Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data

1侵蒙、發(fā)表時(shí)間：2016年4月
2肾胯、期刊：Nature biotechnology
3卖擅、代碼鏈接：https://github.com/dpeerlab/wishbone/blob/master/notebooks/Wishbone_for_single_cell_RNAseq.ipynb
4凌受、用途：推斷細(xì)胞分化關(guān)系调塌、輔助鑒別細(xì)胞類型
5融击、正文：

摘要：最近的單細(xì)胞分析技術(shù)為闡明細(xì)胞分化路徑提供了前所未有的機(jī)會(huì)。在這里颓鲜，我們介紹了Wishbone，這是一種用于沿高分辨率的分叉發(fā)展軌跡定位單細(xì)胞的算法典予。Wishbone使用多維單細(xì)胞數(shù)據(jù)甜滨，例如mass cytometry（大規(guī)模流式細(xì)胞儀）或RNA-Seq數(shù)據(jù)作為輸入，并根據(jù)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程對(duì)其進(jìn)行排序瘤袖，并通過將每個(gè)細(xì)胞標(biāo)記為分叉前或分叉后的兩個(gè)細(xì)胞命運(yùn)之一來確定分叉點(diǎn)衣摩。使用30通道的mass cytometry數(shù)據(jù)，我們顯示了Wishbone準(zhǔn)確地恢復(fù)了小鼠胸腺T細(xì)胞發(fā)育的已知階段捂敌，包括分叉點(diǎn)艾扮。我們還將該算法應(yīng)用于小鼠骨髓分化既琴，并證明了其對(duì)其他譜系的推廣。Wishbone與diffusion maps泡嘴，SCUBA和Monocle的比較表明甫恩，它在排序細(xì)胞和識(shí)別分支點(diǎn)方面均優(yōu)于這些方法。

1酌予、引言
多細(xì)胞生物是從經(jīng)歷了許多增殖和分化階段的單細(xì)胞發(fā)育而來的磺箕，從而導(dǎo)致了各種各樣的祖細(xì)胞和終末細(xì)胞類型。盡管這些過程中的許多關(guān)鍵階段和細(xì)胞群已使用熒光激活的細(xì)胞分選和遺傳擾動(dòng)進(jìn)行了表征抛虫，但許多發(fā)展仍是未知的松靡。新興的高通量技術(shù)，例如單細(xì)胞RNA-Seq和mass cytometry莱褒，可以在單細(xì)胞中同時(shí)測量大量參數(shù)击困，并在不干擾的情況下對(duì)整個(gè)組織進(jìn)行檢查。由于許多組織通過連續(xù)和異步發(fā)育維持體內(nèi)平衡广凸，這提供了以高分辨率在幾乎所有成熟階段測量細(xì)胞的機(jī)會(huì)阅茶。面臨的挑戰(zhàn)是設(shè)計(jì)一種能夠根據(jù)細(xì)胞的成熟度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序并確定產(chǎn)生功能不同細(xì)胞的完整Complement的分支點(diǎn)的算法。
最近谅海，一些報(bào)告已經(jīng)證明了根據(jù)單細(xì)胞的成熟度對(duì)其排序的方法[3,4]脸哀。但是，這些方法采用的是非分支軌跡扭吁，因此很難模擬多個(gè)細(xì)胞命運(yùn)撞蜂。構(gòu)建分支軌跡的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是根據(jù)細(xì)胞的發(fā)育成熟度對(duì)其排序，確定分支點(diǎn)以及將細(xì)胞與其各自的分支相關(guān)聯(lián)侥袜。諸如SCUBA[5]之類的方法可以識(shí)別數(shù)據(jù)中的分支以及單元的偽時(shí)間順序蝌诡，但是在時(shí)間分辨率和準(zhǔn)確性上卻有相當(dāng)大的損失。
在這里枫吧，我們介紹了分支系統(tǒng)的軌跡檢測算法Wishbone浦旱。 我們使用大規(guī)模流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)來測量小鼠胸腺中T細(xì)胞的發(fā)育，其中淋巴樣祖細(xì)胞分化為CD8 +細(xì)胞毒性或CD4 +輔助T細(xì)胞九杂，以證明Wishbone的準(zhǔn)確性和魯棒性颁湖。Wishbone 以高精度和發(fā)育分辨率恢復(fù)了T細(xì)胞發(fā)育的已知階段。我們沿統(tǒng)一的分支軌跡從單細(xì)胞快照中排序雙陰性（DN）1-4例隆，雙陽性（DP）甥捺，CD4 +和CD8 +細(xì)胞。結(jié)果表明镀层，與競爭方法相比镰禾，Wishbone以更高的準(zhǔn)確性和分辨率恢復(fù)了T細(xì)胞發(fā)展的已知階段，產(chǎn)生的軌跡和分支符合目前流行的T細(xì)胞分化模型和完整的細(xì)胞類型。
我們認(rèn)為吴侦，標(biāo)志物表達(dá)的異質(zhì)性在很大程度上是由于發(fā)育成熟過程中的重編程而不是表達(dá)的隨機(jī)性谷饿。此外，我們將Wishbone應(yīng)用于大規(guī)模流式細(xì)胞儀[2]妈倔，產(chǎn)生的早期和晚期人類骨髓分化數(shù)據(jù)，以及使用單細(xì)胞RNA-Seq [6] 生成的小鼠骨髓分化數(shù)據(jù)绸贡。Wishbone成功地確定了從頭開始的骨髓發(fā)育中的成熟和分支點(diǎn)盯蝴，證明了其廣泛適用于多種單細(xì)胞技術(shù)的分支軌跡的系統(tǒng)。

