導(dǎo)讀由擬輪枝鐮孢（Fusarium verticillioides请琳，F(xiàn)v）引起的莖腐病是玉米生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一扁誓。根系對(duì)Fv入侵的防御反應(yīng)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育非常重要凸丸。剖析根細(xì)胞類型對(duì)Fv感染的特異性反應(yīng)及其潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將有助于了解玉米根系對(duì)Fv入侵的防御機(jī)制绅络。在****本研究中****挨队，****研究者****報(bào)告了接種Fv和模擬條件的兩個(gè)玉米近交系根尖上29217個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組弧可，并確定了7種主要細(xì)胞類型和21個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的細(xì)胞簇蔑匣。通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，研究者從4049個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）中確定了12個(gè)Fv響應(yīng)調(diào)控模塊棕诵，這些模塊在這七種細(xì)胞類型中被Fv感染激活或抑制裁良。利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法，研究者整合了細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組中由Fv誘導(dǎo)的DEGs校套、16個(gè)已知的玉米抗病基因价脾、5個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因（ZmWOX5b、ZmPIN1a笛匙、ZmPAL6侨把、ZmCCoAOMT2和ZmCOMT）以及42個(gè)與Fv抗性相關(guān)的QTL或QTN預(yù)測(cè)基因，構(gòu)建了6個(gè)細(xì)胞類型特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)妹孙。綜上所述秋柄，本****研究不僅提供了根系發(fā)育過(guò)程中玉米細(xì)胞命運(yùn)決定的全局視角，而且還以單細(xì)胞分辨率深入揭示了玉米根尖主要細(xì)胞類型的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)蠢正，從而為剖析玉米抗病性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)骇笔。
****論文ID****
原名：Single-cell RNA sequencing profiles reveal cell typespecific transcriptional regulation networks conditioning fungal invasion in maize roots
譯名：單細(xì)胞RNA測(cè)序圖譜揭示了調(diào)控玉米根部真菌入侵的細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
結(jié)果
1 擬輪枝鐮孢菌在玉米幼苗根系中的感染性建立
與玉米莖腐病抗性近交系Qi319相比，玉米易感莖腐病的近交系B104植株在接種Fv后，根部和莖稈內(nèi)部的腐爛癥狀更為嚴(yán)重（圖1a）笨触，SRSA（莖腐病平均得分）和DSI（病害嚴(yán)重性指數(shù)）也顯著增加（圖1b）懦傍。為了觀察Fv在玉米根內(nèi)的增殖過(guò)程，****研究者****將Fv菌絲接種于Qi319和B104兩個(gè)品系的主根尖旭旭，并在26****℃****下培養(yǎng)。兩個(gè)品系的病害嚴(yán)重程度和病害發(fā)展速度各不相同葱跋。就Qi319而言持寄，直到接種后36小時(shí)（hpi），根部的病變區(qū)域才出現(xiàn)輕微病變娱俺，病根總體健康稍味，病變輕微，呈淺褐色荠卷，到48小時(shí)（hpi）病變未出現(xiàn)萎縮癥狀模庐。與此相反，受感染的B104根早在18 hpi就出現(xiàn)了淺褐色病斑油宜，并逐漸擴(kuò)大掂碱，在36至48 hpi長(zhǎng)達(dá)約10mm，導(dǎo)致約80%的B104根在48 hpi前出現(xiàn)深褐色的嚴(yán)重壞死病斑慎冤，并出現(xiàn)萎縮癥狀（圖1c疼燥，圖S1a-h）。在24和48 hpi時(shí)蚁堤，B104根的平均DSI分別為Qi319根的5.58倍和2.32倍醉者，明顯高于Qi319根（圖1d）。
雖然莖腐病菌Fv直接接種到根尖（包括RAM）披诗，但在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)撬即，病害癥狀總是出現(xiàn)在根尖上部，而不是RAM上部（圖1c呈队，圖S1a-h）剥槐。實(shí)際上，在48 hpi時(shí)宪摧，病部位于菌絲接種塞的位置（圖S1h）才沧。隨著時(shí)間的推移，病害擴(kuò)展到接種根的中部绍刮。為了證實(shí)觀察結(jié)果并評(píng)估玉米根部癥狀發(fā)展與Fv定殖之間的聯(lián)系温圆，采用WGA-AF488（小麥胚芽凝集素-Alexa****Fluor488共軛物）染色法監(jiān)測(cè)Fv菌絲的擴(kuò)散。Fv的縱向遷移是通過(guò)測(cè)量根尖與菌絲之間的距離（DTH）來(lái)評(píng)估的孩革，而WGA信號(hào)則是通過(guò)測(cè)量綠色熒光的面積密度[IOD（綜合光密度）/面積]來(lái)評(píng)估的岁歉。
對(duì)于Qi319來(lái)說(shuō)，到48 hpi時(shí)，F(xiàn)v菌絲主要在根尖上方約10-12mm的內(nèi)皮層和周緣區(qū)域被檢測(cè)到锅移，在接種根的下部沒(méi)有觀察到菌絲熔掺。然而，在相同的時(shí)間跨度內(nèi)非剃，接種的B104根中的菌絲比Qi319根中的菌絲擴(kuò)散得更快置逻、更廣（圖1e,f）。在距離B104根尖近6-12mm的位置捕捉到了Fv菌絲的入侵备绽，其中擴(kuò)散區(qū)域包括根的莖干券坞、內(nèi)皮和表皮，在縱向切片的上部肺素，甚至部分皮層也充滿了Fv菌絲（圖1e,f）恨锚。在分別距根尖約7mm和12mm處采集的橫向切片染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些觀察結(jié)果（圖1g,h）。
研究者****通過(guò)研究葉片和根系對(duì)Fv侵染的生理生化指標(biāo)的變化（圖1i-k）倍靡，也對(duì)這兩個(gè)近交系進(jìn)行了表征猴伶。一般來(lái)說(shuō)，B104幼苗在受到Fv感染后塌西，ROS（活性氧）包括H2O2和MDA（丙二醛）的水平較高（圖1i1他挎，圖S1i），而在Qi319幼苗上觀察到CAT（過(guò)氧化氫酶）捡需、POD（過(guò)氧化物酶）雇盖、SOD（超氧化物歧化酶）和PPO（多酚氧化酶）等抗氧化酶的活性較高（圖1j）。同樣栖忠，抗性品系Qi319的ROS清除劑脯氨酸的含量在Fv感染后也有所增加（圖1i2）崔挖。此外，與B104幼苗相比庵寞，Qi319幼苗暴露于Fv后總蛋白（TP）和水溶性糖（WSS）的濃度狸相、苯丙氨酸氨解酶（PAL）的活性以及木質(zhì)素（PAL相關(guān)代謝物之一）的含量都有更大幅度的增加（圖1k，圖S1i）捐川。
總之脓鹃，在抗性品系（Qi319）和易感品系（B104）的接種根中，F(xiàn)v只在RAM區(qū)域上方擴(kuò)散古沥，這表明包括干細(xì)胞和QC在內(nèi)的RAM對(duì)Fv的入侵具有抗性瘸右。因此，本研究在48**** hpi****采集了根尖約5mm長(zhǎng)的根組織岩齿，這些根組織沒(méi)有Fv侵染太颤，包含根冠****（****RC****）****、根尖分生組織****（****RAM****）****和伸長(zhǎng)區(qū)****（****EZ****）****盹沈，并用于隨后的scRNA-seq分析龄章。
