一隘擎、測序原理
先介紹 Nanopore 測序中的幾位主角：
Reader ：在自然界中携龟，有一種可以嵌入到細(xì)胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔沃于。經(jīng)過人為基因工程修飾后俄烁，得到的就是 Nanopore 測序所需的 Reader 蛋白绸栅。
Membrane：Reader 蛋白會被嵌入到高電阻率的 Membrane （人工合成的多聚物膜），膜兩側(cè)是離子溶液猴娩，在兩側(cè)加不同的電位阴幌，離子就會在孔中流動勺阐，形成電流卷中。
Motor：在 Nanopore 文庫構(gòu)建時(shí)，需要在接頭上連接一種動力蛋白渊抽，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中蟆豫。以DNA解螺旋酶作為 Motor（動力蛋白）為例，它可以除了可以解開雙螺旋懒闷，使之變?yōu)閱捂準酰€可以提供推動力爱致。
Tether：該蛋白用于錨定DNA或RNA鏈须误，防止在溶液中飄動，并使其進(jìn)入納米孔中龄糊。
這時(shí)玩焰，解開的其中一條鏈會穿過蛋白質(zhì)孔由驹，它在通過蛋白孔時(shí)，會對膜兩邊離子的穩(wěn)定流動產(chǎn)生擾動昔园。不同的堿基蔓榄，對離子流的影響不同，也就會產(chǎn)生不同的電流大小默刚，進(jìn)而形成下面的電流信號圖甥郑。
利用這些電流信號，使用計(jì)算機(jī)軟件識別后荤西，推斷出堿基類型澜搅，完成測序伍俘。
二、測序儀介紹
雖然 Nanopore 測序儀種類很多勉躺，但都是基于Nanopore芯片來搭建的平臺养篓，大到由多個(gè)芯片陣列組成的PromehION，GridION系列測序儀赂蕴，小到可以連接手機(jī)的Type C柳弄，電腦USB的MnION系列便攜式測序儀。
這里邊概说，最著名的就是MnION系列碧注，2016年8月，美國宇航員凱特·魯賓斯在國際空間站完成微重力條件的DNA測序糖赔。
它在測序時(shí)萍丐，一般像下圖這樣連接就行，顯而易見的便攜性放典。比如逝变，可以直接用它在深入疫區(qū)采集樣本后進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，為防疫工作爭取大量寶貴的時(shí)間和資源奋构。
測序時(shí)壳影，將制備好的文庫或樣本溶液，滴在芯片小孔中弥臼，開始測序宴咧。
一張芯片中有 2048 個(gè) membrane wells，也就是芯片上的一個(gè)孔径缅，每個(gè)孔包含一個(gè)nanopore Reader掺栅。
每四個(gè) wells 共享一個(gè) Amplifier（信號放大器），一張芯片中有 512 個(gè)信號放大器纳猪，也就是 512 組 wells氧卧。
在啟動測序儀后，機(jī)器自檢氏堤，會將每組 wells 中依據(jù)效率高低排序沙绝。測序開始，儀器先用每組 wells 中效率最高的 wells丽猬，運(yùn)行 8 小時(shí)后宿饱，更換效率第二的，以此類推脚祟。
但是谬以，在實(shí)際使用過程中，只有 1200 個(gè) wells可以正常工作由桌。
造成 wells 失效的原因：
wells 中沒有 Reader 蛋白为黎，或納米孔不通邮丰，這時(shí)無電信號
膜破損，這時(shí)有強(qiáng)電信號铭乾，不能正常測序
在單個(gè) well 中有兩個(gè)及以上的 Reader 蛋白剪廉，電信號互相干擾
三、建庫方法
1炕檩、1D 文庫
1D文庫是將DNA雙鏈斗蒋，解鏈為正義鏈與反義鏈，分別測序笛质，大約有 85% 的堿基判讀準(zhǔn)確率泉沾。
目前1D文庫有兩種建庫方案：
標(biāo)準(zhǔn)建庫
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將 DNA 打斷
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補(bǔ)齊DNA末端，末端加 A 堿基
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連接 Adapter（ 接頭序列）妇押，接頭上連有 Motor 蛋白
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接頭中有一段序列可以與 Tether 蛋白結(jié)合跷究，作用是為了將 DNA 鏈吸附在膜上，將 DNA 錨定敲霍，不易被溶液洗走
mark下圖是 Tether 與接頭序列識別及錨定過程