2听怕、結(jié)果
2.1 學(xué)習(xí)分支的分化軌跡

圖1a捧挺，Wishbone的目標(biāo)是沿著分叉的發(fā)展軌跡實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高分辨率排序和分支。 數(shù)據(jù)表示為k最近鄰圖尿瞭，其中每個(gè)細(xì)胞是一個(gè)node闽烙，edge將每個(gè)單元與其最表型相似的細(xì)胞相連。

圖1b招狸，wishbone使用一組稱為“waybone”的細(xì)胞來指導(dǎo)細(xì)胞的排序敬拓。初始順序是使用距輸入早期細(xì)胞（左上圖）的最短路徑距離得出的。 waypoints的距離與初始順序?qū)R裙戏，以得出waypoints的視點(diǎn)乘凸，并且將精確的軌跡確定為這些視點(diǎn)的加權(quán)平均值（右下圖）。等高線表明與相應(yīng)waypoint點(diǎn)具有相似距離的細(xì)胞帶累榜。

圖1C量瓜，waypoint也用于分支點(diǎn)識(shí)別和分支關(guān)聯(lián)。如果i和t在相同的軌跡上（左）途乃，則從早期細(xì)胞到最短路徑的路徑點(diǎn)t與經(jīng)過另一個(gè)路徑點(diǎn)i的路徑之間的差約為≈0绍傲；如果它們?cè)诓煌姆种希ㄖ袌D），則差? 0耍共。這些分歧會(huì)在存在真實(shí)分支的情況下累積烫饼，以創(chuàng)建相互分歧矩陣Q：觀察到兩組waypoint在同一組內(nèi)一致而各組之間不一致（右）。

圖1d，Q矩陣的第二個(gè)特征向量總結(jié)了干線上的waypoint ≈ 0当窗，一個(gè)支路上的waypoint大于0够坐，另一個(gè)支路上的waypoint小于0。分支點(diǎn)和分支關(guān)聯(lián)用于進(jìn)一步細(xì)化軌跡崖面。所得到的軌跡和分支被用來研究沿分化的標(biāo)記動(dòng)力學(xué)元咙。

2.2 小鼠胸腺流式數(shù)據(jù)集分析

圖2a庭惜，小鼠胸腺中T細(xì)胞發(fā)育的特征是DN細(xì)胞在不同階段發(fā)展為兩個(gè)SP群體。

在小鼠胸腺的T細(xì)胞發(fā)育過程中赃磨，CD4 +輔助性T細(xì)胞和CD8 +細(xì)胞毒性T細(xì)胞從淋巴樣祖細(xì)胞分叉（圖2a）[8,9]立由。我們將Wishbone應(yīng)用于小鼠胸腺的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)轧钓，并根據(jù)其在T細(xì)胞發(fā)育中的廣泛功能選擇了表面標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄因子（補(bǔ)充表1）。我們從Black6小鼠收集了五個(gè)獨(dú)立的胸腺的數(shù)據(jù)锐膜。每個(gè)樣品平均收集了23萬個(gè)細(xì)胞毕箍。

圖2b，DN標(biāo)記CD44和CD25以及譜系標(biāo)記CD4枣耀，CD8和CD3的標(biāo)記趨勢與T細(xì)胞分化的已知階段一致霉晕。 首先將細(xì)胞沿Wishbone軌跡進(jìn)行分叉庭再，并為每個(gè)叉計(jì)算加權(quán)平均值以確定標(biāo)記跡線。分叉后牺堰，在兩個(gè)SP群體中具有不同表達(dá)模式的標(biāo)記在虛線中顯示為CD4譜系拄轻，在虛線中顯示為CD8譜系。

