)育而來的。分生組織能夠分化為不同的細胞類型和具有特定功能的結(jié)構(gòu)卷玉。在玉米穗發(fā)育過程中哨颂，部分分生組織形成花序結(jié)構(gòu)。
突變體研究已經(jīng)確定了關(guān)鍵的細胞類型或結(jié)構(gòu)特異性調(diào)控因子相种，通過突變不同的發(fā)育結(jié)構(gòu)域來調(diào)整花序結(jié)構(gòu)的發(fā)育（Vollbrecht &Schmidt威恼，2009）。例如蚂子，KNOTTED1（KN1）編碼的同源域轉(zhuǎn)錄因子對分生組織的建立和維持至關(guān)重要沃测，并且在整個莖分生組織中表達（Jackson等人，1994）食茎。通過對KN1的突變來研究其在分化過程中的作用蒂破。在進化或馴化過程中，許多關(guān)鍵的調(diào)控因子調(diào)控花序的結(jié)構(gòu)的發(fā)育别渔，這些調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)是因為基因突變體的存在而得以實現(xiàn)的附迷，同時這些突變體阻礙了的細胞在某些特定方向上的發(fā)育。然而哎媚，這些理論都受到遺傳轉(zhuǎn)錄冗余性和多樣性的限制喇伯，因此需要一個特定細胞類型和結(jié)構(gòu)分布的高分辨率表達圖譜來進一步了解控制發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)。
單細胞RNA測序（scRNA-seq）提供了高分辨率分析基因表達和構(gòu)建復(fù)雜器官或生物體發(fā)育圖譜的機會拨与。最近稻据，10x Genomics scRNA-seq平臺已被廣泛用于鑒定擬南芥根中的細胞類型或結(jié)構(gòu)域標記（Rich Griffinetal.，2020）买喧，但該技術(shù)在莖組織中的應(yīng)用還受到限制捻悯。單細胞測序的數(shù)據(jù)可以結(jié)合CHIP-seq的對轉(zhuǎn)錄因子的鑒定或者survey對染色體狀態(tài)的研究匆赃，以得到更完善的基因表達的信息。
文章利用10xGenomics scRNA-seq技術(shù)優(yōu)化了一個方案今缚，生成了玉米穗花序發(fā)育的高分辨率轉(zhuǎn)錄組圖譜算柳，進一步構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并確立與玉米穗產(chǎn)量性狀相關(guān)的候選基因姓言。
三瞬项、結(jié)果
1、玉米穗發(fā)育過程的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建
植物的單細胞圖譜構(gòu)建的兩大挑戰(zhàn)何荚，其中之一就是原生質(zhì)體的制備囱淋，文章采用5-10mm階段的玉米穗，這個階段決定了整個穗的發(fā)育兽泣，包括分生組織的起始绎橘，維持和終止以及器官發(fā)育的規(guī)格等。作者優(yōu)化了細胞壁消化的方法唠倦，考慮到 不同細胞組成的差異称鳞，消化時間使用的45min。然而在制備原生質(zhì)體的過程中稠鼻，通過過濾去除破碎細胞中的小碎片和細胞器冈止，然后通過流式細胞儀進入10xGenomoics系統(tǒng)制備文庫，然后利用Illumina平臺測序候齿，分析了來自三個獨立重復(fù)的12525個單細胞熙暴，檢測了28899個基因的表達， 與普通轉(zhuǎn)錄組的基因表達檢測情況相當慌盯。使用MetaNeighbor進行細胞聚類周霉，共將其聚成12個類別。
構(gòu)建植物單細胞圖譜的另一個重要挑戰(zhàn)就是細胞類別的注釋和鑒定亚皂。為了鑒定每個聚類的差異性俱箱，作者編制了一份已知或預(yù)測的花序發(fā)育標記基因的列表，這些基因的表達模式已經(jīng)在以往的玉米或擬南芥相關(guān)研究中進行了證實灭必，其中74個基因在玉米中都有突變表型狞谱，本次檢測中檢測出了73個基因的表達，并且每個基因在12個類別中1個或者多個中表達量豐富禁漓。例如為了鑒定分生組織細胞類型跟衅，使用KN1基因，其在整個分生組織以及正在發(fā)育的莖和管道組織中表達播歼，但并不在表皮和側(cè)器官中表達伶跷。正如預(yù)期，KN1在12個類別中的10個中高表達，其他特征基因的表達情況也在下圖中可以展示撩穿。玉米穗分生組織的縱切面和橫切面也分別展示在下圖的G和H中磷支，其也顯示了與scRNA的細胞聚類情況一致。
