做完轉(zhuǎn)錄組分析之后重归，一般都要求做qRT-PCR來驗(yàn)證二代測(cè)序得到的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)是否可靠。熒光定量PCR是一種相對(duì)表達(dá)定量的方法，他的計(jì)算方法有很多，常用的相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析方法有雙標(biāo)曲線法霸妹，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)知押，用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法叹螟。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計(jì)算；
qRT-PCR原理：
以基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增台盯，在PCR擴(kuò)增過程中罢绽，通過收集熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)静盅。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期良价，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可以定量蒿叠。
Ct值是什么意思呢明垢？
Ct 值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) (cycle)。 qRT-PCR在擴(kuò)增的時(shí)候都會(huì)有平臺(tái)期栈虚，在平臺(tái)期之前袖外，PCR 擴(kuò)增就是簡(jiǎn)單的指數(shù)增長(zhǎng)，也就是 1 變 2魂务，2 變 4曼验，4 變 8 …擴(kuò)增。數(shù)學(xué)形式就是 2 的 ct 次方粘姜，到了平臺(tái)期所有基因擴(kuò)增的數(shù)目是一致的鬓照，而唯一有區(qū)別的則是 ct 值的不同。所以不難推斷出 ct 值越小孤紧，反應(yīng)擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)數(shù)越少豺裆，目的基因起始含量越高。這里可以得到公式：
計(jì)算-ΔΔCt
在這里，我們有一個(gè)對(duì)照組臭猜，一個(gè)處理組躺酒，還有一個(gè)內(nèi)參基因和目的基因，想看一下目的基因在處理組中相對(duì)與對(duì)照中的表達(dá)差異蔑歌，也就是計(jì)算-ΔΔCt：數(shù)據(jù)如下：
1.計(jì)算每組內(nèi)參基因sgAction Ct均值
計(jì)算第一個(gè) Δct羹应，即每組的待檢目的基因減去內(nèi)參基因的 Ct 值
3.計(jì)算對(duì)照CK組中 Δct 的均值，再用處理組的 每一個(gè)Δct 減去剛剛計(jì)算的對(duì)照CK組的 Δct 均值次屠，得到 ΔΔct（紅框框）
4.相對(duì)表達(dá)量計(jì)算园匹，也就是相對(duì)于對(duì)照組: 2^-ΔΔct：
不難看出這里的-ΔΔct和我們轉(zhuǎn)錄組當(dāng)中的log2（fold change）值是一致的，所以如果多做幾個(gè)基因就可以繪制類似如下圖：
或者相關(guān)性點(diǎn)圖：
測(cè)試數(shù)據(jù)表格下載：qRT-PCR_demo_data.xlsx
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