圖2c，Bcl11b依啰，Runx1和Notch1并未用于學(xué)習(xí)乎串，但這些標(biāo)記的動(dòng)態(tài)與它們?cè)谔囟òl(fā)育階段的作用一致。

為了進(jìn)一步測試Wishbone的準(zhǔn)確性速警，我們?cè)u(píng)估了學(xué)習(xí)軌跡時(shí)未使用的標(biāo)記的表達(dá)趨勢：轉(zhuǎn)錄因子Runx1和Bcl11b叹誉，以及信號(hào)分子Notch1（圖2c）。 所有這些標(biāo)記的豐度與其在T細(xì)胞發(fā)育的DN階段中的已知作用和時(shí)機(jī)一致（補(bǔ)充注釋1）闷旧。

圖2d，沿軌跡的標(biāo)記差異很小蕉斜，進(jìn)一步突出了Wishbone結(jié)果的穩(wěn)健性宅此。

圖2e颗搂，衍生圖顯示連續(xù)分叉中marker表達(dá)的變化（注意這里的顏色及其對(duì)應(yīng)的數(shù)值是變化率而不是表達(dá)量）峭火，用于沿軌跡跟蹤關(guān)鍵事件的時(shí)間：（1）CD8 + CD4-在DN向DP過渡的中間單陽性階段，（2）CD4和CD8上調(diào)建立 DP細(xì)胞纺且，（3）DP期間譜系標(biāo)記物的穩(wěn)定表達(dá)载碌，（4）在陽性選擇期間CD4和CD8均下調(diào)嫁艇，同時(shí)伴隨CD3，TCRβ论皆，CD5猾漫，CD69和CD27的協(xié)同上調(diào)悯周，（5）CD8特異性下調(diào)、CD4的上調(diào)指示中間的胸腺細(xì)胞屠橄，（6）對(duì)兩個(gè)SP群體的血統(tǒng)承諾锐墙，最后（7）成功完成由CD69的下調(diào)和CD62L的上調(diào)確定的陰性選擇，表明成功成熟姐仅。 對(duì)于兩個(gè)SP分支中具有不同表達(dá)模式的標(biāo)記刻盐，顯示了表達(dá)最高的分支敦锌。

2.3 Wishbone結(jié)果在所有重復(fù)試驗(yàn)中保持一致，并且對(duì)參數(shù)選擇具有魯棒性

圖3a丈积，比較三個(gè)獨(dú)立重復(fù)的胸腺中CD44，CD25铛纬，CD117告唆，CD3晶密，CD4和CD8的動(dòng)力學(xué)的圖。 交叉相關(guān)被用來對(duì)齊重復(fù)中每個(gè)標(biāo)記的表達(dá)動(dòng)態(tài)懂牧。

我們研究了軌跡和分支對(duì)各種自由參數(shù)的敏感性：用于圖構(gòu)建的鄰居數(shù)k僧凤，waypoint數(shù)nW，來自細(xì)胞的waypoint點(diǎn)采樣以及使用的擴(kuò)散分量數(shù)躯保。細(xì)胞及其分支點(diǎn)的排序?qū)τ诳缰貜?fù)的這些不同參數(shù)選擇非常魯棒性（補(bǔ)充圖5和6，以及補(bǔ)充說明2）咏连。Wishbone的結(jié)果在很大程度上排除了用于學(xué)習(xí)的單個(gè)標(biāo)記（補(bǔ)充圖7）祟滴。 此外歌溉，無論是否使用DN或SP種群的細(xì)胞作為輸入早期細(xì)胞草慧，由wishbone鑒定的分支都保持一致（補(bǔ)充圖8）匙头。