圖1.擬輪枝鐮孢菌（Fv）在玉米幼苗根部的感染建立過(guò)程。（a）抗性（Qi319）和易感（B104）玉米植株莖稈受Fv感染后的縱切面圖像。（b）通過(guò)計(jì)算莖稈腐爛平均得分（SRSA）和病害嚴(yán)重程度指數(shù)（DSI）做裙，比較Qi319和B104玉米植株的莖稈腐爛抗性岗憋。（c）玉米幼苗根部在48 hpi感染Fv后出現(xiàn)的腐爛癥狀。虛線框內(nèi)的圖像是紅色箭頭所指病根區(qū)域的放大圖锚贱。比例尺=2cm（虛線框內(nèi)為5mm）仔戈。（d）Qi319和B104分別在24和48 hpi時(shí)的DSI比較。（e-h）48 hpi時(shí)通過(guò)WGA-AF488染色監(jiān)測(cè)Fv菌絲的擴(kuò)散拧廊。用WGA-AF488對(duì)Fvin接種的玉米根進(jìn)行染色后监徘，F(xiàn)v菌絲呈綠色，而用碘化丙啶（PI）對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行染色后卦绣，則呈紅色耐量。觀察方法是分別對(duì)長(zhǎng)度為10-12mm飞蚓、厚度為5μm的縱向切片（e）和距根尖約7和12mm的橫向切片（g）進(jìn)行染色滤港。通過(guò)測(cè)量根尖與菌絲（DTH）前進(jìn)前線（f）之間的距離來(lái)評(píng)估Fv的縱向遷移。通過(guò)測(cè)量綠色熒光的面積密度來(lái)評(píng)估縱向切片（f）和橫截面（h）的WGA信號(hào)趴拧。面積密度以每面積的IOD（綜合光學(xué)密度）表示溅漾。比例尺=1mm（e）和300μm（g）。（i-k）Fv接種后Qi319和B104生理生化指標(biāo)的測(cè)定著榴。分別在接種后0添履、12、24脑又、36和48小時(shí)收獲Fv和模擬（MK）接種的根（R）和葉（L）暮胧。（i）過(guò)氧化氫（H2O2）含量（i1）和ROS清除劑脯氨酸含量（i2）；（j）抗氧化酶活性问麸，包括過(guò)氧化氫酶（CAT）（j1）往衷、過(guò)氧化物酶（POD）（j2）、超氧化物歧化酶（SOD）（j3）和多酚氧化酶（PPO）（j4）严卖；（k）苯丙氨酸氨解酶（PAL）活性（k1）和木質(zhì)素含量（k2）席舍。數(shù)值為平均SD值。對(duì)于（b）哮笆、（d）来颤、（f）和（h），P＜0.05稠肘、P＜0.01和****P＜0.001（配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)）福铅。對(duì)于（i-k），經(jīng)Tukey-Kramer檢驗(yàn)项阴，列上不同字母表示差異顯著（P＜0.05）本讥。
2 玉米根尖細(xì)胞圖譜的生成
為了對(duì)玉米根進(jìn)行scRNA-seq，****研究者****在48**** hpi****時(shí)從接種Fv的Qi319和B104幼苗根尖分離玉米原生質(zhì)體。用單細(xì)胞反應(yīng)試劑（圖S2a拷沸，表S1）初步混合了總共38145個(gè)細(xì)胞色查，并構(gòu)建了10×Genomicssc RNA-seq文庫(kù)（圖2a）。數(shù)據(jù)在細(xì)胞和基因水平上都進(jìn)行了篩選撞芍，最終形成了一個(gè)包含29217個(gè)細(xì)胞和32224個(gè)基因的文庫(kù)秧了，用于進(jìn)一步分析（表S1）。在8個(gè)樣本中序无，每個(gè)細(xì)胞的基因中位數(shù)從1456個(gè)到2699個(gè)不等验毡，每個(gè)細(xì)胞的唯一分子標(biāo)識(shí)符中位數(shù)從2245.5個(gè)到11005個(gè)不等（表S1）。兩個(gè)生物重復(fù)的scRNA-seq數(shù)據(jù)之間的高相關(guān)性（Spearmanr=0.94至0.97）表明數(shù)據(jù)質(zhì)量具有可重復(fù)性（圖S2b）帝嗡。此外晶通，scRNA-seq數(shù)據(jù)與塊根mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的相關(guān)性（r=0.69至0.75）也相對(duì)較高（圖S2b），表明scRNA-seq的可靠性和玉米根原生質(zhì)體提取的有效性哟玷。
線性降維后狮辽，研究者****使用t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）工具對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化和解釋。無(wú)監(jiān)督分析將玉米根細(xì)胞分為21個(gè)簇（圖2b）巢寡。經(jīng)過(guò)差異分析喉脖，在這21個(gè)簇中共鑒定和定義了1950個(gè)細(xì)胞類型標(biāo)記（表S2）。由于只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了標(biāo)記基因可用于區(qū)分玉米根細(xì)胞類型抑月，為緩解這一問(wèn)題树叽，研究者對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘，以確定在一個(gè)或兩個(gè)簇中高表達(dá)和特異表達(dá)的潛在標(biāo)記基因（圖2c谦絮、d题诵，表S2），并利用近期相關(guān)參考文獻(xiàn)中的可用信息選擇細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因层皱。為了在體內(nèi)驗(yàn)證候選標(biāo)記基因性锭，****研究者****進(jìn)行了RNA原位雜交，并確定了用于區(qū)分玉米根細(xì)胞類型的可靠的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記（圖2e奶甘、f篷店，圖S3）。
例如臭家，bZIP17疲陕、TIP1-1、Zm00001d003283和Zm00001d017508在皮層細(xì)胞中特異表達(dá)钉赁；Zm00001d046187在內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)蹄殃；Zm00001d033711在表皮細(xì)胞中特異表達(dá)；Zm00001d049683你踩、UCC3和Zm00001d051333在中柱細(xì)胞中特異表達(dá)诅岩。半胱氨酸蛋白酶5（CCP5）和Zm00001d032501只在中木質(zhì)部細(xì)胞中表達(dá)（圖2e讳苦、f；圖S3）吩谦。木質(zhì)部半胱氨酸肽酶1（XCP1）和與CCP5同源的XCP2是擬南芥中編碼木質(zhì)部特異性半胱氨酸蛋白酶的基因鸳谜。此外，在之前的研究中式廷，CCP5也被用作中木質(zhì)部的標(biāo)記基因（表S3）咐扭。同時(shí)，38個(gè)標(biāo)記基因在一個(gè)或幾個(gè)群中特異表達(dá)滑废，因此可用于根細(xì)胞類型的分類（圖2d）蝗肪。例如，木質(zhì)部標(biāo)記基因纖維素合成酶13（CESA13）在第19簇中特異表達(dá)（圖2d蠕趁，表S3）薛闪，之前的一項(xiàng)研究一致。
組蛋白基因H4C7俺陋、H4C7.2和his2b1在第18簇（RAM）中高積累豁延，Zm00001d020794和Zm00001d049606在第13組（RC）中高表達(dá)（圖2c、e倔韭，圖S3b术浪、c）瓢对。據(jù)報(bào)道寿酌，一系列組蛋白基因也參與了RAM的發(fā)育。此外硕蛹，RAM和RC簇間DEGs的GO和KEGG功能差異也證明了它們各自的細(xì)胞命運(yùn)醇疼。具體來(lái)說(shuō)，相對(duì)于簇18法焰，簇13上調(diào)的DEGs顯著富集于17個(gè)生物過(guò)程（如：核小體組裝秧荆、染色質(zhì)組織、核糖體組裝等）埃仪、圖S2c乙濒，表S4）。相反卵蛉，相對(duì)于簇13颁股，簇18上調(diào)的DEGs顯著參與了與RC發(fā)育相關(guān)的50個(gè)GO生物過(guò)程和一個(gè)KEGG通路（圖S2d，表S4）傻丝。
總之甘有，使用t-SNE投影法發(fā)現(xiàn)了七大細(xì)胞群，包括皮層（簇0葡缰、1亏掀、6忱反、8、9滤愕、11温算、12、15和16）间影、內(nèi)皮層（簇5和17）米者、表皮層（簇2、4和7）宇智、****中柱****層（簇3蔓搞、10、14和20）随橘、木質(zhì)部（簇19）喂分、RAM（簇18）和RC（簇13）（圖2g）。皮層是最大的細(xì)胞群机蔗，包含14305個(gè)細(xì)胞蒲祈。中柱層、內(nèi)皮層和表皮層是主要的細(xì)胞群萝嘁，包含2588到6123個(gè)細(xì)胞梆掸，而在RC、中木質(zhì)部和RAM中觀察到少量細(xì)胞（413-758個(gè)）牙言。在每種同源細(xì)胞類型中酸钦，研究者發(fā)現(xiàn)在Fv處理和模擬條件下，B104和Qi319七種細(xì)胞類型共有79%-95%的表達(dá)基因（圖S2e,f）咱枉。
