|利用AlphaFold_Multimer和ProteinMPNN迭代循環(huán)設(shè)計(jì)出具有高親和力的蛋白結(jié)合物
題目：使用深度學(xué)習(xí)模型進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)合劑的計(jì)算機(jī)進(jìn)化瞒津，用于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和
文獻(xiàn)來源：https://doi.org/10.1101/2023.05.03.539278
代碼：https://github.com/KuhlmanLab/evopro
內(nèi)容：
在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的計(jì)算方法的發(fā)展方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展钉汗，但在沒有廣泛篩選和成熟的情況下工程高親和力結(jié)合物仍然具有挑戰(zhàn)性翔脱。在這里释移，作者測(cè)試了一個(gè)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)管道僧家，該管道使用基于迭代輪深度學(xué)習(xí)（DL）的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（AlphaFold2）和序列優(yōu)化（ProteinMPNN）來設(shè)計(jì)PD-L1拮抗劑的自抑制域（AiDs）谅将。受最近治療設(shè)計(jì)進(jìn)展的啟發(fā)积暖，作者試圖創(chuàng)造自抑制（或掩蓋）形式的拮抗劑去扣，可以被蛋白酶有條件地激活风喇。將23個(gè)從頭設(shè)計(jì)的不同長度和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的AiD宁改，與蛋白酶敏感連接子的拮抗劑融合，并在蛋白酶處理和不處理下測(cè)試與PD-L1的結(jié)合程度魂莫。其中9個(gè)融合蛋白與PD-L1有條件結(jié)合还蹲，并選擇表現(xiàn)最好的AiDs作為單結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。在沒有任何實(shí)驗(yàn)親和成熟的情況下豁鲤，4個(gè)AiDs的平衡解離常數(shù)（KDs）低于150nM結(jié)合秽誊，最低的KD為0.9 nM。本文研究表明琳骡，基于DL的蛋白質(zhì)建墓郏可以用來快速生成高親和力的蛋白結(jié)合物。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)生物學(xué)中的大多數(shù)過程至關(guān)重要楣号，改進(jìn)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)合物的方法將使創(chuàng)建新的研究試劑最易、診斷和治療方法成為可能。在本研究中炫狱，作者證明了一種基于深度學(xué)習(xí)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法可以創(chuàng)建高親和力的蛋白結(jié)合物藻懒，從而不需要廣泛的篩選。
1.背景介紹
在過去的15年里视译，計(jì)算蛋白設(shè)計(jì)已經(jīng)成為設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)合物的一種有效方法嬉荆。最近的這些方法都是基于蛋白質(zhì)的原子模型(如rosetta)，其中不同序列和構(gòu)象的相對(duì)有利性是通過能量函數(shù)評(píng)估的模型酷含，如范德華力和氫鍵鄙早。這些方法的一個(gè)特點(diǎn)是汪茧，它們?cè)试S在目標(biāo)蛋白上指定結(jié)合位點(diǎn)。然而限番，按照傳統(tǒng)的計(jì)算設(shè)計(jì)過程舱污，通常需要篩選成百上千個(gè)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)來識(shí)別結(jié)合物。在過去的幾年里弥虐，深度學(xué)習(xí)（DL）的進(jìn)步極大地改進(jìn)了蛋白質(zhì)建模的計(jì)算方法扩灯。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，如AlphaFold2（AF2）和RoseTTAFold