2.4 獨(dú)立細(xì)胞類型內(nèi)標(biāo)志物水平的成熟度控制

圖3b舔示，用于識(shí)別CD4 +和CD8 + SP種群的門控方案，以比較門控種群的差異與沿分化軌跡的差異。

我們?cè)诮?jīng)典的細(xì)胞表面標(biāo)志物中觀察到相當(dāng)多的異質(zhì)性公给。我們假設(shè)這種變化的至少一部分可能是發(fā)育成熟的結(jié)果淌铐，其中來自不同發(fā)育階段的細(xì)胞被匯集到一個(gè)單獨(dú)的門控種群中匣沼。使用Wishbone軌跡的精細(xì)時(shí)間分辨率释涛，我們將以細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程為條件的標(biāo)記差異與在門控細(xì)胞群中觀察到的差異進(jìn)行了比較。為了進(jìn)行比較窖认，我們首先使用標(biāo)準(zhǔn)門控方案在兩個(gè)譜系標(biāo)記：CD4和CD8的表達(dá)上鑒定了兩個(gè)SP細(xì)胞群（圖3b）燕偶。 接下來酝惧，我們將這些門控群的方差與相應(yīng)標(biāo)記的方差進(jìn)行了比較盗似，其條件取決于wishbone軌跡萌踱。 在兩個(gè)SP種群中，沿軌跡的成熟度受到控制時(shí)届谈，Wishebone譜系標(biāo)記CD4和CD8以及共受體CD3的變異比門控種群的種群變異要低得多（補(bǔ)充圖9a）艰山。

圖9-補(bǔ)充a，（A）上圖顯示了CD3纵装，CD4和CD8沿T細(xì)胞分化軌跡的標(biāo)記趨勢。 通過門控識(shí)別CD4和CD8 SP種群（圖4A）挽唉，并比較門控種群內(nèi)的標(biāo)記變異沿軌跡的變異。 左下方的面板顯示了CD4分支的此比較。 實(shí)線顯示了沿著軌跡的方差茬暇，而虛線顯示了總體方差。 右下方的面板顯示了CD8分支的相應(yīng)結(jié)果。

圖3c路召，從學(xué)習(xí)中排除CD3之后的wishbone結(jié)果贾铝。D敛瓷，CD3和譜系標(biāo)記CD4和CD8沿軌跡（實(shí)線）的方差顯著低于兩個(gè)分支中的種群方差（虛線）叁巨，這表明門控種群的異質(zhì)性是比較發(fā)育不同階段的細(xì)胞的結(jié)果。

2.5 沿著SP軌跡的轉(zhuǎn)錄因子動(dòng)力學(xué)

圖4a,b琐驴，比較CD4譜系承諾因子ThPOK和Gata3與CD8譜系承諾因子Runx3的動(dòng)態(tài)比較圖俘种。

（a，b）比較CD4譜系承諾因子ThPOK和Gata3與CD8譜系承諾因子Runx3的動(dòng)態(tài)變化绝淡。（c宙刘，d）兩個(gè)SP群體中關(guān)鍵標(biāo)記沿著正向選擇后的軌跡的導(dǎo)數(shù)圖（左面板）和表達(dá)趨勢（右面板）（突出顯示的區(qū)域由a、b中的灰色雙頭箭頭指示）牢酵，顯示譜系承諾因子的不同動(dòng)態(tài)悬包。CD69和CD62L用于確定SP承諾和成熟的標(biāo)志：CD69hi和CD62Llow代表成功承諾，CD69low和CD62Lhi代表陰性選擇馍乙。（1）陽性選擇時(shí)ThPOK和Gata3均上調(diào)布近，ThPOK上調(diào)較慢（2）。ThPOK在承諾（3）后表現(xiàn)為CD4分支的邊緣上調(diào)丝格。ThPOK和Gata3在陰性選擇（c（4））中顯示CD4分支的邊緣下調(diào)撑瞧。另一方面，在承諾（d（4））之后显蝌，CD8分支機(jī)構(gòu)對(duì)這些因素進(jìn)行了下調(diào)预伺。這種下調(diào)伴隨著Runx3（5）的CD8特異性上調(diào)。（e） 使用補(bǔ)充圖11中定義的方案對(duì)細(xì)胞進(jìn)行門控曼尊，并按以下順序排列酬诀，指示CD4成熟度：DP CD69+、CD4+CD8int骆撇、CD4SP CD69+瞒御、CD4SP CD24int和CD4SP CD24-。取而代之的是三個(gè)中間門細(xì)胞被放置在CD4叉骨軌跡上神郊。根據(jù)這些細(xì)胞在叉形骨軌跡中的位置肴裙，將這些細(xì)胞分為“早期”和“晚期”兩類。（f） CD4+CD8int門區(qū)的“早期”細(xì)胞與“晚期”細(xì)胞相比涌乳，CD69和CD24的表達(dá)顯著增高践宴，CD62L的表達(dá)降低（P<1×10-6，Kolmogorov-Smirnov試驗(yàn)）爷怀。這表明“晚”細(xì)胞比“早”細(xì)胞更成熟阻肩。（g） 在ImmGen分類群體中，CD69和CD24的mRNA表達(dá)與門控群體中的平均表達(dá)相關(guān)运授，表明Wishbone和gating之間的差異不是數(shù)據(jù)集特有的烤惊。