圖2.單細(xì)胞RNA-seq和玉米根尖細(xì)胞類型聚類注釋卑硫。（a）玉米根尖scRNA-seq和細(xì)胞類型聚類注釋流程圖概覽。分別在Fv接種或模擬侵染后48小時(shí)從玉米Qi319和B104幼苗的5mm根尖分離原生質(zhì)體蚕断。使用10×Genomics平臺(tái)生成scRNA-seq文庫(kù)欢伏，然后進(jìn)行高通量測(cè)序。（b）利用t-SNE對(duì)玉米根尖的21個(gè)細(xì)胞簇進(jìn)行可視化亿乳。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞硝拧。顏色代表不同的細(xì)胞簇。（c）利用原位雜交驗(yàn)證的26個(gè)細(xì)胞簇特異性標(biāo)記基因的表達(dá)模式葛假。點(diǎn)直徑代表特定基因在一個(gè)特定細(xì)胞簇中的表達(dá)比例障陶，顏色代表它們?cè)谶@些細(xì)胞簇中的相對(duì)表達(dá)水平。（d）21個(gè)細(xì)胞簇中38個(gè)具有代表性的細(xì)胞簇特異性標(biāo)記基因的表達(dá)模式桐款。（e-f）RNA原位雜交驗(yàn)證了Qi319和B104根中分別推測(cè)的RAM（根尖分生組織）和RC（根冠）區(qū)域（e）以及表皮咸这、皮層、內(nèi)皮魔眨、中柱和木質(zhì)部（f）的代表性細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因媳维。（e）和（f）中的比例尺分別為200μm和150μm酿雪。（g）利用t-SNE對(duì)玉米根尖中的七大種群及其空間分布進(jìn)行可視化分析。
3 玉米根系中RAM和RC的分化軌跡
研究者****利用scRNA-seq技術(shù)可以探索植物細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)和連續(xù)分化軌跡侄刽。單子葉植物和雙子葉植物在植物地組織和根冠的分化上存在較大差異指黎，即遠(yuǎn)端莖細(xì)胞產(chǎn)生根冠，QC側(cè)的側(cè)根冠細(xì)胞產(chǎn)生表皮州丹，單子葉植物的地組織和表皮屬于一個(gè)共同的初始醋安，而雙子葉植物的側(cè)根冠和表皮共享一個(gè)共同的初始細(xì)胞。因此墓毒，研究者****嘗試?yán)?***擬時(shí)序****分析法吓揪，根據(jù)RAM和RC所代表的細(xì)胞群推斷其分化軌跡。通過(guò)****擬時(shí)序****分析研究了RAM和RC細(xì)胞的分化軌跡所计，結(jié)果顯示RC的分化晚于RAM（圖3a,b）茸俭。這些結(jié)果支持了本研究中玉米根部scRNA-seq和細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性痘系。
為了確定****調(diào)****控RAM和RC細(xì)胞之間分化轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因澎剥，****研究者****進(jìn)行了分支表達(dá)分析建模疤苹，該方法使用懲罰性樣條來(lái)推斷單個(gè)基因的分支時(shí)間。RAM和RC之間的分化軌跡有三個(gè)分支點(diǎn)踪栋，分別標(biāo)記為1焙格、2和3（圖3c-e）。研究者****調(diào)查了每個(gè)分支點(diǎn)的前100個(gè)顯著變化基因夷都，并展示了其代表基因眷唉。對(duì)于每個(gè)分支點(diǎn)，這些基因都分為四個(gè)基因簇损肛，其基因表達(dá)模式各不相同厢破，表現(xiàn)出根發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄重排（圖3c-e）荣瑟。在RAM和RC的分化過(guò)程中治拿，24和43個(gè)組蛋白家族成員在分支點(diǎn)1和3發(fā)生了顯著變化，而在分支點(diǎn)2則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何變化（圖3c笆焰，e）劫谅。編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的8個(gè)基因和11個(gè)基因分別只在分支點(diǎn)1和2被觀察到（圖3c、d）嚷掠，這表明它們?cè)赗AM和RC細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用捏检。這些發(fā)現(xiàn)深入揭示了根細(xì)胞發(fā)育的動(dòng)態(tài)分化以及玉米根細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中關(guān)鍵基因表達(dá)的重新布線。
圖3.玉米根尖分生組織和根冠的分化軌跡不皆。（a）根尖分生組織（RAM）和根冠（RC）的彩色擬時(shí)軌跡贯城。b）RAM和RC擬時(shí)軌跡上的細(xì)胞分布。（c-e）熱圖顯示RAM和RC分化軌跡上三個(gè)分支點(diǎn)中顯著變化的前100個(gè)基因
4 Fv應(yīng)答基因在玉米基因型和根細(xì)胞類型中存在差異
為了確定Fv反應(yīng)基因霹娄，****研究者****對(duì)兩種基因型（Qi319和B104）中Fv處理和模擬條件下的七個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行了差異表達(dá)分析能犯。在兩種基因型的根細(xì)胞中鲫骗，共有4049個(gè)基因有顯著表達(dá)。在除莖外的七種細(xì)胞類型中踩晶，F(xiàn)v誘導(dǎo)的DEGs總數(shù)在Qi319中高于在B104中执泰。經(jīng)Fv侵染后，在Qi319的所有七種細(xì)胞類型中渡蜻，上調(diào)DEGs的數(shù)量（254-578）始終低于下調(diào)DEGs的數(shù)量（346-972）术吝。相比之下，在所有七種細(xì)胞類型中茸苇，B104在Fv侵襲下招募了更多的上調(diào)DEGs（圖S4a）排苍。
在B104和Qi319的至少兩種細(xì)胞類型中，67.69%-93.67%的Fv響應(yīng)基因是重疊的（圖S4b,c）学密，這表明不同類型的根細(xì)胞可以招募相同的基因來(lái)響應(yīng)Fv感染纪岁。其中，包括玉米抗蟲(chóng)性3（MIR3）则果、苯并惡嗪酮合成11（BX11）幔翰、萎縮1（Sh1）、枯草蛋白-糜蛋白酶抑制劑同源物1（SCI1）西壮、Zm00001d034382和Zm00001d031677在內(nèi)的6個(gè)保守基因在Qi319和B104的所有7種細(xì)胞類型中受Fv感染時(shí)均有差異表達(dá)（圖S4d）遗增。值得注意的是，在易感株系B104的所有七種細(xì)胞類型中款青，這六個(gè)DEGs在Fv感染時(shí)均上調(diào)做修，但在抗性株系Qi319中幾乎被抑制（圖S4e）。在同一細(xì)胞類型中抡草，大多數(shù)對(duì)Fv反應(yīng)的DEGs都是B104或Qi319的特異性DEGs饰及，在Qi319和B104中，特異性DEGs的比例分別為67.5%-91.80%和57.91%-78.42%（圖S4f）康震。
Fv感染后燎含，大多數(shù)標(biāo)記基因在兩種基因型的相應(yīng)細(xì)胞類型中都出現(xiàn)了顯著的表達(dá)變化（圖S5a,b）。例如腿短，bZIP17在兩種基因型的皮層細(xì)胞中均上調(diào)屏箍。CCP5在B104的偏木質(zhì)部細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異。在Qi319的RAM細(xì)胞中橘忱，H4C7.2和his2b1被高度激活赴魁，但在B104中卻被抑制。值得注意的是钝诚，****研究者****還發(fā)現(xiàn)32個(gè)已知的植物病害相關(guān)基因在B104和Qi319株系中有顯著的差異表達(dá)（圖S5c颖御，表S5）。這些基因中的大多數(shù)在Qi319的所有七種細(xì)胞類型中都在Fv感染后出現(xiàn)了顯著的差異表達(dá)凝颇，而在B104中只有少數(shù)基因出現(xiàn)了差異表達(dá)（圖S5c）潘拱。其中秉继，ZmPAL1在B104的所有七種細(xì)胞類型中都受到Fv感染后的高度誘導(dǎo)，但在Qi319除木質(zhì)部外的七種細(xì)胞類型中都受到顯著抑制泽铛。ZmCAT1尚辑、ZmLOX3和ZmLOX4在Qi319的幾乎七種細(xì)胞類型中都出現(xiàn)了下調(diào)。特別是盔腔，這4個(gè)基因在七種細(xì)胞類型中對(duì)Fv入侵的響應(yīng)差異表達(dá)譜與批量RNA-seq（圖S5c）和實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證（圖S6b,c）的結(jié)果基本一致杠茬。
為了確定Fv響應(yīng)的DEG是否參與了疾病相關(guān)通路，****研究者****進(jìn)行了GO和KEGG分析弛随。在所有七種細(xì)胞類型中瓢喉，60%-77.42%的GO項(xiàng)與苯丙酮、木質(zhì)素和類黃酮生物合成過(guò)程舀透、對(duì)真菌的防御反應(yīng)和致病機(jī)理等生物過(guò)程有關(guān)（圖S5d栓票，表S6），這些過(guò)程參與保護(hù)根系免受病原體侵害愕够。KEGG分析還顯示走贪，F(xiàn)v誘導(dǎo)的DEGs顯著富集于苯丙氨酸、苯丙氨酸和類黃酮生物合成途徑以及植物與病原體的相互作用中（圖S5e）惑芭。總之坠狡，這些發(fā)現(xiàn)表明，玉米根系的主要細(xì)胞類型在通過(guò)多種疾病相關(guān)途徑應(yīng)對(duì)Fv入侵方面發(fā)揮著重要作用遂跟。
5 7種根細(xì)胞類型中與關(guān)鍵基因調(diào)控因子的共表達(dá)調(diào)控模塊
