摘要：從1977年第一代DNA測序技術(shù)（Sanger法）[1] 發(fā)展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展涂臣，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短售担，再從短到長肉康。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時間中快速發(fā)展著灼舍。測序技術(shù)的每一次變革吼和，也都對基因組研究，疾病醫(yī)療研究骑素，藥物研發(fā)炫乓，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動作用刚夺。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個簡單的小結(jié)。
生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義末捣。以上圖1（右鍵打開圖片可查看大圖侠姑，下同）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個測序技術(shù)的發(fā)展歷程箩做。
第一代測序技術(shù)
第一代DNA測序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）. 并在1977年莽红，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的邦邦，全長5375個堿基[1]安吁。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力燃辖，并以此為開端步入基因組學(xué)時代鬼店。研究人員在Sanger法的多年實踐之中不斷對其進(jìn)行改進(jìn)。在2001年黔龟，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)妇智，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵氏身，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)巍棱，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列（圖2）蛋欣。這個網(wǎng)址為sanger測序法制作了一個小短片拉盾，形象而生動。
值得注意的是豁状，就在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)倒得，如焦磷酸測序法泻红、鏈接酶法等。其中霞掺，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法2–4谊路，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術(shù)使用的測序方法2,4，但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA合成反應(yīng)的dNTP菩彬。
第二代測序技術(shù)
總的說來缠劝，第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%骗灶，但其測序成本高惨恭，通量低等方面的缺點，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用耙旦。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法脱羡。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa锉罐，Hiseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了帆竹。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度脓规，并且保持了高準(zhǔn)確性栽连，以前完成一個人類基因組的測序需要3年時間，而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要1周侨舆，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多秒紧。表1和圖3對第一代和第二代測序技術(shù)各自的特點以及測序成本作了一個簡單的比較5，以下我將對這三種主要的第二代測序技術(shù)的主要原理和特點作一個簡單的介紹态罪。
Illumine
Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器噩茄，這兩個系列的技術(shù)核心原理是相同的2,4。這兩個系列的機(jī)器采用的都是邊合成邊測序的方法复颈，它的測序過程主要分為以下4步绩聘，如圖4.
? （1）DNA待測文庫構(gòu)建
利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外耗啦，主要是打斷成200-500bp長的序列片段凿菩，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNA文庫帜讲。
? （2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道衅谷，當(dāng)文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上似将。每個Flowcell有8個channel获黔，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因）在验，并能支持DNA在其表面進(jìn)行橋式PCR的擴(kuò)增玷氏。
? （3）橋式PCR擴(kuò)增與變性
橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增腋舌，如圖4.a所示盏触。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束块饺，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝赞辩，進(jìn)行這一過程的目的在于實現(xiàn)將堿基的信號強(qiáng)度放大，以達(dá)到測序所需的信號要求授艰。
（4）測序
測序方法采用邊合成邊測序的方法辨嗽。向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測序法）淮腾。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)召庞，因而每次只能添加一個dNTP岛心。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉篮灼。接著忘古，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號诅诱，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄髓堪，最后利用計算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后娘荡，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)干旁，以便能進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題炮沐，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換争群，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例大年，30x測序深度大約為1周换薄。
Roche 454
Roche 454測序系統(tǒng)是第一個商業(yè)化運營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5 abc）2：
（1）DNA文庫制備
454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同翔试，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段轻要，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增垦缅，連接載體冲泥，構(gòu)建單鏈DNA文庫（圖5a）。
（2）Emulsion PCR （乳液PCR壁涎，其實是一個注水到油的獨特過程）
454當(dāng)然DNA擴(kuò)增過程也和illumina的截然不同凡恍，它將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育怔球、退火嚼酝。
乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進(jìn)行DNA擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油）庞溜，基本過程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面碑定，水溶液瞬間形成無數(shù)個被礦物油包裹的小水滴流码。這些小水滴就構(gòu)成了獨立的PCR反應(yīng)空間。理想狀態(tài)下延刘，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠漫试。
這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結(jié)合在磁珠上碘赖。同時孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑驾荣，所以保證了每個與磁珠結(jié)合的小片段都能獨立進(jìn)行PCR擴(kuò)增外构，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后播掷，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來审编。進(jìn)過擴(kuò)增，每個小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍歧匈，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA量垒酬。
（3）焦磷酸測序
測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上件炉。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔勘究，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置斟冕，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程口糕。
