九酝豪、致病性鏈球菌-G+横侦、甲乙型溶血性、丙型妒蛇；ABCD等20群Lancefield分群

• 非侵襲性（即淺表性）感染：咽炎恩脂、膿皰病帽氓、丹毒、陰道炎
• 侵襲性感染：菌血癥俩块、蜂窩織炎黎休、新生兒敗血癥、心包炎玉凯、腦膜炎
• 毒素相關(guān)：猩紅熱势腮、毒素休克綜合征STSS
• 變態(tài)反應(yīng)性疾病：風(fēng)濕熱漫仆、急性腎小球腎炎

G+嫉鲸！常見化膿性球菌，廣泛分布
血平板溶血現(xiàn)象分類

1. 甲型溶血性鏈球菌：1~2 mm溶血環(huán)歹啼，草綠色溶血環(huán)玄渗，α溶血
2. 乙型溶血性鏈球菌：2~4 mm座菠，界限分明、完全透明溶血環(huán)藤树，β溶血
3. <u>丙型鏈球菌</u>：無溶血環(huán)浴滴、不產(chǎn)溶血素，一般不致病岁钓。

(一)化膿性鏈球菌

1. 采取標(biāo)本
   急性期升略，抗生素之前最佳
   冷藏運(yùn)送，1天內(nèi)屡限、最好＜2天
2. 病原分離
   含5%脫纖維羊血的胰酶消化大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基品嚣，增菌用THB肉湯
   膿液、咽拭子直接血瓊脂平板钧大，血液翰撑、腦脊液先增菌→劃種血瓊脂平板
   35~37℃，24 h啊央，灰白色眶诈、透明or不透明、有乳光瓜饥、圓形突起小菌落
   顯微鏡下鏈狀排列逝撬，液體培養(yǎng)基中形成長(zhǎng)鏈，48 h乓土、可提高檢出率
3. 病原鑒定
4. 桿菌肽敏感試驗(yàn)：95%A群鏈球菌對(duì)桿菌肽非常敏感宪潮、抑菌環(huán)＞10 mm，血瓊脂平板趣苏、肉湯培養(yǎng)物涂抹
5. CAMP試驗(yàn)：血平板上B群鏈球菌坎炼、產(chǎn)生CAMP因子，促進(jìn)金葡菌β溶血素活性拦键。
   B群鑒定指標(biāo)！血平板上檩淋、金葡菌直線芬为，待檢菌垂直平分線，35℃過夜蟀悦，矢形(半月形)加強(qiáng)溶血區(qū)媚朦，CAMP+
6. 馬尿酸鈉水解試驗(yàn)：B群具馬尿酸鈉水解酶。接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基日戈，35℃48 h询张，離心上清液＋FeCl3試劑，恒定沉淀+ →推斷為B群
7. 七葉苷水解試驗(yàn)：Ｄ群鏈球菌水解七葉苷浙炼，生成葡萄糖＋七葉素份氧，七葉素＋枸緣酸鐵Fe2+→黑色沉淀物唯袄。接種于七葉苷培養(yǎng)基，35℃過夜蜗帜，變黑+
8. 6.5%NaCl生長(zhǎng)試驗(yàn)：D群鏈球菌耐鹽能力強(qiáng)恋拷，接種6.5%NaCl瓊脂培養(yǎng)基，35℃過夜厅缺，長(zhǎng)菌落&變黃蔬顾！+，不長(zhǎng)-
9. 血清學(xué)試驗(yàn)：細(xì)胞壁的多糖抗原不同湘捎，ABCD等20群诀豁，Lancefield分群，致病鏈球菌90%為A群(桿菌肽)
10. 快速檢測(cè)方法
11. 酶標(biāo)免疫測(cè)定法：A群窥妇，咽拭子舷胜，10分鐘鑒定是否A群
12. 聚合酶鏈反應(yīng)：特異擴(kuò)增A群的致熱外毒素A、B秩伞、C基因speA逞带、speB、speC纱新；溶血素O基因slo
13. 抗體檢測(cè)
    常用抗體為“抗溶血素O”ASO展氓。溶血法&乳膠凝集法，主要用于輔助診斷風(fēng)濕熱&腎小球腎炎脸爱。