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轉(zhuǎn)座酶建庫
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建庫時(shí)使用連有測序接頭的轉(zhuǎn)座酶俊马，該酶可以將長鏈 DNA 鏈切斷
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由于該酶的特性，會在DNA的斷點(diǎn)兩端加接頭序列
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隨后在測序接頭加入 Motor 蛋白
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2肩杈、? 文庫
在 DNA 兩側(cè)接 ? 接頭柴我，其他步驟和 1D 文庫類似。
這種文庫中的? 接頭锋恬，可以讓第二鏈緊跟第一鏈來一起測序屯换。
由于可以測到兩條鏈，可以相互矯正与学，進(jìn)而提高判讀準(zhǔn)確率，能達(dá)到 90%以上的堿基判讀準(zhǔn)確率嘉抓。
但是索守，由于文庫質(zhì)量，蛋白活性等因素抑片，導(dǎo)致并不是所有的第一鏈后都會測到第二鏈卵佛。
四、堿基判讀
在測序過程中敞斋，得到的信號并不是每次測得一個(gè)堿基信號截汪。而是根據(jù) Reader 蛋白孔的縱向長度，R9 大約為 5 個(gè)堿基長植捎，也就是說衙解，同時(shí)會測得 5 個(gè)堿基的電信號，這并不是一項(xiàng)簡單的判斷過程焰枢。
目前蚓峦，Nanopore 公司采用一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法舌剂，遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RNN），對堿基進(jìn)行判讀暑椰。
該過程簡單來說霍转，是將已知堿基序列的電信號波形圖做訓(xùn)練集和測試集，通過修正參數(shù)一汽，拿到模型避消。最后，將新測到的未知序列的波形圖與之比對召夹，從而提高判讀準(zhǔn)確率沾谓。
但是，還是有誤讀情況：
由于空間結(jié)構(gòu)相似性戳鹅，嘌呤間誤讀均驶，嘧啶間誤讀更容易發(fā)生。
堿基復(fù)雜度低的序列（如枫虏，polyA序列）妇穴，更容易誤讀
五、測序影響因素
電壓
以R9芯片為例隶债，測序過程腾它，先用 180 mV 電壓，每 10 min死讹，短時(shí)間翻轉(zhuǎn)電壓方向瞒滴，作用是激活被堵住或卡住的 Reader 蛋白孔。但是赞警，這個(gè)過程也會使正常測序的 DAN鏈倒吐回去妓忍。
隨著電極使用時(shí)間的增加，電極的電壓會發(fā)生漂移愧旦，因此每過兩小時(shí)世剖，要增加 5mV 電壓抵消影響。
速度與產(chǎn)量
R9 芯片笤虫，測序速度是 250 堿基/s旁瘫，一張芯片可以得到約 5 ~ 10 G的堿基序列。
六琼蚯、芯片版本號
Nanopore 公司每一種新Reader蛋白酬凳，Motor，Membrane遭庶，就會有一個(gè)新的芯片版本號宁仔，一般命名規(guī)則如下：
Reader：R8，R9罚拟，R10台诗，等
Motor：E6完箩，E7，E8拉队，等
Membrane：M9弊知，M10，等
比如粱快，R9 指的是大腸桿菌的 CsgG 蛋白質(zhì)改造的 Reader 蛋白秩彤。
總結(jié)
Nanopore 測序是基于電學(xué)的檢測，區(qū)別與 Illumina 和 PacBio 的光學(xué)
測序儀器便攜事哭，可用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地區(qū)漫雷，如疫區(qū)，農(nóng)場等
讀長較長鳍咱，大約 300,000 ~ 400,000 個(gè)堿基降盹，可用于從頭組裝基因組，可變剪切等
可以對DNA 谤辜，RNA蓄坏，甚至蛋白質(zhì)序列進(jìn)行測序
堿基判讀準(zhǔn)確率較高，R10納米孔數(shù)據(jù)質(zhì)量值超過Q40（即錯(cuò)誤識別的概率是0.01%丑念，即錯(cuò)誤率0.01%）涡戳，一致性（Identity）質(zhì)量值達(dá)Q50 (99.999%的堿基準(zhǔn)確率)。
參考：
https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI
https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s