測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中磕蛇，啟動測序反應(yīng)景描。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)孤里。如果dNTP能與待測序列配對伏伯，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP捌袜。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光说搅，同時由PTP板另一側(cè)的CCD照相機(jī)記錄，最后通過計算機(jī)進(jìn)行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果虏等。由于每一種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同弄唧，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后霍衫，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP候引，從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進(jìn)入下一個循環(huán)敦跌。由于454測序技術(shù)中澄干，每個測序反應(yīng)都在PTP板上獨立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差柠傍。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀長麸俘，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp，并且454技術(shù)和illumina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同惧笛，它最主要的一個缺點是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度从媚，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應(yīng)會一次加入多個T患整，而所加入的T的個數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測獲得拜效，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確喷众。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤紧憾。
Solid技術(shù)
Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)用的儀器到千。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4稻励。它的原理是：
（1）DNA文庫構(gòu)建
片段打斷并在片段兩端加上測序接頭父阻，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫望抽。
（2）Emulsion PCR
Solid的PCR過程也和454的方法類似加矛，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多煤篙，只有1um斟览。在擴(kuò)增的同時對擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備辑奈。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上苛茂。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個鸠窗、4個或8個測序區(qū)域（圖6-a）妓羊。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量稍计。
（3）連接酶測序
這一步是Solid測序的獨特之處躁绸。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶臣嚣。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物净刮，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應(yīng)中硅则，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對淹父。探針的5’末端分別標(biāo)記了CY5、Texas Red怎虫、CY3暑认、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中大审，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的蘸际，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨特測序法饥努，兩個堿基確定一個熒光信號捡鱼，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基八回。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法酷愧。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時驾诈，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號溶浴，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1乍迄，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后士败，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割闯两，這樣就能移除熒光信號，以便進(jìn)行下一個位置的測序谅将。不過值得注意的是漾狼，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位饥臂。即第一次是第1逊躁、2位，第二次是第6隅熙、7位……在測到末尾后稽煤，要將新合成的鏈變性，洗脫囚戚。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測序酵熙。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a. 8）驰坊。也即是匾二，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0庐橙、1位和第5假勿、6位……第二輪測序完成，依此類推态鳖，直至第五輪測序转培，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次浆竭。該技術(shù)的讀長在2×50bp浸须，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測邦泄，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%删窒，而15x覆蓋率時的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%，應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了顺囊。但在熒光解碼階段肌索，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發(fā)生錯誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯誤特碳。
第三代測序技術(shù)
測序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑诚亚。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術(shù)晕换，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比站宗，他們最大的特點就是單分子測序闸准，測序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
其中PacBio SMRT技術(shù)其實也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想5梢灭，并以SMRT芯片為測序載體夷家。基本原理是： DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型敏释。同時這個 DNA 聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響库快。PacBio SMRT技術(shù)的一個關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔钥顽。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來缺谴，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍耳鸯，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護(hù)作用湿蛔。同理,在一個反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實時反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū),能量被限制在一個小范圍(體積20X 10-21 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應(yīng)區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現(xiàn)將背景降到最低。另外县爬，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間阳啥，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾财喳，則通過聚合酶時的速度會減慢察迟，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息（圖7）耳高。SMRT技術(shù)的測序速度很快扎瓶，每秒約10個dNTP。但是泌枪，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通哺藕伞），達(dá)到15%,但好在它的出錯是隨機(jī)的碌燕，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯誤的偏向误证，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯。