(二)肺炎鏈球菌（G+遇汞！有莢膜！矛頭狀肺炎雙球菌--奧普托欣試驗(yàn)簿废、膽汁溶菌試驗(yàn)空入、菊糖發(fā)酵試驗(yàn)）

機(jī)體內(nèi)形成莢膜（<u>☆莢膜腫脹試驗(yàn)</u>）
兼性厭氧、<u>營(yíng)養(yǎng)要求高</u>族檬、培養(yǎng)基需含血液or血清
37.5℃歪赢、pH7.4~7.8、初次培養(yǎng)需CO2孵箱单料。血瓊脂平板上細(xì)小埋凯、灰色、有光澤扁平菌落扫尖，草綠色α溶血環(huán)

1. 采取標(biāo)本
   根據(jù)病種：痰白对、膿、血液or腦脊液
2. 鏡檢
   痰换怖、膿甩恼、腦脊液沉淀物→涂片革蘭染色，典型G+、具有莢膜的矛頭狀雙球菌
3. 病原分離
   直接畫線接種血瓊脂平板条摸，37℃悦污、24 h，挑取α溶血可疑菌落做鑒定屈溉，腦脊液和血液需先血清肉湯增菌塞关。
4. 病原鑒定
   肺炎鏈球菌主要與（甲型溶血性鏈球菌）鑒別
   <u>奧普托欣試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)子巾、菊糖發(fā)酵試驗(yàn)</u> 最常用帆赢。
5. 奧普托欣試驗(yàn)：可疑α溶血性菌落涂于血瓊脂平板，直徑6mm“P”紙片or奧普托欣紙片中央→CO2孵箱or燭缸线梗、35℃椰于、18~24 h→＞14mm生長(zhǎng)抑制區(qū)帶為+、α溶血菌株是肺炎鏈球菌仪搔。無生長(zhǎng)抑制區(qū)帶的→產(chǎn)毒性鏈球菌瘾婿。9~13mm生長(zhǎng)抑制區(qū)帶→膽汁溶菌試驗(yàn)
6. 膽汁溶菌試驗(yàn)（平板法也可，新鮮平板烤咧，10%脫氧膽酸鈉1滴偏陪，15 mins）：菌株懸于0.5ml鹽水，0.5麥?zhǔn)蠁挝幻芏葮?biāo)準(zhǔn)→分2份0.25ml煮嫌，＋0.25ml鹽水/2%脫氧膽酸（膽鹽）→輕搖后35~37℃笛谦、2 h→（細(xì)胞裂解）管液清澈or濁度消失為+，肺炎鏈球菌昌阿。

(三)豬鏈球菌

35個(gè)血清型饥脑，最常見2型（R群）、1型,7型懦冰、9型也致病灶轰。

1. 采取標(biāo)本
   血液、腦脊液刷钢、腹水笋颤、實(shí)質(zhì)臟器→直接涂片、革蘭染色→G+球菌
2. 病原分離
   直接涂布新鮮羊血瓊脂平板分離内地，腦心培養(yǎng)基or血培養(yǎng)瓶增菌伴澄。
   選擇性培養(yǎng)（15μg/ml多粘菌素B，30μg/ml萘啶酮酸的腦心培養(yǎng)基）增菌→新鮮羊血瓊脂平板瓤鼻、37℃、燭缸o(hù)r 5%CO2贤重、24~72 h→α溶血的可疑菌落涂片&革蘭染色→G+球菌
3. 病原鑒定
4. 生長(zhǎng)特性：10℃茬祷、45℃、6.5%NaCl并蝗、pH 9.6祭犯、麥康凱培養(yǎng)基條件下不生長(zhǎng)
5. 生化試驗(yàn)：V-P(-)秸妥、馬尿酸鹽(-)、乳糖(+)沃粗、葡萄糖(+)粥惧、淀粉(+)等。最盅。突雪。。
6. 深入鑒定
   PCR特異基因等

十涡贱、鉤端螺旋體（鉤體咏删、鉤體病，G-问词、人獸共患病督函，Korthof、EMJH培養(yǎng)基激挪、顯微凝集試驗(yàn)MAT）

鉤端螺旋體下有2個(gè)種：

• 問號(hào)鉤端螺旋體（致病性）
• 雙曲鉤端螺旋體（非致病性）

G-辰狡、酸堿敏感pH 7.2_7.5、2830℃垄分、需氧or微需氧宛篇，生長(zhǎng)慢
由柱形原生質(zhì)體、內(nèi)鞭毛（軸絲）锋喜、外膜組成些己。