接下來，我們利用一個(gè)包括轉(zhuǎn)錄因子ThPOK吁朦、Gata3和Runx3在內(nèi)的修正的panel來探索關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子沿著兩個(gè)SP軌跡的動(dòng)態(tài)變化柒室。ThPOK和Gata3已被證明是CD4 SP的關(guān)鍵，而Runx3被證明是CD8 SP的關(guān)鍵逗宜。這些因素沿軌跡的動(dòng)態(tài)如圖4a雄右，b所示空骚。
為了將這些轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)聯(lián)系起來，我們使用CD69和CD62L來識(shí)別成熟的標(biāo)志擂仍，例如譜系承諾和成功的陰性選擇（圖4c囤屹，d）。我們的研究結(jié)果表明逢渔，這些因素在實(shí)現(xiàn)承諾時(shí)遵循不同的動(dòng)態(tài)模式肋坚。在陽性選擇期間，ThPOK和Gata3上調(diào)肃廓，但Runx3似乎僅在檢測到的分支點(diǎn)之后上調(diào)（圖4c智厌、d、補(bǔ)充注釋3和補(bǔ)充圖10）盲赊。Gata3被證明可以調(diào)節(jié)ThPOK的表達(dá)11铣鹏，并且可以解釋為什么ThPOK在表達(dá)變化上落后于Gata3（圖4c）。不同的動(dòng)態(tài)可能預(yù)示著不同的調(diào)控機(jī)制哀蘑，通過這些機(jī)制吝沫，這些因素實(shí)現(xiàn)了血統(tǒng)承諾。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明這些機(jī)制递礼。
我們比較了沿著Wishbone軌跡的標(biāo)記動(dòng)力學(xué)和從發(fā)育中的SP細(xì)胞的選通得到的動(dòng)力學(xué)惨险，并比較了沿著Wishbone軌跡每個(gè)群體中細(xì)胞的順序。
我們觀察到脊髓，大多數(shù)門控群體中的細(xì)胞沿著軌跡分布（圖4e和補(bǔ)充圖12b）辫愉，特別是CD4+CD8int（中間型為int）群體的細(xì)胞，在這里譜系決定被認(rèn)為發(fā)生15将硝。為了解決Wishbone和gating之間的差異恭朗，我們根據(jù)其在Wishbone軌跡中的位置將CD4+CD8int細(xì)胞分為“早期”和“晚期”兩組（圖4e，在線方法）依疼，并比較兩組中已知成熟標(biāo)記物CD69痰腮、CD24和CD62L的表達(dá)。與“晚期”細(xì)胞相比律罢，“早期”細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的高表達(dá)CD69和CD24膀值，CD62L的表達(dá)較低（圖4f；P<1×10?6误辑，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)）沧踏，表明“早期”和“晚期”的細(xì)胞分別是不成熟和成熟的。對(duì)于CD4和CD8分支中的附加門控群體的類似結(jié)果（補(bǔ)充圖12）表明巾钉，傳統(tǒng)門控方案導(dǎo)致在每個(gè)門中包含不同成熟階段的細(xì)胞翘狱。我們的結(jié)論是，Wishbone提供了更可靠的細(xì)胞成熟度估計(jì)砰苍，因此標(biāo)記動(dòng)力學(xué)沿著SP成熟潦匈。
為了了解這種差異的來源阱高，我們比較了免疫基因組計(jì)劃（ImmGen）分類人群中標(biāo)記物的平均基因表達(dá)量16和Wishbone標(biāo)記物動(dòng)力學(xué)，并且我們的門控群體中的平均蛋白表達(dá)量和ImmGen群體中的平均mRNA表達(dá)量是相關(guān)的茬缩。因此赤惊，沿叉形桿軌跡觀察到的動(dòng)力學(xué)與選通之間的差異不是特定于數(shù)據(jù)集的觀察（圖4g）。在每個(gè)門中發(fā)育不同的細(xì)胞的混合可能會(huì)導(dǎo)致在成熟過程中表達(dá)改變模式的混雜效應(yīng)寒屯。盡管CD24沿著叉骨軌跡呈持續(xù)下降趨勢，但在門控和ImmGen群體中表達(dá)的變化更大（圖4g黍少，左圖）寡夹。在門控群體中，由于CD69本身用于門控（圖4g厂置，右圖）菩掏，所以在門控細(xì)胞群中沒有觀察到CD69的持續(xù)上調(diào)。最后昵济，盡管Gata3沒有用于選通（補(bǔ)充圖12g）智绸，但Gata3在選通群體中的表達(dá)變化并未顯示在Wishbone中觀察到的動(dòng)態(tài)（圖4c（1，5））访忿，進(jìn)一步證明了Wishbone在更高分辨率下恢復(fù)標(biāo)記動(dòng)態(tài)的能力瞧栗。