Oxford Nanopore Technologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同修壕，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)5愈捅。該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計了一種特殊的納米孔慈鸠，孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭蓝谨。當(dāng)DNA堿基通過納米孔時，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的）譬巫，靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）稽亏。
該公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(AGBT)上推出第一款商業(yè)化的納米孔測序儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注缕题。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序平臺的不足，納米孔測序的主要特點是：讀長很長胖腾，大約在幾十kb烟零，甚至100 kb;錯誤率目前介于1%至4%，且是隨機(jī)錯誤咸作，而不是聚集在讀取的兩端;數(shù)據(jù)可實時讀取;通量很高(30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成);起始DNA在測序過程中不被破壞;以及樣品制備簡單又便宜锨阿。理論上，它也能直接測序RNA记罚。
納米孔單分子測序計算還有另一大特點墅诡，它能夠直接讀取出甲基化的胞嘧啶，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對基因組進(jìn)行bisulfite處理桐智。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)現(xiàn)象有極大的幫助末早。并且改方法的測序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%，而且一旦發(fā)現(xiàn)測序錯誤也能較容易地進(jìn)行糾正说庭。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報道然磷。
其他測序技術(shù)
目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)——Ion Torrent6。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片刊驴， 一個小孔就是一個測序反應(yīng)池姿搜。當(dāng)DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子捆憎，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變舅柜，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號躲惰，從而讀出DNA序列（圖9）致份。這一技術(shù)的發(fā)明人同時也是454測序技術(shù)的發(fā)明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像础拨，甚至可以說就是454的翻版知举，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息太伊。Ion Torrent相比于其他測序技術(shù)來說雇锡，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此僚焦，成本相對來說會低锰提，體積也會比較小，同時操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速立肘，除了2天文庫制作時間边坤，整個上機(jī)測序可在2-3.5小時內(nèi)完成，不過整個芯片的通量并不高谅年，目前是10G左右茧痒，但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。
小結(jié)
以上融蹂，對各代測序技術(shù)的原理做了簡要的闡述旺订，這三代測序技術(shù)的特點比較匯總在以下表1和表2中。其中測序成本超燃，讀長和通量是評估該測序技術(shù)先進(jìn)與否的三個重要指標(biāo)区拳。第一代和第二代測序技術(shù)除了通量和成本上的差異之外，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想意乓。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點是成本較之一代大大下降樱调，通量大大提升，但缺點是所引入PCR過程會在一定程度上增加測序的錯誤率届良，并且具有系統(tǒng)偏向性笆凌，同時讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點而開發(fā)的士葫，它的根本特點是單分子測序菩颖，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯誤为障，同時提高讀長晦闰，并要保持二代技術(shù)的高通量，低成本的優(yōu)點鳍怨。
表1：測序技術(shù)的比較
| 第****X****代 | 公司 | 平臺名稱 | 測序方法 | 檢測方法 | 大約讀長****(****堿基數(shù)****) | 優(yōu)點 | 相對局限性 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 第一代 | ABI/生命技術(shù)公司 | 3130xL-3730xL | 桑格-毛細(xì)管電泳測序法 | 熒光/光學(xué) | 600-1000 | 高讀長呻右，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列 | 通量低鞋喇；樣品制備成本高声滥，使之難以做大量的平行測序 |
| 第一代 | 貝克曼 | GeXP遺傳分析系統(tǒng) | 桑格-毛細(xì)管電泳測序法 | 熒光/光學(xué) | 600-1000 | 高讀長，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高侦香，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列落塑；易小型化 | 通量低；單個樣品的制備成本相對較高 |
| 第二代 | Roche/454 | 基因組測序儀FLX系統(tǒng) | 焦磷酸測序法 | 光學(xué) | 230-400 | 在第二代中最高讀長罐韩；比第一代的測序通量大 | 樣品制備較難憾赁；難于處理重復(fù)和同種堿基多聚區(qū)域；試劑沖洗帶來錯誤累積散吵；儀器昂貴 |
| 第二代 | Illumina | HiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq | 可逆鏈終止物和合成測序法 | 熒光/光學(xué) | 2x150 | 很高測序通量 | 儀器昂貴龙考；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費用很高 |
| 第二代 | ABI/Solid | 5500xlSolid系統(tǒng) | 連接測序法 | 熒光/光學(xué) | 25-35 | 很高測序通量蟆肆；在廣為接受的幾種第二代平臺中，所要拼接出人類基因組的試劑成本最低 | 測序運行時間長晦款；讀長短炎功，造成成本高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難缓溅；儀器昂貴 |
| 第二代 | 赫利克斯 | Heliscope | 單分子合成測序法 | 熒光/光學(xué) | 25-30 | 高通量蛇损；在第二代中屬于單分子性質(zhì)的測序技術(shù) | 讀長短，推高了測序成本坛怪，降低了基因組拼接的質(zhì)量淤齐；儀器非常昂貴 |
| 第三代 | 太平洋生物科學(xué)公司 | PacBio RS | 實時單分子DNA測序 | 熒光/光學(xué) | ~1000 | 高平均讀長，比第一代的測序時間降低酝陈；不需要擴(kuò)增；最長單個讀長接近3000堿基 | 并不能高效地將DNA聚合酶加到測序陣列中毁涉；準(zhǔn)確性一次性達(dá)標(biāo)的機(jī)會低（81-83%）沉帮；DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個堿基測序成本高（儀器昂貴）贫堰； |
| 第三代 | 全基因組學(xué)公司 | GeXP遺傳分析系統(tǒng) | 復(fù)合探針錨雜交和連接技術(shù) | 熒光/光學(xué) | 10 | 在第三代中通量最高穆壕；在所有測序技術(shù)中，用于拼接一個人基因組的試劑成本最低其屏；每個測序步驟獨立喇勋，使錯誤的累積變得最低 | 低讀長； 模板制備妨礙長重復(fù)序列區(qū)域測序偎行；樣品制備費事川背；尚無商業(yè)化供應(yīng)的儀器 |
| 第三代 | Ion Torrent/生命技術(shù)公司 | 個人基因組測序儀（PGM） | 合成測序法 | 以離子敏感場效應(yīng)晶體管檢測pH值變化 | 100-200 | 對核酸堿基的摻入可直接測定；在自然條件下進(jìn)行DNA合成（不需要使用修飾過的堿基） | 一步步的洗脫過程可導(dǎo)致錯誤累積蛤袒；閱讀高重復(fù)和同種多聚序列時有潛在困難熄云； |
| 第三代 | 牛津納米孔公司 | gridION | 納米孔外切酶測序 | 電流 | 尚未定量 | 有潛力達(dá)到高讀長；可以成本生產(chǎn)納米孔妙真；無需熒光標(biāo)記或光學(xué)手段 | 切斷的核苷酸可能被讀錯方向缴允；難于生產(chǎn)出帶多重平行孔的裝置 |
表2：主流測序機(jī)器的成本測序比較
以下圖10展示了當(dāng)前全球測序儀的分布情況。圖中的幾個熱點區(qū)主要分布在中國的深圳（主要是華大）珍德，南歐练般，西歐和美國。
參考文獻(xiàn)
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Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nature reviews. Genetics 11, 31–46 (2010).
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原文鏈接：http://www.huangshujia.me/2013/08/02/2013-08-02-An-Introduction-of-NGS-Sequence.html