已經(jīng)可以從序列信息準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)霜瘪，而設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)珠插，如ProteinMPNN 則識(shí)別與給定蛋白質(zhì)主干兼容的氨基酸序列。
在這里颖对，本文介紹了一個(gè)名為EvoPro的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)管道丧失，它使用一種遺傳算法，包括使用AF2和序列多樣化的迭代結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)惜互，從而進(jìn)化出一組蛋白質(zhì)來結(jié)合預(yù)先指定的目標(biāo)蛋白（圖1A）。首先琳拭，一組從頭設(shè)計(jì)的微型蛋白序列(從前被設(shè)計(jì)成一些被定義的結(jié)構(gòu)基序)以及目標(biāo)蛋白序列都輸入到AlphaFold-Multimer训堆。接下來，為了識(shí)別更好的序列白嘁，作者使用來自AF2置信度分?jǐn)?shù)的適應(yīng)度函數(shù)和設(shè)計(jì)的結(jié)合劑與目標(biāo)蛋白之間的界面接觸數(shù)來評(píng)估預(yù)測(cè)的AF2復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖1a坑鱼，右）。得分最高的序列用于下一代隨機(jī)突變和交叉的多樣性化絮缅，或者使用該復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為輸入鲁沥，使用ProteinMPNN進(jìn)行優(yōu)化（圖1a，底部）耕魄。每一次迭代画恰，適應(yīng)度函數(shù)選擇具有相應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的序列，這些序列具有更好的目標(biāo)蛋白AF2置信度以及目標(biāo)蛋白上表面的良好交互作用吸奴。
圖1 (A)EvoPro是一個(gè)循環(huán)設(shè)計(jì)過程允扇，在遺傳算法框架內(nèi)通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，在序列生成和評(píng)分之間進(jìn)行迭代则奥。序列多樣化通過隨機(jī)誘變或ProteinMPNN（底部考润，藍(lán)色）完成，而結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用AF2完成读处。評(píng)分步驟包括根據(jù)AF2預(yù)測(cè)計(jì)算的三個(gè)術(shù)語（右糊治，黃色）：放置置信評(píng)分，使用AF2PAE置信度來估計(jì)界面質(zhì)量罚舱；Fold置信評(píng)分井辜，使用AF2pLDDT置信度來估計(jì)微型蛋白的折疊穩(wěn)定性绎谦；構(gòu)象穩(wěn)定性評(píng)分，使蛋白質(zhì)結(jié)合形式和非結(jié)合形式之間的構(gòu)象差異最小化抑胎。(B)通過(B)增加序列池的大小和序列優(yōu)化的頻率燥滑，可以產(chǎn)生更一致和更低的整體適應(yīng)度得分。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立的設(shè)計(jì)軌跡阿逃。(C)51個(gè)起始支架中所代表的所有拓?fù)涠汲霈F(xiàn)在前100個(gè)輸出模型中铭拧，按照AF2ipTM評(píng)分（接口置信度的全局指標(biāo)）進(jìn)行排序。(D)評(píng)分項(xiàng)作為EvoPro單個(gè)軌跡迭代次數(shù)的函數(shù)恃锉。得分項(xiàng)上的權(quán)重用w =x表示搀菩。在右邊，來自EvoPro優(yōu)化前后的AF2預(yù)測(cè)的PAE熱圖破托。PAE越低肪跋，表示越有信心。(E)EvoPro優(yōu)化前后AF2ipTM評(píng)分的分布土砂。分?jǐn)?shù)越大州既，信心就會(huì)越高。(F)RovottadG/dSASA的變化萝映，這是界面質(zhì)量的獨(dú)立度量吴叶。能量越低，能量就越有利序臂。