2.6 Wishbone在人髓系發(fā)育中的應(yīng)用

我們?cè)趦蓚€(gè)人類髓系發(fā)育數(shù)據(jù)集上評(píng)估了Wishbone的性能。我們使用了先前發(fā)表的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)[2]海铆，這些數(shù)據(jù)包括適合于恢復(fù)早期和晚期髓樣分叉的標(biāo)記物[17]迹恐，但不適用于過渡性髓樣細(xì)胞群的精細(xì)分析。
Wishbone能夠跟蹤造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs）的單核細(xì)胞（CD14+CD11b+CD11c+）和紅系細(xì)胞（CD235ab+）的分化（圖5a和補(bǔ)充圖14a）卧斟，并精確地恢復(fù)單核細(xì)胞和紅系分支（圖5a）殴边。此外，沿著軌跡的標(biāo)記的表達(dá)與已知文獻(xiàn)18一致（補(bǔ)充圖14c）珍语。
Wishbone精確地恢復(fù)了從HSPCs開始的軌跡锤岸，以及兩類單核細(xì)胞的分支，經(jīng)典單核細(xì)胞和CD16單核細(xì)胞（CD16+CD15+）（圖5b）板乙。這是一個(gè)更困難的問題是偷，因?yàn)槌颂卣鳂?biāo)記CD15和CD16（補(bǔ)充圖14d），大多數(shù)標(biāo)記在兩個(gè)群體之間顯示相同的分布募逞。標(biāo)記沿著軌跡的表達(dá)與已知文獻(xiàn)一致（補(bǔ)充圖14e）晓猛，檢測到的分叉點(diǎn)與CD38的顯著下調(diào)一致。

2.7 Wishbone擴(kuò)展到單細(xì)胞RNA序列數(shù)據(jù)

單細(xì)胞RNA序列技術(shù)可以描繪數(shù)千個(gè)單細(xì)胞凡辱，并能夠?qū)φ诎l(fā)育的系統(tǒng)進(jìn)行全基因組鑒定戒职。然而，這些數(shù)據(jù)帶來了挑戰(zhàn)透乾，因?yàn)樵S多基因的行為與發(fā)育成熟度無關(guān)洪燥，而是與細(xì)胞周期和壓力等過程有關(guān)磕秤。因此，軌跡和分支檢測的成功依賴于去除不相關(guān)的因素捧韵，并保留那些具有差異性的跟蹤因素市咆。

圖c,d，將Wishbone應(yīng)用于小鼠造血前體細(xì)胞的RNA-Seq數(shù)據(jù)再来，精確地恢復(fù)HSPCs骨髓和紅系前體分化的軌跡和分支蒙兰。

我們使用最近發(fā)表的單細(xì)胞RNA序列數(shù)據(jù)，從HSPC中選擇參與髓系和紅系祖細(xì)胞分化的細(xì)胞（圖5c和補(bǔ)充圖15a）芒篷。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)Wishbone的擴(kuò)展搜变，適用于單細(xì)胞RNA序列，它使用擴(kuò)散圖來幫助關(guān)注與發(fā)育和成熟相關(guān)的成分针炉。擴(kuò)散圖捕捉數(shù)據(jù)中的主要結(jié)構(gòu)和趨勢挠他，在流式細(xì)胞儀的情況下，不同的擴(kuò)散成分跟蹤組成細(xì)胞類型之間的差異（補(bǔ)充圖6a）篡帕。我們將基因投射到每個(gè)擴(kuò)散組分上殖侵，根據(jù)基因在這個(gè)組分上的表達(dá)情況對(duì)基因進(jìn)行排序，然后用這個(gè)排序進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）镰烧。一些擴(kuò)散組分被富集用于免疫相關(guān)功能（例如拢军，防御反應(yīng)、抗原處理和吞噬作用）怔鳖，而其他組分被富集用于其他生物過程（例如朴沿，細(xì)胞周期、核糖體生物發(fā)生和代謝過程）（補(bǔ)充圖15c败砂，在線方法）赌渣。這為保留與差異化過程最相關(guān)的組件提供了一種自然的方法〔蹋基于類似的推理坚芜，Buettner等人21使用潛在變量模型來消除單細(xì)胞RNA序列中細(xì)胞周期的貢獻(xiàn)。

