細胞克隆實驗
當(dāng)單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體豌注，成為集落或克隆伤塌。每個克隆含有50以上的細胞，大小在0.3-1.0mm之間幌羞。集落形成率表示細胞的獨立生存能力【刮龋克隆形成率反映細胞兩個重要性狀：細胞群體依賴性属桦、增殖能力。由于細胞生物學(xué)性狀不同他爸，細胞克隆形成率差別也很大：
a）.初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱聂宾，傳代細胞系強；
b）.二倍體細胞克隆形成率弱诊笤，轉(zhuǎn)化細胞系強系谐；
c）.正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強讨跟。
實驗方法
1.平板集落形成實驗：本法適用于貼壁生長的細胞和正常培養(yǎng)的細胞纪他。
注：適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿晾匠。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度茶袒。細胞一定要分散得好，不能有細胞團凉馆，接種密度不能過大薪寓。
2.軟瓊脂集落形成實驗：本法適用于非錨著依賴性生長的細胞，如骨髓造血干細胞澜共、腫瘤細胞株向叉、轉(zhuǎn)化細胞系。
注：正常細胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖嗦董，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗母谎。
實驗步驟
一、平板克隆形成實驗基本步驟：
1.取對數(shù)生長期的各組細胞京革，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞销睁，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用。
2.將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋存崖，每組細胞分別以每皿50冻记、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中来惧，并輕輕轉(zhuǎn)動冗栗，使細胞分散均勻。置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
3.經(jīng)常觀察隅居，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時钠至，終止培養(yǎng)。棄去上清液胎源，用PBS小心浸洗2次棉钧。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液涕蚤，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10～30分鐘宪卿，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥万栅。
4.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片佑钾，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)烦粒。最后計算克隆形成率休溶。
克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%
二、軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成試驗基本步驟：
1.取對數(shù)生長期細胞扰她，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打兽掰，使之成為單細胞，作活細胞計數(shù)徒役，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106細胞/L禾进。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。
2.用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液廉涕，高壓滅菌后泻云，維持在40℃中不會凝固。
3.按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后狐蜕，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)宠纯，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用层释。
4.按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后婆瓜，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻贡羔，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中廉白，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后乖寒，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養(yǎng)10～14天猴蹂。
5.把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)楣嘁。計算形成率磅轻。 軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系珍逸。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃聋溜。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個谆膳，一般6cm的平皿接種1000個細胞。
注意事項
1.接種時細胞密度適度撮躁，不可過高漱病。
2.軟瓊脂與細胞混合時溫度不能超過40℃，否則將會燙傷/死細胞把曼；
3.瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定杨帽，若反復(fù)加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性祝迂，且硬度下降睦尽。因此高壓滅菌后應(yīng)進行分裝器净；
4.細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度型雳，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會受到很大影響；
5.細胞在低密度山害、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng)纠俭，生存率明顯下降，永生細胞系/株克隆形成率可達到10%以上浪慌，但初代培養(yǎng)細胞和有限傳代細胞系克隆形成率僅為0.5%-5%冤荆，甚至無法形成單個克隆。因此权纤，為了提高克隆形成率钓简，有時需要在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)汹想。
6.細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)外邓，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。做克隆形成率測定時古掏，接種細胞一定要分散成單細胞懸液损话，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周槽唾，隨時檢查丧枪，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。