為了定義共表達(dá)基因簇逃沿，****研究者****使用WGCNA軟件包對(duì)所有七種細(xì)胞類型中的4049個(gè)DEGs進(jìn)行了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示幻锁，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)由15個(gè)包含67至1297個(gè)基因的模塊（M1至M15）和一個(gè)未指定的模塊（M16）組成（圖4a凯亮，表S7）。有14個(gè)模塊（M1-7和M9-15）與B104和Qi319的七種細(xì)胞類型在Fv入侵和模擬后有顯著相關(guān)性哄尔，r值在0.41至0.85之間假消。其中，8個(gè)（M1-4究飞、6置谦、7、12和15）和12個(gè)（M1亿傅、2、4-7和9-14）（圖4b）模塊分別與模擬和Fv處理顯著相關(guān)（表S7）瘟栖。這些重要的模塊大多是一種細(xì)胞類型所特有的葵擎。例如，在模擬條件下半哟，M3和M15分別與B104根的內(nèi)皮細(xì)胞和Qi319根的皮層細(xì)胞特異相關(guān)酬滤。當(dāng)Fv入侵時(shí)签餐，M11、M13和M14模塊分別與Qi319根的木質(zhì)部細(xì)胞盯串、表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞特異性相關(guān)氯檐。七個(gè)模塊（M1、2体捏、4冠摄、6、7几缭、9和12）與代表不同細(xì)胞類型河泳、基因型或處理的兩個(gè)或三個(gè)樣本顯著相關(guān)（表S7）。
研究者還發(fā)現(xiàn)年栓，圖2c,d中顯示的大多數(shù)標(biāo)記基因都通過(guò)WGCNA被聚類到了相應(yīng)的細(xì)胞類型中（圖4b）拆挥。特別是在代表RAM的M6模塊中發(fā)現(xiàn)了五個(gè)組蛋白基因H4C7、H4C7.2某抓、H4C7.3纸兔、his2b1和his2B4。在這一模塊中否副，有48個(gè)DEGs是組蛋白基因食拜，占所有DEGs的58.54%，凸顯了組蛋白家族在RAM發(fā)育過(guò)程中的作用（表S7）副编。這一發(fā)現(xiàn)表明负甸，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可用于根據(jù)標(biāo)記基因在某些細(xì)胞類型中的表達(dá)模式對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行分類。
在Fv響應(yīng)模塊中痹届，發(fā)現(xiàn)了41個(gè)標(biāo)記基因和19個(gè)已報(bào)道的抗性基因（表S7）呻待。此外，通過(guò)整合已發(fā)表的與玉米鐮刀菌穗腐捕痈（FER）和其他24種病害（病原體）相關(guān)的QTL和QTN蚕捉，****研究者****發(fā)現(xiàn)在4049個(gè)Fv誘導(dǎo)的DEGs、先前發(fā)表的85個(gè)QTL簇和358個(gè)QTN簇（圖S5f柴淘，表S8）中迫淹，195個(gè)重疊基因中有86個(gè)基因參與了Fv響應(yīng)共表達(dá)模塊。兩個(gè)抗性基因（ZmCHTA1和ZmHCT2）和12個(gè)QTL/QTN預(yù)測(cè)基因在玉米根細(xì)胞分化和發(fā)育的不同分支點(diǎn)有顯著差異表達(dá)（圖3e-j为严，表S6）敛熬。因此，這些基因可能是單細(xì)胞分辨率下響應(yīng)Fv感染的關(guān)鍵遺傳因素第股。
闡明基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）對(duì)于了解植物保護(hù)機(jī)制以應(yīng)對(duì)病害感染至關(guān)重要应民。研究者****利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法GENIE3預(yù)測(cè)了148個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子的靶基因，包括19個(gè)已報(bào)道的抗性基因（ABP1也是一個(gè)標(biāo)記基因）、86個(gè)QTL/QTN預(yù)測(cè)基因诲锹、41個(gè)標(biāo)記基因（包括ABP1）繁仁、ZmWOX5b、ZmPIN1a和ZmYUC6在每個(gè)重要的Fv響應(yīng)模塊中的作用（表S9）归园。特別是在M11和M12中觀察到了許多調(diào)控基因及其復(fù)雜的GRN黄虱，它們都對(duì)應(yīng)于木質(zhì)部細(xì)胞（表S9）。研究者****在圖4b中使用Cytoscape展示了它們的GRN庸诱。
特別是uaz248a（his3）捻浦，一個(gè)QTL/QTN預(yù)測(cè)的Fv響應(yīng)基因（表S7），可能與RAM細(xì)胞模塊M6中的3個(gè)標(biāo)記基因（H4C7偶翅、his2b1和H4C7.2）默勾、ZmPIN1a和ZmWOX5b相互作用（圖4b，表S9）聚谁。之前的一項(xiàng)研究表明母剥，WOX11（ZmWOX5b的同源物）在水稻芽發(fā)育過(guò)程中招募組蛋白H3K27me3去甲基化酶促進(jìn)基因表達(dá)。PIN基因（至少是PIN1）的時(shí)空表達(dá)受到H3K27甲基化和去甲基化的微調(diào)形导，兩者相互協(xié)調(diào)以確保側(cè)根器官的正常發(fā)生环疼。這些結(jié)果表明，GRN分析對(duì)于鑒定潛在的抗病基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義朵耕。
圖4.Fv感染后七種根細(xì)胞類型中關(guān)鍵基因調(diào)控因子的共表達(dá)調(diào)控模塊炫隶。（a）Fv感染和模擬接種后，與B104和Qi319根尖各細(xì)胞類型相關(guān)的16個(gè)共表達(dá)模塊阎曹。括號(hào)中的數(shù)字表示每個(gè)模塊中基因的數(shù)量伪阶。紅色和藍(lán)色分別代表高相關(guān)系數(shù)值和低相關(guān)系數(shù)值（Pearson）。M16表示未分配的模塊处嫌。MK栅贴，模擬；RAM熏迹，根尖分生組織檐薯；RC，根冠注暗。（b）12個(gè)基因調(diào)控模塊坛缕，其中包含GENIE3對(duì)Fv感染做出響應(yīng)的關(guān)鍵基因調(diào)控因子。每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因捆昏，表現(xiàn)出調(diào)控關(guān)系的基因用邊連接赚楚。紅色代表Fv響應(yīng)調(diào)控模塊和關(guān)鍵調(diào)控因子，其他顏色代表受這些關(guān)鍵調(diào)控因子調(diào)控的預(yù)測(cè)靶基因屡立。有注釋的靶基因用Cytoscape顯示（表S9）直晨。表S7中五個(gè)調(diào)控基因（ZmFNS1搀军、ZmAPX2膨俐、INCW1勇皇、TUB6和Zm00001d048667）的預(yù)測(cè)靶基因未找到。表S9中WAT1焚刺、Zm00001d032517敛摘、Zm00001d016664、Zm00001d048908和Zm00001d001862的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未顯示乳愉。
6 ZmWOX5b和ZmPIN1a通過(guò)調(diào)控IAA信號(hào)通路抑制玉米R(shí)AM中Fv的入侵
植物莖干細(xì)胞及其頂端分生組織中不斷分化的子細(xì)胞有望保護(hù)細(xì)胞的完整性兄淫，防止生物入侵。本研究觀察到的RAM不受Fv感染的特征促使****研究者****探索其潛在的分子機(jī)制蔓姚。研究發(fā)現(xiàn)捕虽，在Fv入侵時(shí)，ZmWOX5b和ZmPIN1a在RAM細(xì)胞中上調(diào)坡脐，因此推測(cè)它們是Fv響應(yīng)調(diào)控模塊M6的關(guān)鍵基因（圖4b泄私，圖S6a）。為了檢驗(yàn)ZmWOX5b和ZmPIN1a是否參與了玉米R(shí)AM中宿主抵御Fv入侵的過(guò)程备闲，研究人員通過(guò)融合原生基因和35S啟動(dòng)子（圖S7a,b）并將其分別轉(zhuǎn)化到近交系B104中晌端，產(chǎn)生了增強(qiáng)ZmWOX5b和ZmPIN1a表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米植株（圖S7a,b）。獲得了同源品系WE8-6和WE12-2（增強(qiáng)ZmWOX5b的表達(dá)）以及PE6-2和PE10-4（增強(qiáng)ZmPIN1a的表達(dá)）恬砂，并繁殖到T4代（圖S7c,d）咧纠，用于后續(xù)分析。這四個(gè)過(guò)表達(dá)株系（顯示為WE+和PE+）的ZmWOX5b和ZmPIN1a表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因同胞（WE-和PE-）高出26至33倍（圖S7e,f）泻骤。這一結(jié)果得到了RNA原位雜交和GFP觀察的證實(shí)（圖5a,b）漆羔。此外，利用RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的ZmWOX5b和ZmPIN1a沉默也獲得了轉(zhuǎn)基因玉米（WR****+****和PR****+****）（圖S7g,h）狱掂，其中四個(gè)代表性的同源系WR2-6演痒、WR3-4、PR6-1和PR7-4（圖S7i,j）顯示ZmWOX5b和ZmPIN1a的表達(dá)顯著降低（圖S7k,l）符欠。