EvoPro管道的一個(gè)吸引人的特點(diǎn)是蚌卤，通過迭代結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和序列設(shè)計(jì)，支架可以發(fā)生可能有利于結(jié)合的構(gòu)象變化奥秆。在更傳統(tǒng)的計(jì)算設(shè)計(jì)方法中逊彭，伴隨界面設(shè)計(jì)的主干塑造一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。EvoPro在概念上類似于最近描述的其他設(shè)計(jì)管道构订，如RoseTTAFold和AlphaDesign侮叮，它們將AF2與隨機(jī)突變結(jié)合來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)。EvoPro與之前研究的一個(gè)區(qū)別主要是在ProteinMPNN和AF2之間的迭代交換鲫咽。用AlphaDesign
創(chuàng)建的序列尚未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證签赃，而基于rosettafold的幻覺已被用于創(chuàng)建新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、組裝物和與螺旋肽緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分尸。
為了證明EvoPro的實(shí)用性锦聊，作者為PD-L1拮抗劑設(shè)計(jì)了各種自抑制域（AiDs），PD-L1是程序性死亡途徑的關(guān)鍵組成部分和臨床相關(guān)的免疫治療靶點(diǎn)箩绍。在這項(xiàng)工作中孔庭，作者沒有使用抗體作為PD-L1拮抗劑，而是使用了一種可溶性的PD-1變體，該變體已經(jīng)親和力成熟圆到，與PD-L1緊密結(jié)合（KD< 1nM）怎抛。這種拮抗劑被命名為HA-PD1，因?yàn)楦哂H和力PD-1芽淡，在動(dòng)物模型中被證明可以縮小腫瘤马绝。為了調(diào)節(jié)HA-PD1的活性，使其在PD-L1中具有弱親和力挣菲，直到被蛋白酶激活富稻，作者使用EvoPro設(shè)計(jì)了一組不同的小蛋白結(jié)構(gòu)域作為Aid，可以與HA-PD1融合并阻斷其與PD-L1的相互作用白胀。當(dāng)HA-PD1連接到Aid的連接體通過蛋白酶處理被裂解時(shí)椭赋，與PD-L1的結(jié)合被恢復(fù)。此外或杠，當(dāng)作為單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域表達(dá)時(shí)哪怔，一些重組AiDs與HA-PD1結(jié)合KD值低于150nM。綜上所述向抢，EvoPro是一種設(shè)計(jì)高親和蛋白結(jié)合物的有效方法
2.模型框架以及打分函數(shù)
2.1模型框架
EvoPro管道迭代使用AF2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和ProteinMPNN的序列設(shè)計(jì)來識(shí)別序列-結(jié)構(gòu)空間的有利區(qū)域认境。作者為AF2使用了一個(gè)運(yùn)行時(shí)優(yōu)化的協(xié)議，它可以在5-10秒內(nèi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)挟鸠，而不是幾分鐘元暴。由于ProteinMPNN在每個(gè)生成的序列中只運(yùn)行~1秒，因此不執(zhí)行任何以高吞吐量方式使用的運(yùn)行時(shí)優(yōu)化兄猩。在每次EvoPro迭代中，可以在幾分鐘內(nèi)預(yù)測(cè)許多序列的結(jié)構(gòu)鉴未。