1. 采取標(biāo)本
   血液、腦脊液→抗凝劑試管（不可用枸櫞酸鈉-抑制鉤體生長(zhǎng)）<u>5~20℃</u>保存嘿般、一周內(nèi)接種培養(yǎng)基段标。
   尿癥期→中段尿液→1%牛血清白蛋白將尿液稀釋10倍→5~20℃保存數(shù)日
   眼部并發(fā)癥→眼房水
   羊水，地表水炉奴、死亡數(shù)小時(shí)內(nèi)→內(nèi)臟or骨髓
2. 病原分離
   血液中含生長(zhǎng)抑制物逼庞，1~2滴血液or0.5ml腦脊液接種到5ml培養(yǎng)基（<u>Korthof</u>、EMJH培養(yǎng)基）2管
   尿液→磷酸鹽緩沖液1:10瞻赶、1:100稀釋→取50μl接種5ml培養(yǎng)基（加入新霉素濾紙片or5-氟尿嘧啶）
   器官組織：腎皮質(zhì)小米粒組織塊-研碎
   環(huán)境水樣：3ml注射豚鼠腹腔赛糟，4 h取心血培養(yǎng)，4 weeks取血液砸逊、腎璧南、腦培養(yǎng)&血清學(xué)試驗(yàn)。
   室溫（20~30℃）培養(yǎng)所有標(biāo)本师逸、暗視野顯微鏡司倚、1滴培養(yǎng)物、每周查一次、5周动知。每月查2次皿伺、4個(gè)月→陰性。
   陽性通常1~2周培養(yǎng)：培養(yǎng)液透明盒粮、輕度乳光鸵鸥、搖動(dòng)-云霧狀渾濁，鏡下運(yùn)動(dòng)活潑丹皱、1端or2端有鉤
3. 病原鑒定
4. 鉤體血清“群”鑒定：顯微凝集試驗(yàn)MAT妒穴，兔免疫血清、PBS倍比稀釋1:20~1:3200种呐、96孔板宰翅、每孔50μl菌懸液、37℃2 h爽室、暗視野顯微鏡汁讼、50%菌體凝集的最大稀釋度為“凝集滴度”。
   血清型水平→交叉凝集吸收試驗(yàn)阔墩、參考實(shí)驗(yàn)室
5. 鉤端螺旋體鑒定：分子生物學(xué)技術(shù)
6. 抗體檢測(cè)
7. 收集標(biāo)本：急性期嘿架、恢復(fù)期雙份血清，56℃水浴30 mins滅活啸箫。間隔1周
8. 抗原制備：國內(nèi)15群15型鉤體參考株接種培養(yǎng)基耸彪，28_{30℃培養(yǎng)5}7 d，≥50條/高倍視野(400×)忘苛，運(yùn)動(dòng)活潑無自凝蝉娜。
9. 血清鹽水稀釋，50μl扎唾，96孔板召川，參考株鉤體活菌，37℃孵育2 h胸遇。50%菌體凝集→最大稀釋度荧呐、凝集滴度，4倍↑-診斷意義纸镊。

十一倍阐、萊姆病原(1985年我國發(fā)現(xiàn)。BSK培養(yǎng)基逗威、蜱峰搪、鼠-宿主、發(fā)酵代謝產(chǎn)物--<u>乳酸</u>凯旭，與梅毒概耻、鉤端螺旋體不同）

伯道疏螺旋體：左旋楣颠、10~40μm、(表層咐蚯、外膜、鞭毛弄贿、原生質(zhì)柱)春锋、BSK培養(yǎng)基
G-、發(fā)酵代謝產(chǎn)物--乳酸差凹，與梅毒期奔、鉤端螺旋體不同
☆1985年我國發(fā)現(xiàn)

1. 采取標(biāo)本
   血液、尿液危尿、腦脊液
   蜱傳播媒介呐萌，鼠是主要“宿主”，采取標(biāo)本谊娇。
   -20~4℃運(yùn)送
2. 鏡檢
   蜱中“腸”肺孤，鼠、病人組織制成懸液济欢，暗視野顯微鏡直接檢查赠堵。
   涂片→組織學(xué)染色、特異直接熒光抗體染色→用于動(dòng)物調(diào)查法褥、病人快速診斷（檢出率低）
3. 病原分離
   鼠類組織茫叭、蜱中腸、病人血0.2~0.5ml半等，紅斑周圍皮膚組織→接種BSK培養(yǎng)基揍愁、33℃培養(yǎng)，每周暗視野顯微鏡檢查1次杀饵，及時(shí)傳代莽囤。1個(gè)月后陰性則盲傳一代。
4. 病原鑒定（需要熒光顯微鏡）
   間接IFA鑒定：兔抗B31特異性多克隆抗體or萊姆病特異單克隆抗體(4倍↑or≥1:256診斷)
   PCR基因分型--if致病基因型
5. 尿液檢測(cè)
   PCR尿液特異DNA片段
6. 抗體檢測(cè)
   ELISA凹髓、IFA(4倍↑or≥1:256診斷)烁登、WB（最終確診方法）

