光是植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的調(diào)控因子昭娩，不僅為植物提供能源机久，還作為信號(hào)因子調(diào)控植物發(fā)育的整個(gè)生活史。其中枉疼，光、暗條件下幼苗的形態(tài)建成是光信號(hào)調(diào)控植物發(fā)育最顯著的表現(xiàn)形式：暗中生長(zhǎng)的黃化苗具有長(zhǎng)下胚軸鞋拟，頂端彎鉤和閉合的子葉骂维；黃化苗見光后，下胚軸停止伸長(zhǎng)贺纲，頂端彎鉤打開航闺，子葉開展變綠。光信號(hào)通過同時(shí)控制不同器官的發(fā)育快速轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑螒B(tài)建成，以更好得進(jìn)行光合作用潦刃。因此侮措，幼苗去黃化過程不僅作為研究光信號(hào)調(diào)控的模式，也是多種細(xì)胞發(fā)育過程的綜合體現(xiàn)福铅。

今天分享一個(gè)萝毛，最近發(fā)在nature plants上的文章，這個(gè)paper是北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院鄧興旺院士團(tuán)隊(duì)的滑黔，題目是Time Series Single-Cell Transcriptional Atlases Reveal Cell Fate Differentiation Driven by Light in Arabidopsis Seedlings笆包，這個(gè)paper首次獲得了植物單細(xì)胞水平暗轉(zhuǎn)光過程中基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，解析了光信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在表皮略荡、維管庵佣、皮層等多種細(xì)胞發(fā)育過程中的作用方式。

==========實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)==========

該研究通過分別對(duì)持續(xù)黑暗生長(zhǎng)5天汛兜、暗轉(zhuǎn)光1小時(shí)巴粪、6小時(shí)、24小時(shí)以及持續(xù)光照生長(zhǎng)5天處理的擬南芥幼苗地上粥谬、地下部分進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序肛根。

=========實(shí)驗(yàn)結(jié)果===========

1. 去黃化幼苗細(xì)胞單圖譜的構(gòu)建

單細(xì)胞測(cè)序后，shoot獲得了31,796個(gè)cell漏策，root獲得了61,065個(gè)cell派哲。root聚類完獲得了28個(gè)cluster（圖1a），shoot聚類完獲得了33個(gè)cluster（圖1b）掺喻。并用已知的marker進(jìn)行了注釋（圖1c和1d）芭届。

圖1

通過不同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，根細(xì)胞類型的狀態(tài)是穩(wěn)定的（圖1e）感耙，但在去黃化期間褂乍，莖也就是地上部分細(xì)胞類型發(fā)生了廣泛的變化（圖1f）。葉肉細(xì)胞（Mes）即硼、表皮細(xì)胞（E）和皮層細(xì)胞（C）的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)發(fā)生了漸進(jìn)但根本性的變化逃片，然而，維管束細(xì)胞簇（Vas）對(duì)光照相對(duì)不敏感只酥。因此褥实，作者在隨后的分析中重點(diǎn)關(guān)注莖細(xì)胞類型。

圖1

然后作者通過已知標(biāo)記物和報(bào)告基因進(jìn)行驗(yàn)證层皱，從而獲得了精細(xì)注釋的高分辨率圖譜（圖2）。

圖2

2.?時(shí)空標(biāo)記的識(shí)別

然后作者嘗試鑒定細(xì)胞類型特異響應(yīng)的marker基因赠潦。作者總共鑒定了9,997個(gè)具有明顯表達(dá)偏好的根細(xì)胞類型特異性基因和6,702個(gè)具有明顯表達(dá)偏好的莖細(xì)胞類型特異性基因叫胖，其中包含一些一直的marker基因。例如一些transporters她奥，例如SWEET11, SWEET3, NPF7.3等在維管束parenchymal cell中特異表達(dá)（圖3a）瓮增。

為了從所有聚類特異性基因中分類光調(diào)節(jié)基因怎棱，作者首先處理了幼苗的子葉、下胚軸和根組織绷跑，在暗轉(zhuǎn)光過渡期間進(jìn)行了普通轉(zhuǎn)錄組測(cè)序拳恋。利用本研究和之前發(fā)表的解除休眠幼苗的器官特異性RNA-seq數(shù)據(jù)，作者鑒定了13,653個(gè)基因砸捏，它們與黑暗相比谬运，在至少一個(gè)組織中的一個(gè)光照暴露時(shí)間點(diǎn)有顯著差異表達(dá)。超過60%的光誘導(dǎo)差異表達(dá)基因（DEGs）（8,212/13,653）被鑒定為在細(xì)胞類型間有差異表達(dá)垦藏，并構(gòu)成了在scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs的66.0%（8,212/12,447）梆暖。并且這些特異的marker大多數(shù)是受光照調(diào)控的（圖3b）。