真菌感染后嫡霞，ZmWOX5b和ZmPIN1a的增強(qiáng)表達(dá)株比非轉(zhuǎn)基因株生根更深，主根和精根更長(zhǎng)（圖5c,d1,d3）希柿。相反诊沪，與轉(zhuǎn)基因陰性同系相比，四個(gè)RNAi株系的主根和須根生長(zhǎng)明顯受阻（圖5c,d2,d4）曾撤。同時(shí)端姚，過(guò)表達(dá)ZmWOX5b和ZmPIN1a能顯著延緩Fv入侵時(shí)主根根腐病癥狀的發(fā)展。在Fv感染48 hpi時(shí)挤悉，4個(gè)過(guò)表達(dá)株系的幼苗根系普遍表現(xiàn)出輕微的腐爛癥狀渐裸，如淺褐色病斑，而非轉(zhuǎn)基因株系的幼苗根系則表現(xiàn)出嚴(yán)重的腐爛癥狀，如深褐色病斑和根系萎縮昏鹃。相比之下尚氛，RNAi陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的腐爛癥狀比轉(zhuǎn)基因陰性植株更為嚴(yán)重（圖5c）。因此洞渤，四株過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗的DSI值大大低于其非轉(zhuǎn)基因兄弟姐妹阅嘶，而四株RNAi株系的DSI值則明顯高于其轉(zhuǎn)基因陰性兄弟姐妹（圖5e1、e2）载迄。因此讯柔，ZmWOX5b和ZmPIN1a的過(guò)表達(dá)分別導(dǎo)致在真菌接種后玉米抗病相關(guān)標(biāo)記基因的顯著誘導(dǎo)（圖S8）。
此外护昧，****研究者****使用WGA染色法研究了Fv在玉米根中的定殖情況魂迄，發(fā)現(xiàn)在24 hpi時(shí)，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因根的上部維管束組織中僅可見(jiàn)少量Fv菌絲惋耙，但在RNAi轉(zhuǎn)基因品系中捣炬，大量Fv菌絲幾乎定殖于整個(gè)維管束組織，并擴(kuò)散至RAM的邊緣區(qū)（圖5f）怠晴。單位面積的DTH和IOD測(cè)量進(jìn)一步證實(shí)了這些觀察結(jié)果（圖5g）遥金。這些結(jié)果表明，ZmWOX5b和ZmPIN1a參與了玉米R(shí)AM的先天性抗真菌侵染蒜田。
為了探索ZmWOX5b和ZmPIN1a保護(hù)玉米根免受Fv侵染的潛在機(jī)制稿械，****研究者****采集了玉米根尖的不同區(qū)域，包括RC冲粤、RAM美莫、過(guò)渡區(qū)（TZ）、EZ和成熟區(qū)（MZ）梯捕，然后測(cè)定了它們的3-吲哚乙酸（IAA）含量厢呵。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比傀顾，ZmWOX5b和ZmPIN1a過(guò)表達(dá)株系根尖五個(gè)區(qū)域的IAA含量都明顯較高（圖5h1襟铭、h3），而RNAi陽(yáng)性株系根尖的IAA含量則明顯較低（圖5h2短曾、h4）寒砖。值得注意的是，根據(jù)不同區(qū)域的IAA含量觀察到根尖的IAA濃度梯度（圖5h,i）嫉拐。此外哩都，之前的一些研究報(bào)道WOX基因參與了芽和根干細(xì)胞維持過(guò)程中的輔助素信號(hào)傳導(dǎo)。為了檢測(cè)ZmWOX5b是否影響了輔助素的生物合成婉徘，****研究者****利用ZmWOX5b過(guò)度表達(dá)株的主根尖15mm區(qū)域測(cè)定了五個(gè)與IAA生物合成相關(guān)的ZmYUC基因（ZmYUC2漠嵌、4咐汞、5、6和9）的轉(zhuǎn)錄水平儒鹿。其中化撕，ZmYUC2和ZmYUC6的表達(dá)受到根尖段ZmWOX5b表達(dá)增強(qiáng)的顯著刺激（圖5j）。這些結(jié)果綜合表明挺身，ZmWOX5b和ZmPIN1a可通過(guò)調(diào)節(jié)IAA的生物合成抑制Fv在RAM中的感染侯谁，從而形成IAA濃度梯度锌仅，保護(hù)RAM不受Fv感染章钾，促進(jìn)玉米根的伸長(zhǎng)。
圖5.ZmWOX5b和ZmPIN1a通過(guò)調(diào)節(jié)IAA信號(hào)抑制Fv入侵玉米R(shí)AM热芹。（a）通過(guò)RNA原位雜交贱傀，觀察表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因事件（WE+8-6和PE+6-2）及其非轉(zhuǎn)基因事件根尖RAM中ZmWOX5b和ZmPIN1a的轉(zhuǎn)錄水平。標(biāo)尺=205μm伊脓。（b）用ZmWOX5b::GFP和ZmPIN1a::GFP融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因幼苗根系的GFP熒光顯示了它們?cè)赗AM中的表達(dá)府寒。比例尺=500μm。（c）Fv感染ZmWOX5b-和ZmPIN1a轉(zhuǎn)基因幼苗根系（WE+和PE+表示表達(dá)增強(qiáng)报腔；WR+和PR+表示RNAi）48 hpi時(shí)的腐爛癥狀株搔。虛線框內(nèi)的圖像是紅色箭頭所指病根區(qū)域的放大圖。比例尺=4cm纯蛾。（d）48 hpi時(shí)ZmWOX5b-和ZmPIN1a-增強(qiáng)表達(dá)（d1和d3）及RNAi（d2和d4）轉(zhuǎn)基因玉米幼苗主根和精根的長(zhǎng)度比較纤房。（e）在48 hpi時(shí)對(duì)ZmWOX5b-（e1）和ZmPIN1a-（e2）轉(zhuǎn)基因幼苗根的DSI進(jìn)行評(píng)估和比較，與WR+和PR+植株以及轉(zhuǎn)基因陰性植株（WE-翻诉、PE-炮姨、WR-和PR-）相比，WE+和PE+植株的DSI明顯降低碰煌。（f）在24 hpi時(shí)通過(guò)WGA-AF488染色監(jiān)測(cè)Fv真菌在轉(zhuǎn)基因幼苗根尖的定植情況舒岸。比例尺=500μm。（g）如（f）所示芦圾，通過(guò)測(cè)量根尖與菌絲（DTH）前進(jìn)前線（g1）之間的距離蛾派，測(cè)量ZmWOX5b-和ZmPIN1a轉(zhuǎn)基因幼苗根中Fv菌絲前進(jìn)的距離。通過(guò)計(jì)算綠色熒光的面積密度（即IOD）來(lái)評(píng)估縱向切片的WGA信號(hào)个少，以揭示根尖內(nèi)Fv的增殖過(guò)程（g2）洪乍。（h）ZmWOX5b和ZmPIN1a的表達(dá)增強(qiáng)提高了玉米根尖的IAA含量和輔助素濃度梯度。對(duì)根尖的不同區(qū)段（包括RC稍算、RAM典尾、TZ（過(guò)渡區(qū)）、EZ（伸長(zhǎng)區(qū)）和MZ（成熟區(qū)））進(jìn)行取樣糊探，并通過(guò)GC-MS測(cè)定ZmWOX5b高表達(dá)（h1）和-RNAi（h2）品系以及ZmPIN1a低表達(dá)（h3）和-RNAi（h4）品系的IAA含量钾埂。（i）漫畫(huà)提供了玉米根尖的示意圖河闰，顯示了不同區(qū)段和IAA濃度梯度。（j）從ZmWOX5b增強(qiáng)表達(dá)幼苗根尖5-10mm區(qū)域（ZmYUC2）（j1）和0-5mm部分（ZmYUC6）（j2）收集的與輔助素生物合成途徑相關(guān)的YUC基因的轉(zhuǎn)錄水平褥紫。（d）姜性、（e）、（g）髓考、（h）和（j）中的值為平均SD值部念。P＜0.05，P＜0.01氨菇，****P＜0.001（根據(jù)配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)）儡炼。
7 苯丙類途徑相關(guān)基因參與了多種根細(xì)胞的Fv防御
接種后，根細(xì)胞尤其是皮層查蓉、****中柱****和維管細(xì)胞中苯丙氨酸相關(guān)基因的差異表達(dá)（圖S5c和S6）促使****研究者****探索這些基因是否參與協(xié)調(diào)宿主防御以應(yīng)對(duì)微生物侵襲乌询。其中，ZmPAL6（在M4中）豌研、ZmCOMT（在M12中）和ZmCCoAOMT2（在M13中）在Fv入侵時(shí)出現(xiàn)在不同的GRN中（圖4b）妹田，****研究者****選擇了這些基因進(jìn)行病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS），以檢測(cè)它們?cè)诳拐婢肭种械臐撛谧饔?/strong>（表S10）鹃共。沉默效率測(cè)定結(jié)果表明鬼佣，與對(duì)照植株相比，ZmPAL6霜浴、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2的轉(zhuǎn)錄水平降低了80%-85%（圖6a-c）晶衷。在ZmCCoAOMT2-沉默植株中，與ZmCCoAOMT2有83%相同度的ZmCCoAOMT1的表達(dá)未受影響（圖6b2）坷随。同樣房铭，在ZmPAL6沉默植株中，ZmPAL1温眉、3和5的表達(dá)也未受到影響（圖6a2-a4）缸匪。因此，這三個(gè)基因的基因沉默系已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)类溢，可以進(jìn)行后續(xù)分析凌蔬。