十二、布魯氏菌(肝浸膏瓊脂培養(yǎng)基蔚舀、噬菌體裂解Tb饵沧、血清試管凝集試驗(yàn)SAT、虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)RBPT赌躺、乳環(huán)凝集實(shí)驗(yàn)）

一組球狀狼牺、球桿狀、短桿狀細(xì)菌 礼患，無鞭毛是钥、無芽孢掠归。光滑型有莢膜，G-
專性需氧悄泥，37℃虏冻、pH6.6_{6.8，部分初次分離需5%}10%CO2弹囚，高營(yíng)養(yǎng)厨相、生長(zhǎng)慢、48 h微小鸥鹉、無色蛮穿、透明、凸起毁渗、光滑型菌落践磅，無溶血。
布魯氏菌屬灸异、6個(gè)種19個(gè)生物型：羊種1_{3府适，牛種1}7，豬種1~5肺樟，犬種细溅，綿羊附睪種，沙林鼠種儡嘶。

1. 采取標(biāo)本
   血喇聊、組織→雙相培養(yǎng)基？蹦狂。血→注入培養(yǎng)管
   血清凝集試驗(yàn)
2. 病原分離
   肝浸膏瓊脂培養(yǎng)基誓篱、商品布魯司瓊脂、布魯司肉湯凯楔、土豆浸液瓊脂窜骄、蛋白胨瓊脂
   生物分離方法，1ml注入豚鼠體內(nèi)摆屯。
   鏡檢可排除非布魯氏菌邻遏，但不能鑒定布魯氏菌！
3. 病原鑒定
   分離到純種菌株后進(jìn)行：陽性血清玻片凝集虐骑、A准验、M因子血清凝集、培養(yǎng)的CO2需要&H2S的產(chǎn)生
4. 深入鑒定
   噬菌體裂解廷没，常用Tb糊饱、Wb、Iz颠黎、Fi等噬菌體（要求參考菌株對(duì)照）
   也可單獨(dú)使用Tb噬菌體的RTD&10^4RTD裂解實(shí)驗(yàn)另锋。
   染料抑菌實(shí)驗(yàn)：紙片法&培養(yǎng)基稀釋法
   參考PCR實(shí)驗(yàn)
5. 抗體檢測(cè)
   血清試管凝集試驗(yàn)SAT（1:100++以上）滞项，須排除共同抗原微生物的交叉反應(yīng)
   虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)RBPT（一定時(shí)間內(nèi)裸目看到）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)CFT（1:10++）夭坪、抗球蛋白試驗(yàn)（1:100++）文判、免疫熒光試驗(yàn)IFT、2-巰基乙醇2-ME室梅、半胱氨酸凝集試驗(yàn)CAT律杠、ELISA
   動(dòng)物鮮乳→乳環(huán)凝集實(shí)驗(yàn)（<u>布魯氏菌乳環(huán)抗原</u>）

十三、炭疽病原（大質(zhì)粒pXO1竞惋、小質(zhì)粒pXO2、毛玻璃樣灰嫉、獅鬃樣菌落）

炭疽芽孢桿菌拆宛。有芽孢、有莢膜讼撒、產(chǎn)外毒素
毒素基因位于（大質(zhì)粒pXO1）莢膜基因（小質(zhì)粒pXO2）致病所必需浑厚，缺少使毒力減弱or消失
土壤中存活數(shù)十年