2.2打分函數(shù)
每個(gè)EvoPro軌跡都試圖通過選擇和進(jìn)化具有最佳（即較低的適應(yīng)度分?jǐn)?shù)）的序列來滿足預(yù)定義的設(shè)計(jì)要求（圖1A）枢冤。為了使用EvoPro進(jìn)行結(jié)合劑設(shè)計(jì)，作者加入了界面質(zhì)量（“放置置信度”）铜秆、結(jié)合劑折疊穩(wěn)定性（“Fold置信度”）和結(jié)合肽態(tài)與非結(jié)合肽的構(gòu)象差異（“構(gòu)象穩(wěn)定性”）的分?jǐn)?shù)組件（圖1a淹真，右）。值得注意的是连茧，對(duì)于其他設(shè)計(jì)問題核蘸，可以實(shí)現(xiàn)和組合類似的評(píng)分術(shù)語，作者目前正在進(jìn)一步探索這一點(diǎn)啸驯。
作者對(duì)不同的池大锌驮（即種群中氨基酸序列的數(shù)量）和采樣序列空間的方案（圖1B）進(jìn)行了基準(zhǔn)模擬。較小規(guī)模的池的軌跡不能一致地產(chǎn)生具有理想的適應(yīng)度分?jǐn)?shù)的良好設(shè)計(jì)罚斗，經(jīng)常陷入局部的適應(yīng)度最小值徙鱼。增加池的大小通常會(huì)導(dǎo)致較低的適應(yīng)度分?jǐn)?shù)，但也會(huì)帶來更高的計(jì)算費(fèi)用，因?yàn)槊總€(gè)序列必須有預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)袱吆。
在每一次迭代過程中厌衙，EvoPro通過隨機(jī)突變、交叉或優(yōu)化ProteinMPNN將突變引入最佳評(píng)分序列（圖1a绞绒，底部）婶希。當(dāng)使用ProteinMPNN時(shí)，af2預(yù)測(cè)出的HA-PD1結(jié)合復(fù)合物結(jié)構(gòu)作為輸入蓬衡，允許在結(jié)合劑的所有殘基位置發(fā)生突變喻杈。在池的再填充步驟中加入ProteinMPNN顯著降低了每個(gè)軌跡的總體最小適應(yīng)度得分（圖1b，底部）撤蟆。為了實(shí)現(xiàn)PD-L1拮抗劑自抑制域的設(shè)計(jì)奕塑，作者每10次迭代使用ProteinMPNN重新填充池。然而家肯，后來的基準(zhǔn)測(cè)試顯示龄砰，過于頻繁地使用ProteinMPNN往往會(huì)導(dǎo)致更低的整體適應(yīng)度分?jǐn)?shù)。
3.用EvoPro生成自抑制結(jié)構(gòu)域
為了設(shè)計(jì)PD-L1拮抗劑的自抑制域讨衣，作者從別人推薦的一套從頭設(shè)計(jì)的微型蛋白支架中選擇了51個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同的微型蛋白支架换棚。對(duì)這51個(gè)起始支架中的每一個(gè)，他們運(yùn)行了5個(gè)獨(dú)立的EvoPro設(shè)計(jì)軌跡反镇，其中每個(gè)軌跡的池含有超過60次迭代的50個(gè)序列固蚤。總共進(jìn)行了255條設(shè)計(jì)軌跡歹茶，每個(gè)軌跡最終生成25個(gè)設(shè)計(jì)序列夕玩，總共得到6375條設(shè)計(jì)。每個(gè)獨(dú)立的EvoPro軌跡都傾向于收斂于一組高度相似的序列惊豺，平均序列恒等式為81%燎孟，代表了適應(yīng)度空間中的一個(gè)局部最小值。
作者使用四種不同的支架拓?fù)渥鳛镋voPro軌跡的起點(diǎn)尸昧，包括三螺旋（3H）和四螺旋束（4H）揩页，以及2個(gè)b鏈（2H3E）和2個(gè)b鏈（2H4E）混合拓?fù)涞奈⑿偷鞍祝▓D1C）。經(jīng)過EvoPro優(yōu)化后烹俗，前100個(gè)結(jié)果（按AF2的界面預(yù)測(cè)模板建模評(píng)分（ipTM）排名）包含了每個(gè)拓?fù)浔拢M管3H束的比例略大（圖1C）。這可能表明幢妄，要么這種拓?fù)涮貏e適合靶點(diǎn)蛋白結(jié)合界面兔仰，或者在所使用的DL模型中對(duì)這種拓?fù)浯嬖谝恍┢睢?/p>