7****dpi時(shí)，BMV-GFP和嵌合BMVCP5預(yù)接種的玉米Va35植株分別受到Fv侵染的挑戰(zhàn)闯冷。通過(guò)測(cè)量這些植株的腐爛癥狀和DSI砂心，****研究者****發(fā)現(xiàn)沉默ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2會(huì)促進(jìn)Fv在沉默植株根部的侵染蛇耀，并導(dǎo)致比對(duì)照根部更嚴(yán)重的腐爛癥狀（圖6d）辩诞。此外，DSI與腐爛癥狀的發(fā)展相一致纺涤，即通過(guò)VIGS在玉米植株根系中沉默這三個(gè)基因會(huì)導(dǎo)致DSI比對(duì)照根系增加約25%-35%（圖6e）译暂。此外抠忘，越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞壁受到病原體侵襲后外永，提供木質(zhì)素形成單木質(zhì)素的苯丙酮途徑會(huì)被大大觸發(fā)崎脉。
因此，****研究者****研究了Fv感染是否會(huì)增加木質(zhì)素的生物合成伯顶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)囚灼，當(dāng)受到Fv感染時(shí)，ZmPAL6-祭衩、ZmCOMT1-和ZmCCoAOMT2-沉默的玉米植物根積累的木質(zhì)素少于對(duì)照根（圖6f）灶体。為了進(jìn)一步探究這些植物根中木質(zhì)素沉積的分布情況，從緊鄰病害的下部根段制備了橫向超薄切片汪厨，這些切片沒(méi)有明顯的腐爛癥狀赃春，并用于Ma¨ule染色。在對(duì)照根的下胚層細(xì)胞中觀察到細(xì)胞壁木質(zhì)化或增厚劫乱，而在沉默根中沒(méi)有觀察到。此外锥涕，對(duì)照根的外胚層和維管柱中沉積了大量木質(zhì)素衷戈，而在沉默根的維管組織中觀察到的木質(zhì)素染色較弱（圖6g）。這些結(jié)果表明层坠，參與木質(zhì)素生物合成的酚類物質(zhì)可能會(huì)減緩或抑制Fv的繁殖殖妇。
許多PALs已被證明具有廣譜抗菌活性，也有助于宿主防御微生物感染破花。為了研究ZmPAL6是否會(huì)調(diào)節(jié)宿主對(duì)多種病原體的反應(yīng)谦趣，****研究者****考察了其對(duì)*****F.proliferatum*****（Fp）和*****Pythium******aristosporum*****（Pa）感染的沉默效應(yīng)，這兩種病原體也是玉米莖腐病的主要病原菌座每。通過(guò)測(cè)量DSI前鹅，沉默ZmPAL6能顯著促進(jìn)Fp和Pa在玉米根部的侵染（圖6h）。此外峭梳，PAL是水楊酸（SA）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶舰绘。研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v感染會(huì)增加SA的含量葱椭，但在ZmPAL6被沉默的植物根系中捂寿，SA的積累并沒(méi)有BMV-GFP感染植物根系中的嚴(yán)重增加（圖6i）。同樣孵运，敲除ZmPAL6會(huì)影響SA響應(yīng)基因ZmPR3秦陋、4、5和10的表達(dá)（圖6j）治笨。因此驳概，SA可通過(guò)PAL依賴性途徑合成粪小，F(xiàn)v誘導(dǎo)的SA積累可能是由于激活了苯丙氨酸途徑。
圖6.苯丙酮途徑相關(guān)基因參與幾種根細(xì)胞的Fv防御抡句。（a-e）通過(guò)BMV（錦毛花葉病毒）藥物VIGS（病毒誘導(dǎo)的基因沉默）抑制玉米植株中苯丙氨酸途徑相關(guān)基因的表達(dá)可促進(jìn)Fv感染探膊。分別在7 dpi和14 dpi測(cè)量了Fv感染葉片和根中ZmPAL6（a1至a4）、ZmCCoAOMT2（b1待榔、b2）和ZmCOMT（c）的沉默效率和特異性逞壁。在7 dpi時(shí)，BMV-GFP和嵌合BMV-CP5接種的Va35株苗受到Fv的侵染锐锣。Va35幼苗接受Fv挑戰(zhàn)腌闯，在48 hpi時(shí)記錄接種幼苗根部病害區(qū)域的癥狀（d），以及Fv接種玉米幼苗根部的莖腐病DSI（e）雕憔。（d）中的比例尺=4cm姿骏。（f）瞬時(shí)沉默ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2會(huì)影響Fv感染玉米植株的木質(zhì)素積累斤彼。（g）Fv感染后分瘦，木質(zhì)素在ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2被沉默的幼苗根中的組織化學(xué)定位琉苇。從緊鄰病害的下部根部切片制備橫向超薄切片嘲玫，然后進(jìn)行Ma¨ule染色。表皮層和維管柱細(xì)胞中的紫紅色染色表明存在S單元木質(zhì)素并扇。表皮下的最外層細(xì)胞被染成棕色去团，表明存在G單位木質(zhì)素（箭頭）。比例尺=100μm穷蛹。（h）48 hpi時(shí)接種莖腐真菌病原體Fusariumproliferatum（Fp）和Pythiumaristosporum（Pa）的ZmPAL6沉默玉米幼苗根的莖腐DSI土陪。（i-j）敲除ZmPAL6可減少水楊酸（SA）的積累并修復(fù)SA調(diào)控基因的表達(dá)。在48 hpi時(shí)從ZmPAL6沉默和Fv感染的玉米植株以及BMV-GFP預(yù)接種和Fvin感染的植株上收獲樣本肴熏，并進(jìn)一步用于測(cè)量SA含量（i）和檢測(cè)致病相關(guān)（PR）基因的表達(dá)（j）鬼雀。除（d和g）外，（a-j）中的數(shù)值均為平均值（SD）扮超。****P＜0.001（根據(jù)配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)）取刃，NS表示不顯著。列上不同字母表示差異顯著（P*＜0.05）（e和f）出刷，由Tukey-Kramer檢驗(yàn)確定璧疗。
8 玉米根系細(xì)胞類型特異性免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
圖4顯示了Fv感染在不同根細(xì)胞類型中誘導(dǎo)基因共表達(dá)模塊的程度，考慮到根細(xì)胞類型在生物脅迫響應(yīng)中的不同功能馁龟，基于細(xì)胞類型特異性免疫模塊的整合免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)于深入理解玉米根系防御真菌入侵的分子機(jī)制至關(guān)重要崩侠。在GRNs中出現(xiàn)的基因中，****研究者****選擇了16個(gè)已知的疾病相關(guān)基因和42個(gè)與FER（主要由Fv引起）相關(guān)的QTL/QTN預(yù)測(cè)基因（圖4b坷檩，表S10）構(gòu)建了整合免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)却音，其中根細(xì)胞類型和特定基因共表達(dá)模塊用不同顏色標(biāo)示（圖7a）改抡。綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由四個(gè)主要元素組成，即已知和預(yù)測(cè)的疾病相關(guān)基因及其在七種根細(xì)胞類型中表達(dá)豐度前三位的細(xì)胞類型系瓢、抗病信號(hào)或代謝通路阿纤，以及機(jī)器學(xué)習(xí)方法GENIE3預(yù)測(cè)的調(diào)控連接（圖7b-g；表S10）夷陋。
RC和表皮作為面向外部環(huán)境的細(xì)胞層欠拾，在保護(hù)根系免受病原體侵襲方面起著重要作用。對(duì)于包括M1骗绕、M2和M13在內(nèi)的三個(gè)RC或表皮特異性基因共表達(dá)模塊（圖4b）藐窄，苯丙酮途徑相關(guān)基因（如ZmCCoAOMT1/2和ZmHCT1/2）通過(guò)連接玉米根系RC和表皮細(xì)胞中的其他基因，成為波及這一免疫網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分酬土。該網(wǎng)絡(luò)中的這些基因與防御激素（如SA荆忍、JA、ET撤缴、CK和ABA）信號(hào)傳導(dǎo)刹枉、ROS生成和清除、超敏反應(yīng)（HR）腹泌、PCD嘶卧、次生代謝物（如木質(zhì)素、植物黃酮凉袱、黃酮類化合物和細(xì)胞壁）的生物合成、發(fā)育過(guò)程等有關(guān)（圖7b）侦铜。