為了廣泛解析基因空間時(shí)間表達(dá)模式掂骏，作者在五個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)構(gòu)建了七種莖細(xì)胞類型的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)轰驳。利用WGCNA構(gòu)建了73個(gè)modules。研究表明弟灼，ME1中的基因功能與光合作用相關(guān)级解。與光誘導(dǎo)的模塊ME1相比，ME6和ME7中的基因在沒有空間偏好的Dark樣本中檢測(cè)到更高的表達(dá)田绑。光形態(tài)發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子HY5/HYH和負(fù)轉(zhuǎn)錄因子PIF1和PIF5被歸類為屬于ME1勤哗。HY5的直接靶基因的近三分之一（80/295）在解除休眠過程中被分配到ME1。PIFs45,46（PIF1辛馆、PIF3俺陋、PIF4、PIF5）的靶基因富集于ME1（43/333）和ME6（30/333）昙篙，其他靶基因則具有空間差異腊状。總之苔可，基本的光信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在不同的細(xì)胞類型中普遍誘導(dǎo)缴挖。然而，調(diào)節(jié)的基因傾向于以細(xì)胞類型偏好進(jìn)行轉(zhuǎn)錄焚辅。

圖3

3.?光平衡木質(zhì)部和韌皮部的發(fā)育

因?yàn)榫S管束負(fù)責(zé)水以及營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)運(yùn)映屋，在鏈接地上部分和地下部分之間起著關(guān)鍵的作用。因此同蜻，作者篩選了來自維管細(xì)胞簇（Vas1–Vas7）的9,088個(gè)細(xì)胞棚点，并根據(jù)維管高變異基因重新進(jìn)行了聚類（圖4a）。例如湾蔓，原先的cluster Vas1進(jìn)一步細(xì)分成了Pr1和Pr2瘫析。在原始維管細(xì)胞簇中，DOFs和ERF114等在增殖細(xì)胞中表達(dá)的基因得到了積極轉(zhuǎn)錄（圖4b）。

在黑暗條件下贬循，Pr2占主導(dǎo)地位咸包，而在光照1小時(shí)后，Pr1的比例增加杖虾。在照明1天后烂瘫，Pr3構(gòu)成了主要位置。此外奇适，細(xì)胞分裂的比例在光輻射后增加坟比。綜上所述，原始維管細(xì)胞處于莖部維管系統(tǒng)中光感知和信號(hào)傳導(dǎo)的中心（圖4a）滤愕。

木質(zhì)部和韌皮部在黑暗和光照的條件有都有所形成温算。維管束的軌跡分析結(jié)果表明有2個(gè)分化方向，一個(gè)是望韌皮部间影，一個(gè)是望木質(zhì)部（圖4c）注竿。并且韌皮部在1h光照處理后細(xì)胞比例明顯增加。為了全面研究特定于維管細(xì)胞的響應(yīng)基因魂贬，作者利用上述WGCNA寄過篩選出了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中具有更高特征值的維管組基因模塊巩割。其中模塊ME52含有119個(gè)基因，并且只在維管束細(xì)胞中被誘導(dǎo)（圖4d）付燥。其中作者闡述了幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子宣谈，它們?cè)陧g皮部發(fā)育中可能具有重要而新穎的功能。

圖4

4.?光通過軌跡轉(zhuǎn)換促進(jìn)氣孔細(xì)胞的發(fā)育

與維管細(xì)胞不同键科，子葉表皮細(xì)胞亞型在由暗生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱辽L(zhǎng)狀態(tài)的過程中經(jīng)歷了巨大的狀態(tài)轉(zhuǎn)變（圖1f）闻丑。其中E.C.3類則是相對(duì)穩(wěn)定的。作者將E.C3簇細(xì)胞注釋為氣孔細(xì)胞（GC）勋颖。研究表明嗦嗡，三個(gè)氣孔譜系（SL）特異性堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子的順序表達(dá)促進(jìn)原表皮細(xì)胞（PDC）向成熟氣孔細(xì)胞的發(fā)育。然而饭玲，所有軌跡都是在亮生長(zhǎng)的幼苗表皮細(xì)胞中重建的侥祭。