2食寡、通過mRNA原位雜交和FACS RNA-seq驗證單細胞測序結(jié)果
下圖A繪制每個聚類中top2的marker基因的表達情況，其中顏色表示表達量的Z_score值廓潜，圓點大小表示細胞表達的百分數(shù)抵皱。進一步作者對關(guān)鍵的marker基因進行mRNA的原位雜交，顏色深淺表示基因的表達量情況辩蛋。Marker基因的在組織中的表達情況與scRNAseq的結(jié)果相一致呻畸。
3、單細胞測序預(yù)測有助于構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
通過基因敲除的方式可以來研究某個基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用悼院。從2個月大的莖尖（左下圖伤为，比例尺=100 mm）和6個月大的沒有穗或流蘇的植株可以看出，CRISPR-Cas9在ZmVOZ基因中敲除4個突變的玉米植株未能過渡到開花据途。
轉(zhuǎn)錄因子（TF）的直接調(diào)控靶點在相同的細胞類型中共同表達绞愚，使用scRNA-seq數(shù)據(jù)來計算KN1與其公布的直接調(diào)控的靶點的共表達，發(fā)現(xiàn)與所有玉米基因的對照相比颖医，其顯著高于預(yù)期位衩。KN1直接調(diào)控的轉(zhuǎn)錄靶點在單細胞表達水平上與KN1顯著共表達，支持原來的假設(shè)熔萧。KN1在除了表皮和側(cè)器官中表達量均較高糖驴，而通過scRNA的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ZmHDZIV8在3，6這兩個聚類中大量表達佛致，同時側(cè)器官中的Marker基因ZmYAB4在聚類3中表達贮缕，因此明確了兩個細胞類別。為了驗證俺榆，接下來作者整合了兩個額外的ChIP-seq數(shù)據(jù)集感昼，用于ZmHOMEODOMAIN亮氨酸拉鏈IV6（ZmHDZIV6）（Javelle 等人，2011年）和ZmMADS16（ZmM16）（Bartlett等人肋演，2015年）在特定花器官中表達抑诸。對于每一個TF在 Chip-seq的生物學重復(fù)中均有顯著重疊，作者確定了ZMMADZIV6和ZmM16的907個高置信度峰爹殊，并對這兩個基因的motif進行進一步的研究砸泛。
mHDZIV6候選調(diào)控靶點ZmNIP1A（G）和ZmPROPEP1（J）在scRNA序列中與ZmHDZIV6高度共表達。
4酪呻、單細胞測序鑒定的基因與玉米穗部性狀相關(guān)
玉米穗形態(tài)與產(chǎn)量性狀相關(guān)塘淑。為了研究在單細胞轉(zhuǎn)錄組中鑒定的細胞聚類和標記基因是否與玉米產(chǎn)量的候選調(diào)控因子一致。通過GWAS的方法，比較分生組織辛块、側(cè)器官和微管組織的scRNA-seq的Marker基因與281個玉米穗部與產(chǎn)量相關(guān)的形態(tài)性狀的GWAS的結(jié)果結(jié)合畔派。利用scRNA-seq的Marker基因2kb內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性，作者發(fā)現(xiàn)meta cluster 3標記基因ZmYABBY9（ZmYAB9）在CW（穗軸重量上）顯著润绵。圖A中展示了玉米的相關(guān)產(chǎn)量的性狀线椰。同時還發(fā)現(xiàn)兩個顯著的單核苷酸多態(tài)性（10%FDR）與穗直徑（ED）相關(guān)。
四尘盼、總結(jié)
總之憨愉，scRNA-seq為玉米穗發(fā)育的研究做出了重要貢獻。該圖譜可為發(fā)育遺傳學研究和育種提供基礎(chǔ)卿捎，文章開發(fā)的原生質(zhì)體的制備方法和分析的方法可應(yīng)用于其他復(fù)雜地上部系統(tǒng)的研究配紫。隨著越來越多的植物scRNA-seq數(shù)據(jù)集的產(chǎn)生，一個跨物種（例如午阵，玉米和擬南芥之間）或跨組織（例如躺孝，莖和根）在單細胞分辨率下的比較分析將告訴我們在進化過程中如何選擇基因特征，以形成對增殖增產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要的各種形態(tài)底桂。
五植袍、參考文獻
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