皮層也是根的外層专甩，位于表皮之下、維管束之外钉稍，參與根對(duì)真菌感染的免疫反應(yīng)涤躲。在M14模塊（圖4b）中，通過(guò)莽草酸途徑生物合成黃酮類化合物可能是連接轉(zhuǎn)錄因子（TFs贡未，如MBY42和bHLH103）以激活這一皮層特異性免疫網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因素种樱，該網(wǎng)絡(luò)中的基因豐富且與ROS代謝、防御性代謝產(chǎn)物（木質(zhì)素和香豆素）生物合成以及防御性激素（如JA和SA）信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)（圖7c）俊卤。此外嫩挤，M9模塊（圖4b）代表兩種細(xì)胞類型，其相關(guān)基因通過(guò)激素（如JA和SA）信號(hào)消恍、ROS暴發(fā)和PCD參與誘導(dǎo)ETI（效應(yīng)觸發(fā)免疫）和下游防御反應(yīng)（圖7d）岂昭。中柱特異性M7模塊（圖4b）中的基因與防御激素信號(hào)、脂質(zhì)代謝和糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)（圖7e）狠怨。
RAM特異性M6模塊與中木質(zhì)部特異性M11和M12模塊之間的相互作用在基因表達(dá)水平上提供了新的調(diào)控機(jī)制约啊，以支持IAA和SA相關(guān)防御途徑之間的串?dāng)_（圖5和7f）邑遏。SA是一種植物防御激素，在病原體相關(guān)分子模式（PAMP）觸發(fā)的免疫（PTI）恰矩、ETI和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）中起著關(guān)鍵作用记盒，異構(gòu)體合成酶（ICS）途徑負(fù)責(zé)植物體內(nèi)SA的基礎(chǔ)積累和病原體誘導(dǎo)的積累。對(duì)于M4和M5（圖4b）聯(lián)合免疫網(wǎng)絡(luò)外傅，ICS-SA生物合成相關(guān)基因似乎是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因素纪吮，富集的基因與SA信號(hào)傳導(dǎo)、ROS產(chǎn)生和清除栏豺、HR彬碱、細(xì)胞發(fā)育、防御性代謝產(chǎn)物沉積和PTI發(fā)射有關(guān)（圖7g）奥洼。
總之巷疼，由已知和預(yù)測(cè)的疾病相關(guān)基因、其在根尖中的細(xì)胞類型灵奖、抗病信號(hào)或代謝途徑以及調(diào)控連接組成的這六個(gè)綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)嚼沿，以單細(xì)胞分辨率深入揭示了玉米根尖主要細(xì)胞類型的免疫反應(yīng)機(jī)制。
圖7.在玉米根中構(gòu)建細(xì)胞類型特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)瓷患。（a）玉米主根尖端橫切面和縱切面示意圖骡尽。不同顏色的矩形和圓形分別表示特定的細(xì)胞類型和基因共表達(dá)模塊。根據(jù)研究者的調(diào)控分析擅编，與Fv侵襲相關(guān)的已知抗性基因和QTL/QTN預(yù)測(cè)基因可歸入細(xì)胞特性或細(xì)胞類型特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)考润。（b）通過(guò)整合M1（RC_Qi319_MK/Fv）、M2（RC_B104_MK/Fv）和M13（Epidermis_Qi319_Fv）模塊形成的苯丙酮途徑相關(guān)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)哎迄。（c）基于M14（Cortex_Qi319_Fv）模塊的皮層特異性類黃酮通路相關(guān)免疫網(wǎng)絡(luò)蜡励。（d）基于M9模塊（Cortex/Metaxylem_B104_Fv）的皮層/木質(zhì)部?jī)煞N細(xì)胞類型的免疫網(wǎng)絡(luò)。（e）基于M7模塊（Stele_B104_MK/Fv-Qi319_Fv）的中柱特異性免疫網(wǎng)絡(luò)锦担。（f）基于RAM特異性M6（RAM_B104_MK/Fv-Qi319_Fv）俭识、木質(zhì)部特異性M11（Metaxylem_Qi319_Fv）和M12（Metaxylem_B104_MK/Fv）模塊的IAA介導(dǎo)的抗病性與SA相關(guān)防御途徑之間的串?dāng)_。（g）M4（Endodermis_B104_MK/Qi319_Fv）和M5（RC_Qi319_Fv）模塊的相互作用洞渔。已知的玉米抗性基因套媚、與Fv和其他病原體抗性相關(guān)的QTL/QTN預(yù)測(cè)基因（下劃線）、七種主要細(xì)胞類型中表達(dá)豐度前三位的細(xì)胞類型以及特定的共表達(dá)模塊用不同顏色表示磁椒。顯示了已知抗性基因的通路或生物學(xué)功能堤瘤，QTL/QTN預(yù)測(cè)基因的可能通路或生物學(xué)功能用下劃線標(biāo)出。括號(hào)中列出了與已知抗性基因相關(guān)的疾病或病原體衷快。雙向箭頭表示已知的相互作用宙橱，雙向虛線箭頭表示GENIE3預(yù)測(cè)的相互作用。圖中縮寫(xiě)的詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)附錄S2。
討論
1 一個(gè)全面的玉米根尖單細(xì)胞圖譜為構(gòu)建玉米根細(xì)胞類型特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了可行性
在未來(lái)全球變暖的預(yù)測(cè)下师郑，土傳病原體引起的植物病害預(yù)計(jì)將在全球范圍內(nèi)流行环葵。要制定新的病害控制策略，就必須更好地了解植物根系的遺傳抗病潛力和免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制宝冕。本研究****報(bào)告了兩個(gè)近交系中玉米根尖的綜合單細(xì)胞圖譜张遭，并利用****研究者****定義的細(xì)胞標(biāo)記、RNA原位雜交和之前報(bào)告的相關(guān)信息地梨，鑒定了21個(gè)細(xì)胞簇和7種主要細(xì)胞類型菊卷。本研究觀察到的細(xì)胞群數(shù)量和細(xì)胞類型與已發(fā)表的玉米根部scRNA-seq研究基本一致。在研究者定義的細(xì)胞標(biāo)記中宝剖，包括24個(gè)制造者在內(nèi)的856個(gè)標(biāo)記基因（如Zm00001d049683洁闰、Zm00001d017508、Zm00001d003707万细、α-碳酸酐酶7）經(jīng)RNA原位雜交驗(yàn)證后顯示出與先前報(bào)告相同的細(xì)胞類型（圖2f扑眉、圖S3、表S3赖钞、S11）腰素。值得注意的是，這里報(bào)告的68個(gè)標(biāo)記基因（如異逞┯花粉傳遞1弓千、NAC131、CCP5献起、植物硫激肽前體1）的細(xì)胞類型與已發(fā)表的兩項(xiàng)研究（表S3）完全一致洋访。耐人尋味的是，根據(jù)標(biāo)記基因Zm00001d051333的RNA原位雜交谴餐，研究者還發(fā)現(xiàn)第14簇是髓（一種亞莖細(xì)胞類型）（圖S3g,h）捌显。因此，第14簇的標(biāo)記基因?qū)?lái)可用于鑒定根髓細(xì)胞总寒。與之前的研究相比，本研究通過(guò)RNA原位雜交驗(yàn)證了根尖的細(xì)胞類型理肺，因此這些已鑒定的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因可用于細(xì)胞分選摄闸，以產(chǎn)生高質(zhì)量的細(xì)胞類型特異性玉米根尖轉(zhuǎn)錄組。