1. 采取標(biāo)本
2. 皮膚：潰瘍周圍采滲出液；腸型：采糞便根盒；肺型：痰液or咽拭子钳幅；
   血液標(biāo)本都要采
3. 牲畜：血液&臟器，特別注意‘腔道流出的血",穿刺采取-避免擴(kuò)大污染
4. 特別注意動(dòng)物地點(diǎn)土壤標(biāo)本炎滞，動(dòng)物制品-生理鹽水浸取or拭子涂抹取樣
5. 鏡檢（特別重要）
   首先涂片敢艰，革蘭&莢膜染色：大量、均一的兩端平齊G+的巨大桿菌→臨床診斷
   莢膜染色：菌體周圍明顯莢膜册赛，診斷+1
6. 病原分離
   沸水浴20mins后接種钠导。可使用普通森瘪、血瓊脂牡属、選擇性培養(yǎng)基。
   營(yíng)養(yǎng)需求低扼睬，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好逮栅。菌落灰白色、表面干燥呈“毛玻璃”樣窗宇，稍隆起措伐。
   鏡下菌落邊緣卷發(fā)樣條索紋理→“獅鬃”樣菌落
7. 病原鑒定
8. 溶血特征：血平板上不出現(xiàn)溶血環(huán)！
9. 顯微鏡檢查：G+粗大桿菌军俊、無鞭毛废士、棒狀、兩端截平蝇完，人工培育：竹節(jié)狀長(zhǎng)鏈官硝。芽孢-菌體中央矗蕊。
   莢膜：美蘭染色--淡藍(lán)色莢膜，墨汁負(fù)染色--莢膜明顯輪廓氢架。
10. 青霉素敏感試驗(yàn)&串珠試驗(yàn)：10 IU/ml青霉素溶液濾紙片傻咖、37℃8~10 h→明顯抑菌帶♂校“瓊脂片卿操、載玻片上、接種待檢菌孙援、青霉素濾紙條害淤、37℃3~4 h”→臨界處、莢膜腫脹的串珠狀菌鏈拓售。
11. 噬菌體裂解試驗(yàn)：AP631株--炭疽噬菌體我國選育窥摄，形成透明噬菌斑
12. 毒力鑒定
13. 質(zhì)粒電泳圖譜分析：分離獲得的菌株→提取質(zhì)粒→電泳分析→確定2個(gè)質(zhì)粒存在→判斷毒力完整
14. PCR擴(kuò)增：最常用手段
15. 抗體檢測(cè)
    缺乏本底抗體水平資料础淤，雙份血清滴度4倍↑崭放，才能診斷。

十四鸽凶、斑疹傷寒病原--細(xì)胞內(nèi)寄生(普氏币砂、莫氏、姬姆尼次or吉姆薩染色玻侥、Vero决摧、L929細(xì)胞、金標(biāo)IFA)

流行性（普氏立克次體--體虱）凑兰、地方性斑疹傷寒（莫氏立克次體--鼠蚤）
革蘭染色不易著色蜜徽，姬姆尼次or吉姆薩染色。多形性：圓形票摇、桿形拘鞋、啞鈴型、鏈型矢门。
無芽孢&鞭毛盆色、專性細(xì)胞內(nèi)寄生。

1. 標(biāo)本采集
   血標(biāo)本2管祟剔。

• 枸緣酸鈉抗凝→培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)隔躲、雞胚培養(yǎng)、動(dòng)物接種）
• 非抗凝--分離血清→抗體檢測(cè)（采2次）物延，血塊→PCR
  體虱宣旱、鼠蚤→懸液
  標(biāo)本-80℃or-160℃保存

2. 病原分離
   接種動(dòng)物：取血液接種2只雄豚鼠腹腔2~3 ml，39.5℃↑為特異發(fā)熱叛薯。觀察“陰囊紅腫”（流行性-浑吟、地方性+）一只豚鼠-心血or臟器→10%SPG懸液→傳代笙纤，另一只恢復(fù)期血清抗體試驗(yàn)。
   病人發(fā)熱期血液0.5 ml→接種7日齡雞胚→死亡后48~72 h卵黃囊染色鏡檢
   細(xì)胞培養(yǎng)法：Vero组力、L929細(xì)胞省容。病人抗凝血or白細(xì)胞層→接種單層細(xì)胞→觀察細(xì)胞脫落&染色鏡檢。
3. 病原鑒定
   分離的立克次體燎字，PCR鑒定
4. 快速檢測(cè)
   病人急性期血液--血凝塊→研磨腥椒、提取DNA→PCR
5. 抗體檢測(cè)
   WHO金標(biāo)方法：間接免疫熒光IFA
   血清倍比稀釋→斑疹傷寒特異抗原的載玻片孔內(nèi)→高倍鏡or油鏡觀察，熒光強(qiáng)度以陽對(duì)為標(biāo)準(zhǔn)→最高稀釋倍數(shù)為血清抗體效價(jià)候衍。
   IgG 4倍↑ 診斷笼蛛，單份IgG≥1:160現(xiàn)癥診斷。