基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系統(tǒng)是目前被廣泛運(yùn)用的基因編輯系統(tǒng)，其原理是由CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的gRNA介導(dǎo)Cas核酸酶靶向目標(biāo)序列斤斧，對(duì)序列進(jìn)行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)熬词，此系統(tǒng)是由II類CRISPR/Cas系統(tǒng)改造而來，能夠在植物讥脐、細(xì)菌因悲、酵母、魚類及哺乳動(dòng)物等多種細(xì)胞中罪帖，進(jìn)行有效的靶向編輯，具有操作簡(jiǎn)易邮屁、效率高整袁、以及作用靶位點(diǎn)多等優(yōu)勢(shì)。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA(short guide RNA)識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)基因的靶向序列佑吝，引導(dǎo)Cas9對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行剪切坐昙，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），機(jī)體自身通過非同源重組（non-homologous end joining芋忿，NHEJ）的方式修復(fù)DSB炸客，參與修復(fù)的蛋白經(jīng)常會(huì)在DNA末端插入或刪除幾個(gè)堿基，修復(fù)后的基因由于產(chǎn)生突變而導(dǎo)致功能喪失戈钢，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)的基因敲除嚷量。
技術(shù)原理與流程
基因敲除技術(shù)優(yōu)勢(shì)
Cas9X使用新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯⒓?xì)胞系的敲除效率進(jìn)行大幅的提升
1. 使用Cas9蛋白和gRNA的復(fù)合物直接進(jìn)行電轉(zhuǎn)，提高效率的同時(shí)減少非特異的切割逆趣；（目前報(bào)道脫靶率最低的方法）
2. 使用高效的電轉(zhuǎn)設(shè)備，具備更高的電轉(zhuǎn)效率和細(xì)胞存活率嗜历；
3. 使用更先進(jìn)的單克隆稀釋設(shè)備和方法宣渗，大幅提高陽性率抖所；（提高2倍）
4. 持續(xù)建庫：我們也將提供更多的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株和基因編輯細(xì)胞株產(chǎn)品供科研工作者選擇。
5. 大片段敲除痕囱，可以通過PCR快速鑒定田轧；
6. 非移碼方式敲除，可以保證細(xì)胞系做基因回補(bǔ)無需考慮突變修飾的問題鞍恢。??
通過優(yōu)化傻粘，Cas9X在細(xì)胞系基因敲除的效率是傳統(tǒng)質(zhì)粒法的數(shù)倍（3-5倍）結(jié)合ClonePlus技術(shù)，可以將效率提升10-15倍帮掉，也可以針對(duì)很多之前難以實(shí)現(xiàn)敲除的細(xì)胞株進(jìn)行基因敲除操作弦悉，而且周期比病毒法更短。最快可以5周內(nèi)拿到基因敲除的細(xì)胞蟆炊！
基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及前景
1.?建立生物模型稽莉。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要涩搓∥鄹眩基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究昧甘。這些模型可以是細(xì)胞良拼，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。最常見的是小鼠充边，家兔庸推、豬、線蟲痛黎、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報(bào)道予弧。
2. 疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療。通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響湖饱。這無論是對(duì)了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義掖蛤。
3.?提供廉價(jià)的異種移植器官。眾所周知井厌，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素蚓庭，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因?yàn)楫愒瓷锏幕驎?huì)產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子仅仆，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除器赞，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來具大的福音墓拜。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α-1港柜，3GT 基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生a1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的2個(gè)拷貝。這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子夏醉，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性爽锥，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。在缺乏這種酶的情況下畔柔，超急性排斥反應(yīng)即不會(huì)再發(fā)生氯夷。
4.?免疫學(xué)中的應(yīng)用。同異源器官移植相似靶擦，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì)有一定的免疫排斥腮考，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除玄捕，換以人的相應(yīng)基因踩蔚，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體的生產(chǎn)問題桩盲。
5.?改造生物寂纪、培育新的生物品種。細(xì)菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個(gè)重大突破赌结，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍捞蛋。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持柬姚。
發(fā)表的高分文獻(xiàn)
1. Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為38.12
Ma B, Ju A, Zhang S, et al. Albumosomes formed by cytoplasmic pre-folding albumin maintain mitochondrial homeostasis and inhibit nonalcoholic fatty liver disease[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2023, 8(1): 229.
2. Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為23.65
Wu W, Pu Y, Gao S, et al. Bacterial Metabolism-Initiated Nanocatalytic Tumor Immunotherapy[J]. Nano-Micro Letters, 2022, 14(1): 1-21.
3.Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為17.694
Bu, J., Zhang, Y., Wu, S. et al. KK-LC-1 as a therapeutic target to eliminate ALDH+ stem cells in triple negative breast cancer. Nat Commun 14, 2602 (2023).
4. Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為8.322
Li W, Ali T, Zheng C, et al. Fluoxetine regulates eEF2 activity (phosphorylation) via HDAC1 inhibitory mechanism in an LPS-induced mouse model of depression[J]. Journal of neuroinflammation, 2021, 18(1): 1-19.
5. Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為15.992
Li W, Ali T, Zheng C, et al. Anti-depressive-like behaviors of APN KO mice involve Trkb/BDNF signaling related neuroinflammatory changes[J]. Molecular Psychiatry, 2022, 27(2): 1047-1058.
6. Cas9X?基因編輯服務(wù)：影響因子為5.59
Xiao P, Chen J, Zeng Q, et al. UNC5B Overexpression Alleviates Peripheral Neuropathic Pain by Stimulating Netrin-1-Dependent Autophagic Flux in Schwann Cells[J]. Molecular Neurobiology, 2022: 1-15.