為了解決暗和光引起的發(fā)育軌跡變化，作者首先重建了暗和光中SL細(xì)胞圖譜（圖5a-5d）茄厘。研究表明矮冬，發(fā)育方向從SL2開始，經(jīng)過SL3最終發(fā)展成SL4和SL5次哈，這與以往的研究一致胎署。通過相同的管道，對(duì)于暗生長(zhǎng)條件下的SL細(xì)胞繪制了不同的情景窑滞。盡管M細(xì)胞與SL2聚類并且靠近琼牧，但未出現(xiàn)在前體細(xì)胞和GC的交界位置径筏。RNA速率推斷的軌跡方向表明，在暗中GC是從前體細(xì)胞直接發(fā)育而來的障陶，而不是通過M細(xì)胞狀態(tài)。使用脫黑素樣本的表皮細(xì)胞更清晰地描繪了通往GC的兩個(gè)不同的發(fā)育軌跡聊训。發(fā)育過程始于顏色較深的前體細(xì)胞抱究，經(jīng)過M細(xì)胞（SL3）或直接發(fā)育成GC（SL5）。值得注意的是带斑，通往GC的直接路徑僅在暗生長(zhǎng)的幼苗樣本中豐富鼓寺。因此，作者推斷表皮細(xì)胞可以在暗中發(fā)育為GC勋磕，但是通過完全不同的軌跡妈候。這與報(bào)道的也是相吻合的，比如早期SL發(fā)育的marker基因挂滓，SPCH和BASL苦银，主要在SL3中表達(dá)。

為了探索氣孔細(xì)胞在黑暗和光照條件下的發(fā)育過程赶站，將典型亮光軌跡和暗生長(zhǎng)特異直接軌跡的細(xì)胞與其他細(xì)胞分開幔虏，并根據(jù)擬時(shí)序一步排序。在合并的表皮細(xì)胞圖譜上標(biāo)識(shí)了參與各自發(fā)育過程的候選因子贝椿。研究表明想括，圖譜包括三條路徑，即暗生長(zhǎng)特異軌跡到氣孔細(xì)胞烙博、典型亮光軌跡到氣孔細(xì)胞以及氣孔前體細(xì)胞的脫黑過程（圖5和5f）瑟蜈。候選調(diào)節(jié)因子在不同光照條件下對(duì)氣孔細(xì)胞發(fā)育和成熟的關(guān)鍵作用需要進(jìn)一步研究（圖5g）。最后作者總結(jié)了一個(gè)氣孔發(fā)育的模型（圖5h）渣窜。

圖5

5. PIFs的細(xì)胞類型特異性功能

PIF轉(zhuǎn)錄因子是參與光形態(tài)發(fā)生的核心負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子之一铺根。作者通過單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)黑暗生長(zhǎng)的PIFq和WT幼苗的莖組織進(jìn)行了分析（圖6a-b）。研究表明图毕，與WT相比夷都，表皮和葉肉細(xì)胞的比例增加，而導(dǎo)管予颤、內(nèi)皮和皮層細(xì)胞的比例減少囤官。和前面dark的數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，cortex2只在WT和pifq的合并數(shù)據(jù)中出現(xiàn)（圖6c-d）蛤虐。

作者確定了PIFq和WT之間的差異表達(dá)基因党饮。通過PIFs的突變體發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)抑制在生長(zhǎng)素響應(yīng)途徑中富集驳庭，而表達(dá)激活廣泛存在于光合作用基因中（圖6f-6g）刑顺。

為了研究PIFs在細(xì)胞狀態(tài)變化中的直接作用氯窍，作者在單細(xì)胞水平鑒定了PIFs靶基因的表達(dá)。超過四分之一(71/276)的PIF高表達(dá)直接靶基因在內(nèi)胚層細(xì)胞中得到高轉(zhuǎn)錄蹲堂，PIF誘導(dǎo)的表達(dá)下降突變?cè)谒屑?xì)胞類型中相似（圖6h）狼讨。此外，MMCs和GCs特異性表達(dá)差異顯著柒竞。因此政供，作者分析了PIFq和WT的表皮細(xì)胞的發(fā)育軌跡（圖6i和6j）。PIFq樣品中的氣孔細(xì)胞系細(xì)胞在GC發(fā)育的成熟狀態(tài)中富集（說實(shí)話從圖中沒太看出來）朽基。鑒定了GC發(fā)育過程中的差異表達(dá)基因和PIF直接靶基因的表達(dá)模式（圖6k）布隔。這些靶標(biāo)在GC發(fā)育和成熟的特定階段被轉(zhuǎn)錄。此外稼虎，在PIFq突變體中衅檀，成熟階段高度轉(zhuǎn)錄的靶標(biāo)的表達(dá)誘導(dǎo)得到了增強(qiáng)。在黑暗條件下霎俩，PIFs促進(jìn)胚乳生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的表達(dá)哀军，但抑制氣孔系細(xì)胞的GC成熟因子，通過細(xì)胞類型特異性表達(dá)靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)獨(dú)立調(diào)控打却。

圖6

圖6

6. 不同的芽細(xì)胞類型對(duì)光線的不同反應(yīng)

然后作者又用了一個(gè)單獨(dú)的章節(jié)從global的角度對(duì)比了一下各個(gè)細(xì)胞類型對(duì)于光照的響應(yīng)排苍。