圖5c,d斜姥，將Wishbone應(yīng)用于小鼠造血前體細(xì)胞的RNA-Seq數(shù)據(jù)鸿竖，精確地恢復(fù)HSPCs骨髓和紅系前體分化的軌跡和分支。

2.7 Wishbone在軌跡識(shí)別和分支識(shí)別方面都優(yōu)于競爭方法

我們比較了Wishbone與Diffusion maps[7]，SCUBA[5]和Monocle[24]的性能（圖6）持钉。盡管我們使用擴(kuò)散圖構(gòu)建了kNN圖衡招，但我們測試了擴(kuò)散圖是否可以概括發(fā)展軌跡。請(qǐng)注意每强，擴(kuò)散貼圖并未明確提供分叉始腾，我們只能評(píng)估其概括準(zhǔn)確排序的能力。擴(kuò)散圖正確地恢復(fù)了T細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)已知階段（補(bǔ)充圖16b）空执，尤其是在早期的DN浪箭，但是在DP和SP群體中卻缺乏足夠的分辨率（補(bǔ)充圖16a，b）脆烟。 此外山林，盡管擴(kuò)散圖在兩個(gè)髓樣數(shù)據(jù)集（補(bǔ)充圖16c房待，e）中恢復(fù)了正確的順序邢羔，但在單核細(xì)胞數(shù)據(jù)集中，擴(kuò)散圖對(duì)成熟細(xì)胞之后的前體進(jìn)行了排序（補(bǔ)充圖16d）桑孩。 因此拜鹤，盡管擴(kuò)散圖大大減少了數(shù)據(jù)中的噪聲（補(bǔ)充圖1，在線方法）流椒，但Wishbone采取的細(xì)化細(xì)胞順序的額外步驟對(duì)于得出魯棒的高分辨率軌跡至關(guān)重要敏簿。
接下來，我們將Wishbone與SCUBA進(jìn)行了比較宣虾。SCUBA具有較大的內(nèi)存占用空間惯裕，因此只能通過從胸腺數(shù)據(jù)集中對(duì)20,000個(gè)單元進(jìn)行二次采樣來運(yùn)行。胸腺的SCUBA軌跡未正確排序各階段绣硝，我們觀察到了不同的DN細(xì)胞散布在DP細(xì)胞之間（圖6a）蜻势。 SCUBA確實(shí)將兩個(gè)SP種群確定為兩個(gè)分支，但與Wishbone相比鹉胖，在分叉點(diǎn)的分辨率降低了（圖6a）握玛。而且，不同的隨機(jī)細(xì)胞樣本在軌跡和分支方面都導(dǎo)致不一致的結(jié)果（補(bǔ)充圖17a甫菠，c）挠铲。大量細(xì)胞計(jì)數(shù)單核細(xì)胞和單細(xì)胞RNA-Seq髓系數(shù)據(jù)集中的SCUBA軌跡與已知生物學(xué)一致，但產(chǎn)生了大量不連貫的分支（圖6c和補(bǔ)充圖17d）寂诱。 此外拂苹，SCUBA無法正確恢復(fù)單核-紅系數(shù)據(jù)集中的順序和分支（補(bǔ)充圖17e）。
最后痰洒，我們將Wishbone與Monocle24進(jìn)行了比較醋寝，Monocle是專為應(yīng)用于單細(xì)胞RNA-Seq數(shù)據(jù)而開發(fā)的搞挣。Monocle不能運(yùn)行超過1,000個(gè)單元，因此我們從每個(gè)數(shù)據(jù)集中對(duì)1,000個(gè)單元進(jìn)行了二次采樣音羞。 在散布著DN和DP細(xì)胞的情況下囱桨，Monocle無法恢復(fù)胸腺數(shù)據(jù)中的正確順序（圖6b）。 盡管軌跡確實(shí)終止于兩個(gè)SP種群嗅绰，但Monocle鑒定出的分支并不對(duì)應(yīng)于T細(xì)胞發(fā)育的任何特定階段舍肠，并且兩個(gè)SP種群都被確定為同一分支的一部分（圖6b）。 重復(fù)的數(shù)據(jù)二次抽樣導(dǎo)致兩個(gè)SP種群被重復(fù)分配到同一分支的結(jié)果大體上不一致（補(bǔ)充圖18a–c）窘面。Monocle還無法通過錯(cuò)誤的細(xì)胞排序和缺乏連貫分支的檢測來恢復(fù)單細(xì)胞RNA-Seq髓系數(shù)據(jù)集中的軌跡和分支（圖6d）翠语。單核細(xì)胞確實(shí)恢復(fù)了單核細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的排序，但所有髓樣數(shù)據(jù)集中的分支結(jié)果均不對(duì)應(yīng)于正確的成熟細(xì)胞群（補(bǔ)充圖18d财边，e）肌括。
因此，Wishbone在細(xì)胞的精細(xì)排序酣难，分支點(diǎn)和分支關(guān)聯(lián)的識(shí)別以及復(fù)制間一致的魯棒性方面優(yōu)于競爭方法谍夭。