借助WGCNA和GENIE3妹萨，一個(gè)全面的玉米根尖單細(xì)胞圖譜為剖析玉米根細(xì)胞特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了可行性年枕。如前所述，通過(guò)對(duì)玉米抗病相關(guān)文獻(xiàn)的文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)和綜合生物信息學(xué)分析乎完，創(chuàng)造性地篩選出了QTL和QTN預(yù)測(cè)的玉米病害相關(guān)基因和已知的抗病相關(guān)基因熏兄。將這些基因與來(lái)自scRNA-seq數(shù)據(jù)的4049個(gè)Fv響應(yīng)DEGs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Fv誘導(dǎo)的共表達(dá)模塊中存在148個(gè)與特定細(xì)胞類型重疊的基因（圖4b；圖S5f）摩桶。其中桥状，研究者發(fā)現(xiàn)RAM特異性ZmWOX5b和ZmPIN1a基因通過(guò)協(xié)調(diào)根尖中IAA的不均勻分布，保護(hù)RAM免受Fv感染（圖5h,i）硝清。此外辅斟，ZmPAL6、ZmCOMT和ZmCCoAOMT2通過(guò)調(diào)節(jié)真菌侵襲時(shí)根細(xì)胞壁中木質(zhì)素的沉積芦拿，參與對(duì)Fv的防御反應(yīng)（圖6）士飒。值得注意的是，這三個(gè)基因在不同的細(xì)胞類型中起作用蔗崎。ZmCOMT的基因敲除表達(dá)會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素含量和下胚層細(xì)胞酵幕、維管束中柱體和內(nèi)胚層三到四個(gè)細(xì)胞層的木質(zhì)素染色急劇下降（圖6g），這些區(qū)域（不包括最外層的下胚層細(xì)胞）的木質(zhì)素被丁香基（S）單位木質(zhì)化缓苛。ZmCCoAOMT2與ZmCOMT類似芳撒，在單木質(zhì)素生物合成中起下游作用，似乎對(duì)最外層下表皮細(xì)胞的組成木質(zhì)化更為重要（圖6g）他嫡，這些細(xì)胞沉積了木質(zhì)素聚合物的愈創(chuàng)木基（G）單元番官。同樣，在ZmPAL6被沉默的根的所有木質(zhì)化細(xì)胞類型（下胚層細(xì)胞钢属、維管束中柱體和內(nèi)胚層）中徘熔，木質(zhì)素的組織化學(xué)染色水平都很低（圖6g），這表明ZmPAL6參與了木質(zhì)素生物合成的上游調(diào)節(jié)途徑淆党。這些結(jié)果證明酷师，苯丙酮途徑相關(guān)基因可通過(guò)其細(xì)胞特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控不同類型細(xì)胞的木質(zhì)素沉積（圖4b和7b、f）染乌。
2 免疫網(wǎng)絡(luò)揭示了真菌侵染后玉米根系的全球宿主反應(yīng)的重疊
植物進(jìn)化出了兩種感官機(jī)制來(lái)識(shí)別病原體入侵山孔。一種是位于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）感知稱為PAMPs的保守微生物誘導(dǎo)物，從而啟動(dòng)PTI荷憋。第二類感知涉及細(xì)胞內(nèi)受體直接或間接識(shí)別稱為效應(yīng)物的病原體毒力分子台颠，這種識(shí)別啟動(dòng)ETI。一些細(xì)胞事件與PTI和ETI相關(guān)勒庄，包括快速激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）信號(hào)串前、ROS迸發(fā)和清除、防御激素信號(hào)实蔽、防御相關(guān)代謝物（如木質(zhì)素荡碾、植物黃酮素、香豆素局装、胼胝質(zhì)等）的生物合成和沉積坛吁、基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控以及局部細(xì)胞死亡劳殖。考慮到根的性能由不同根細(xì)胞的協(xié)同作用決定，****研究者****進(jìn)行了細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組分析拨脉，以確定受Fv挑戰(zhàn)的玉米根不同類型細(xì)胞中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖4）哆姻。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)提供了PTI和ETI相關(guān)信號(hào)通路及下游免疫反應(yīng)的全局場(chǎng)景（圖7女坑，表S10）填具。值得注意的是，在兩個(gè)近交系中匆骗，F(xiàn)v接種后植物防御相關(guān)生理生化特征的表型變化證實(shí)了這些免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖1i劳景、k，圖S1i）碉就。此外盟广，在這些免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，SA信號(hào)通路存在廣泛的重疊（圖7b瓮钥、d-h）筋量，與之前發(fā)表的結(jié)果一致，證明了這些構(gòu)建的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的可行性碉熄。
通過(guò)將WGCNA與GENIE3分析相結(jié)合桨武，****研究者****以細(xì)胞類型特異性的方式在這些免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)了不同的調(diào)控模式（圖4b和圖7），并發(fā)現(xiàn)它們能有效地闡明DEGs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)锈津。例如呀酸，TF基因MYB42是三個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子（MO2、ASN3和JRG21）的靶基因（圖4b琼梆，表S9）性誉，它通過(guò)抑制木質(zhì)素通路的基因參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，通過(guò)GENIE3方法茎杂，它也被預(yù)測(cè)與木質(zhì)素合成有關(guān)（圖7c）错览。其他TF靶基因?qū)儆赪RKY、bHLH和NAC家族煌往，據(jù)報(bào)道它們是植物與病原體相互作用的重要因素倾哺，這些基因被發(fā)現(xiàn)與防御激素信號(hào)、ROS爆發(fā)和HR防御有關(guān)（圖7b-d,g）刽脖，這表明研究者的預(yù)測(cè)工具在揭示細(xì)胞類型特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間相互作用方面的準(zhǔn)確性悼粮。
3 玉米根系細(xì)胞類型特異性免疫網(wǎng)絡(luò)為剖析其抗病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)
本研究****的發(fā)現(xiàn)表明，根細(xì)胞類型在Fv感染下保持其特征曾棕，細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)模式和Fv感染下細(xì)胞特征基因的調(diào)控（圖4b和7；圖S5a,b）菜循，****表明了細(xì)胞特征和細(xì)胞類型特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的相互作用翘地。研究者****的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖5和圖6）和構(gòu)建的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖7b-g）表明，通過(guò)感知器（受體）到激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，根系發(fā)育和抗病網(wǎng)絡(luò)之間存在密切的相互依存關(guān)系衙耕，從而調(diào)整根系的整體發(fā)育以應(yīng)對(duì)真菌刺激昧穿。細(xì)胞特性和細(xì)胞類型特異性免疫網(wǎng)絡(luò)的相互作用豐富了基因水平的調(diào)控機(jī)制，以支持植物發(fā)育-環(huán)境界面的這種串?dāng)_橙喘。這些發(fā)現(xiàn)表明了玉米根系免疫信號(hào)調(diào)節(jié)真菌入侵的復(fù)雜性时鸵。為構(gòu)建細(xì)胞型特異性免疫網(wǎng)絡(luò)而選擇的基因與玉米的主要病害有關(guān)（表S10），因此這些防御途徑很可能適用于通過(guò)使用基因編輯和基因過(guò)表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證這些基因的功能厅瞎，從而探索針對(duì)病原體的免疫應(yīng)答和抗病機(jī)制饰潜，如之前在玉米中所述。
本研究****通過(guò)結(jié)合細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄組和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和簸，構(gòu)建了六種細(xì)胞特異性免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)彭雾，以應(yīng)對(duì)Fv感染。****本****研究不僅提供了根系發(fā)育過(guò)程中玉米細(xì)胞命運(yùn)決定的全局視圖锁保，還以單細(xì)胞分辨率深入了解了玉米根尖主要細(xì)胞類型的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)薯酝，從而為剖析玉米抗病性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