一個(gè)具有代表性的EvoPro設(shè)計(jì)軌跡顯示，隨著模擬隨著迭代的進(jìn)行蕉鸳，各個(gè)分?jǐn)?shù)成分逐漸減少（圖1D）。三個(gè)分?jǐn)?shù)組成部分是：1)放置置信度得分，表示由AF2的成對(duì)預(yù)測(cè)對(duì)齊誤差（PAE）得出的界面的大小和質(zhì)量无虚；2)基于AF2基于殘留置信度的pLDDT；3)構(gòu)象穩(wěn)定性評(píng)分友题，表示結(jié)合劑在單體形式與復(fù)雜形式之間的構(gòu)象差異嗤堰，最小化結(jié)合所需的構(gòu)象變化（圖1A，右）度宦。
放置置信度評(píng)分比模擬得到了最顯著的改善踢匣，表明最初較差的界面演變成了更好的界面（圖1D，左）戈抄。EvoPro前后的AF2 PAE熱圖顯示了設(shè)計(jì)界面的可信度有所提高（圖1D离唬，右）。構(gòu)象穩(wěn)定性評(píng)分逐漸降低划鸽，有利于預(yù)測(cè)的序列在結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)變化很惺漭骸（圖1D，左）裸诽。折疊置信度評(píng)分顯示軌跡變化最小嫂用，可能是因?yàn)楸贿x擇的支架是相當(dāng)穩(wěn)定的，因此丈冬，在軌跡開始時(shí)有很高的AF2置信度（pLDDT）（圖1D嘱函，左）。AF2ipTM置信度表示全局界面置信度埂蕊，在設(shè)計(jì)模擬中沒有得到優(yōu)化往弓，也顯示了EvoPro優(yōu)化后目標(biāo)粘合劑界面的顯著改進(jìn)（圖1E）。作者使用基于rosetta的評(píng)分指標(biāo)正交地驗(yàn)證了他們?cè)O(shè)計(jì)的界面質(zhì)量蓄氧。
盡管與HA-PD1上相同的表面補(bǔ)丁結(jié)合亮航，但每個(gè)AiD和HA-PD1之間的特定接觸在不同的設(shè)計(jì)和HA-PD1：PD-L1的相互作用中有所不同（圖2）。這表明設(shè)計(jì)過程不是簡(jiǎn)單地概括天然接觸匀们，而是創(chuàng)建新的接觸面。
圖2設(shè)計(jì)接口接觸的AF2模型與HA-PD1：PD-L1接口不同准给。(A)盡管在HA-PD1上有相似的表面補(bǔ)丁泄朴，但其設(shè)計(jì)與天然配體PD-L1（PDB5IUS）具有獨(dú)特和不同的接觸。然而露氮，一個(gè)共同的特征是在HA-PD1的疏水口袋中插入了一個(gè)疏水殘基（用黑色星號(hào)標(biāo)記）祖灰。AF2模型在生成圖形之前用羅塞塔將能量最小化。在PyMOL中繪制的圖中畔规，一些殘基被隱藏起來局扶，每個(gè)面板中都顯示了H68HA-PD1。(B)該表將設(shè)計(jì)的序列與相應(yīng)的起始支架序列進(jìn)行了比較,還為RosettadG/dSASASA和埋藏未滿足的氫鍵（bUN氫鍵）參數(shù)提供了設(shè)計(jì)模型的評(píng)分指標(biāo)。
4.掩蔽拮抗劑顯示出蛋白酶依賴于與PD-L1的結(jié)合
作者使用Expi293哺乳動(dòng)物細(xì)胞小規(guī)模表達(dá)了這23個(gè)MAs三妈。分泌的蛋白用鎳樹脂純化畜埋，并評(píng)價(jià)洗脫液的產(chǎn)量和純度。在所有設(shè)計(jì)中都觀察到適當(dāng)分子量的蛋白質(zhì)畴蒲，但某些結(jié)構(gòu)的表達(dá)量超過10倍以上悠鞍。作者選擇了13種表達(dá)良好且代表多種支架拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的良好結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，使用由Promega開發(fā)的基于細(xì)胞的PD-L1結(jié)合試驗(yàn)模燥。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見表1和圖3咖祭。