3.討論
我們已經(jīng)開發(fā)了一種算法，該算法能夠沿著分支的發(fā)展軌跡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行精確且高分辨率的排序（補(bǔ)充圖19）憨募。 我們首先使用大規(guī)模流式細(xì)胞儀的通量收集每個(gè)樣品中≥200,000個(gè)細(xì)胞紧索，證明了Wishbone對(duì)小鼠胸腺T細(xì)胞發(fā)育的影響。Wishbone構(gòu)造了從DN階段到兩個(gè)SP譜系成熟的分叉軌跡菜谣，提供了事件的順序和時(shí)機(jī)珠漂，這些事件和事件的時(shí)間緊緊概述了該系統(tǒng)的先前研究15。 Wishbone的高分辨率使我們能夠識(shí)別譜系標(biāo)記的細(xì)微但關(guān)鍵的動(dòng)力學(xué)尾膊，例如在DN向DP細(xì)胞過渡期間檢測稀有CD8 + CD4-中間SP細(xì)胞以及向DP末端過渡CD4 + / CD8low中間狀態(tài)媳危。
選擇一個(gè)好的標(biāo)記集是我們獲得分辨率的關(guān)鍵。 可以通過先驗(yàn)知識(shí)和初步篩選的組合來指導(dǎo)標(biāo)記的選擇冈敛。 但是待笑，在骨髓分支中，我們證明了即使只有有限的面板（僅包含少量可區(qū)分的骨髓標(biāo)志物）莺债，Wishbone仍能正確排序細(xì)胞滋觉，識(shí)別分叉以及將細(xì)胞關(guān)聯(lián)至正確的分支。 盡管不一定可以提供明確的事實(shí)依據(jù)齐邦，但SCUBA和Monocle都無法在這些更具挑戰(zhàn)性的數(shù)據(jù)集中恢復(fù)與已知生物學(xué)一致的表達(dá)趨勢和分支椎侠。Wishbone只需要幾個(gè)規(guī)范標(biāo)記就可以正確地識(shí)別分叉，并且由于包含了其他標(biāo)記措拇，因此在過渡人群中獲得了越來越精細(xì)的分辨率我纪。
單細(xì)胞RNA-Seq是大規(guī)模流式細(xì)胞術(shù)的一種有吸引力的替代方法，因?yàn)槠錈o偏見的，全基因組的性質(zhì)提供了數(shù)千種基因的測量浅悉，并且避免了對(duì)先驗(yàn)選擇有限標(biāo)記集的需求趟据。 但是，與發(fā)育無關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化會(huì)混淆分析术健，甚至與發(fā)育相關(guān)的基因的數(shù)據(jù)也具有很大的噪音汹碱，包括脫落效應(yīng)27。 我們使用擴(kuò)散圖鞏固了關(guān)鍵的生物學(xué)趨勢荞估，并刪除了不相關(guān)的生物學(xué)過程咳促。 我們證明，橫臂骨大大優(yōu)于專門為單細(xì)胞RNA-Seq數(shù)據(jù)開發(fā)的方法5勘伺。
即使單細(xì)胞RNA-Seq的吞吐率不斷提高跪腹，目前的數(shù)據(jù)集仍包含數(shù)千個(gè)細(xì)胞，而大規(guī)模細(xì)胞計(jì)數(shù)法中卻有數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞飞醉。 由于已顯示出過渡種群與1 / 10,000個(gè)細(xì)胞一樣稀少3冲茸，因此大規(guī)模細(xì)胞計(jì)數(shù)的通量更適合于實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的時(shí)間分辨率。 我們認(rèn)為缅帘，這兩種技術(shù)是互補(bǔ)的轴术。 例如，單細(xì)胞RNA-Seq可以用于研究較少的發(fā)育系統(tǒng)中的無偏標(biāo)記選擇股毫，然后可以使用已鑒定的專家組通過大規(guī)模細(xì)胞術(shù)獲得更精細(xì)的時(shí)間分辨率膳音。