表1掩蔽拮抗劑顯示蛋白酶依賴的結(jié)合和活性。蛋白酶處理前后蒙面拮抗劑的平均動(dòng)力學(xué)參數(shù)表蔫骂，包括用于SPR結(jié)合動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)（左）和細(xì)胞活性測(cè)定（左）的NoMA（“No”）。對(duì)于結(jié)合動(dòng)力學(xué)辽旋，誤差代表SD戴已，而一些樣品只測(cè)試了一次（沒有重復(fù)，n.r.）伐坏。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)握联，誤差代表了多個(gè)實(shí)驗(yàn)中平均半抑制濃度的標(biāo)準(zhǔn)差(圖。S6)或單個(gè)實(shí)驗(yàn)中3個(gè)重復(fù)的95%置信區(qū)間（*）纯露。
圖3EvoPro結(jié)合物作為PD-L1拮抗劑的自抑制域埠褪。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中挤庇，對(duì)天然PD-1：PD-L1相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性抑制驅(qū)動(dòng)熒光素酶的表達(dá)嫡秕，這可以通過監(jiān)測(cè)發(fā)光來檢測(cè)。(A)在（右）和（左）蛋白酶處理的情況下驾凶，將各種PD-L1拮抗劑的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合（顏色鍵所示）作為蛋白濃度的函數(shù)。沒有掩罩（“No”）的HA-PD1的活性以黑色表示供參考。從一個(gè)單一實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)技術(shù)重復(fù)，以平均±掃描電鏡顯示屹篓。使用（正方形）和不經(jīng)（圓圈）蛋白酶處理的細(xì)胞表面試驗(yàn)的掩蔽拮抗劑的(B)
IC50s。C)結(jié)合速率常數(shù)（kon）和解離速率常數(shù)（koff）亩鬼。
通過（正方形）和不（圓形）蛋白酶處理結(jié)合PD-L1的拮抗劑。結(jié)合測(cè)量是用生物素化的PD-L1固定在中和霉素芯片上的SPR進(jìn)行的(圖黄绩。S7).報(bào)告的誤差代表了除MA4（n= 1）玷过、MA16（n = 1）和MA20（n = 2）外的至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的SD。
5.將AiDs作為單獨(dú)表達(dá)的蛋白進(jìn)行特性分析
為了直接測(cè)量AiD對(duì)HA-PD1的親和力粤蝎，作者選擇了一個(gè)子集作為孤立域表達(dá)：AiD4袋马、AiD5、AiD7碑宴、AiD9桑谍、AiD10、AiD15锣披、AiD19和AiD20。除AiD20外雹仿，所有構(gòu)建物均表達(dá)良好，并通過鎳親和層析純化。所有設(shè)計(jì)為螺旋束的結(jié)構(gòu)都具有圓二色性（CD）光譜悄蕾，與222nm和208 nm的a-螺旋形成一致（圖4A）。
圖4表達(dá)為單個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白的AiDs被折疊并與HAPD1結(jié)合奠骄。各種空氣中的(A)圓二色譜（CD）光譜和(B)溫度熔體。(C)單周期SPR傳感器圖為設(shè)計(jì)的艾滋埠邸（彩色線）和選擇突變體（灰色線）。生物素化的HA-PD1被固定在中和病毒素芯片上鸭廷，達(dá)到~250反應(yīng)單位（RUs）的水平熔吗。將艾滋病患者和突變體以指定的濃度進(jìn)行注射，數(shù)據(jù)符合1：1的結(jié)合模型（黑色）桅狠。指示的KD值是三個(gè)或更多結(jié)合度量的平均值。
6.討論
我們的結(jié)果表明咨堤，用于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和序列設(shè)計(jì)的DL模型可以結(jié)合起來設(shè)計(jì)高親和蛋白結(jié)合物一喘。值得注意的是陨仅，Aid與HA-PD1具有廣泛的結(jié)合親和力。用Rosetta計(jì)算的AF2置信度評(píng)分和結(jié)合能并不能預(yù)測(cè)AiD5與HA-PD1的結(jié)合會(huì)比其他設(shè)計(jì)緊密40倍以上灼伤。比較AiD5和AiD4是很有趣的，因?yàn)檫@兩個(gè)序列是由相同的EvoPro軌跡產(chǎn)生的撞鹉，并且在界面上只有4個(gè)氨基酸差異（圖2）颖侄。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了不斷改進(jìn)計(jì)算蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合能的方法。
EvoPro的一個(gè)強(qiáng)大特性是孝鹊，評(píng)分函數(shù)可以被定制，以獎(jiǎng)勵(lì)滿足預(yù)定義需求的序列又活。本研究包含了一個(gè)得分項(xiàng)，它有利于預(yù)測(cè)在非結(jié)合狀態(tài)下與在結(jié)合狀態(tài)下形成相同結(jié)構(gòu)的結(jié)合序列柳骄。作者使用了這個(gè)評(píng)分項(xiàng)，即構(gòu)象穩(wěn)定性評(píng)分舔清，因?yàn)榻Y(jié)合時(shí)構(gòu)象的變化會(huì)帶來能量懲罰体谒。這些aid的一個(gè)顯著特征是，它們都有快速的速率與kon值大于1×105 M-1s-1营密。這一結(jié)果與不涉及大構(gòu)象變化的相互作用相一致目锭，因?yàn)樵诮Y(jié)合時(shí)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排的系統(tǒng)中，經(jīng)常觀察到速率較慢被去。如果沒有將未結(jié)合狀態(tài)與結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行比較的評(píng)分項(xiàng)奖唯，EvoPro經(jīng)常產(chǎn)生預(yù)測(cè)在結(jié)合時(shí)改變構(gòu)象的序列。這種行為可以通過在評(píng)分函數(shù)中獎(jiǎng)勵(lì)它來增強(qiáng)丰捷，并且可能是設(shè)計(jì)變構(gòu)的一個(gè)令人興奮的方法。
在設(shè)計(jì)HA-PD1的AiDs時(shí)捣染，EvoPro得益于AF2傾向于將蛋白與HA-PD1上的PD-L1結(jié)合位點(diǎn)對(duì)接耍攘。這可能反映了一種隱藏在HA-PD1上的疏水表面積的愿望畔勤，以及對(duì)自然PD-1/PD-L1結(jié)合位點(diǎn)的記憶，因?yàn)锳F2訓(xùn)練集很可能包括與PD-L1結(jié)合的PD-1的結(jié)構(gòu)庆揪。在與其他目標(biāo)蛋白的初步模擬中，作者觀察到EvoPro很容易找到與已知蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)相互作用的結(jié)合物吝羞，但很難將結(jié)合物放置在目標(biāo)蛋白表面的其他區(qū)域（即使評(píng)分函數(shù)獎(jiǎng)勵(lì)替代結(jié)合位點(diǎn)）。如果EvoPro的這一特性是有利的脆贵，如果其目標(biāo)是創(chuàng)造競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑起暮，與自然發(fā)生的相互作用競(jìng)爭(zhēng)负懦，但當(dāng)一個(gè)新的結(jié)合表面被靶向時(shí)，可能是一個(gè)問題系吭。基于細(xì)胞的分析中肯尺，作者觀察到對(duì)HA-PD1親和力最緊密的AiD（AiD5）并不是最有效的，因?yàn)樵诘鞍酌盖懈钸B接子后则吟，AiD仍然與HAPD1結(jié)合锄蹂。之前，當(dāng)使用PD-L1的一種可溶性變體作為HA-PD1的AiD時(shí)得糜，作者也觀察到了類似的結(jié)果朝抖。目前在人類中測(cè)試的掩蔽PD-L1拮抗劑顯示，PD-L1親和力的變化范圍與MA15和MA19相似捉蚤。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在構(gòu)建自抑制系統(tǒng)時(shí)炼七，生成一組具有不同親和力的結(jié)合劑的實(shí)用性，因?yàn)樽罴训慕Y(jié)合力可能取決于生物上的因素陕悬。
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