ELISA(酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng))指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上同木，進行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。

ELISA在抗體藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)有著廣泛的應(yīng)用，從應(yīng)用目的來說可以分為兩類：1. 生物大分子的定量：體內(nèi)抗體藥物的藥代動力學磨德，藥效生物標志物的含量檢測等见芹；2. 親和力測定評價或者篩選：雜交瘤的滴度測定，噬菌體展示的篩選鸯乃，抗體和細胞表面受體的親和力評價等鲸阻。

1. ELISA實驗耗材試劑的選擇

應(yīng)用目的不一樣跋涣，即使使用同樣的試劑材料，也會有不同實驗?zāi)Ｊ胶蛿M合曲線鸟悴。所以需要根據(jù)目的的不同陈辱，來選取不同特性的試劑耗材。

1.1 酶標板材

市面上的酶標板材基本都是聚苯乙烯细诸，有的公司會對聚苯乙烯進行修飾以使板子對于不同的包被蛋白具有不同的特性沛贪。

一般的酶標板材的說明書上會根據(jù)高結(jié)合力（Highbinding），中結(jié)合力（mediumbinding）的維度進行劃分,對蛋白的結(jié)合也會由強逐漸變?nèi)跽鸸螅@會帶來三個效果：

• 相同濃度的蛋白包被利赋，結(jié)合能力強的比結(jié)合能力弱的材料可以在酶標板材上固定更多的蛋白。
• 板材對包被蛋白的吸附效率提高的同時猩系，非特異吸附的能力也會提高媚送，從而造成非特異信號或背景值變深。
• 包被的蛋白并不是隨機均勻的吸附在酶標板材上寇甸，有明顯的偏向性塘偎，顯色時會觀察到有些部分顏色較深。會導致在不同的特性酶標板材上拿霉，包被蛋白與酶標板材的接觸表面不一樣吟秩，可能會造成位點被屏蔽的現(xiàn)象。如果這個位點恰好是與檢測樣品結(jié)合的位點绽淘，樣品將會因此無法被檢測到涵防。
  目前沒遇到過位點屏蔽的情況，選用板材多是高結(jié)合板材

1.2 包被液

常用的包被液是PBS(pH 7.4)和碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液(pH 9.6)沪铭，pH和離子濃度會對包被的效率產(chǎn)生一定的影響壮池，需根據(jù)包被蛋白的特性進行具體分析，可參考蛋白產(chǎn)品的COA伦意。包被完成后大部分蛋白還是會留在溶液中火窒，另外酶標板材加入包被液后抽真空可以使包被蛋白以更高的密度吸附在板材上。

1.3 封閉液

封閉液的作用是覆蓋酶標板材包被蛋白占據(jù)位置以外的空間驮肉，以抵抗后續(xù)樣品或者樣品中的其他物質(zhì)熏矿、酶聯(lián)抗體等對于板材直接的非特異吸附。常用的封閉劑有3%BSA（w/v）离钝，5%脫脂奶粉（w/v）等票编。

有研究表明，封閉劑的封閉效果和封閉分子的大小成反比卵渴，所以如果傳統(tǒng)的封閉劑起不到很好的封閉效果慧域，選用分子量更小的封閉劑（如：酪蛋白），可能會取得更好的封閉效果浪读。

另外需特別注意：脫脂奶粉中含有生物素昔榴，如果檢測體系是生物素-鏈霉親和素體系辛藻，千萬不要使用脫脂奶粉作為封閉劑。

1.4 稀釋液/洗滌液

常用的洗滌液是PBST(0.1%(V/V) Tween-20 in PBS)互订。

稀釋液會在洗滌液中加入一定的封閉劑成分如1%BSA (W/V ) in PBST吱肌。

在體內(nèi)樣品的檢測過程中，通常會在稀釋液中加入一定濃度的陰性血清如1%的空白血清仰禽，以使得不同稀釋度的樣品有相同的非特異背景氮墨。

1.5 酶聯(lián)抗體

常用的酶聯(lián)抗體標記的酶主要為AP(堿性磷酸酶)和HRP(辣根過氧化氫酶)。

酶聯(lián)抗體根據(jù)其抗體的分子量由大到小可分為全長的酶聯(lián)抗體吐葵、Fab片段酶聯(lián)抗體规揪、scFv酶聯(lián)抗體。

分子量越小的酶聯(lián)抗體越有可能避免作用位點被空間阻礙的情況温峭，但也增加了酶聯(lián)抗體繞過封閉劑的阻斷與酶標板材進行非特異結(jié)合的風險猛铅。

1.6 顯色液和酶標儀

顯色液的選擇需與酶聯(lián)抗體的酶對應(yīng)，也需和實驗室所具備的酶標儀對應(yīng)诚镰。如酶聯(lián)抗體偶聯(lián)的是HRP（辣根過氧化氫酶）奕坟，可以采用TMB顯色液，用能夠進行吸光度讀數(shù)的酶標儀進行檢測清笨。

一般來說，ELISA方法的靈敏度會受到底物的檢測方法限制刃跛，化學發(fā)光底物能夠檢測的信號下限要優(yōu)于熒光底物抠艾，再優(yōu)于吸光度值底物。

在ELISA方法開發(fā)時桨昙，要選擇在酶標儀精密度準確度范圍內(nèi)的OD值范圍检号。

2. ELISA實驗方法類型

在ELISA實驗中，抗體或者抗原需預結(jié)合到酶標板中蛙酪，再利用辣根過氧化物酶（HRP）齐苛，堿性磷脂酶（AP）或者其他化學發(fā)光基團標記的抗體或者抗原進行顯色反應(yīng)。ELISA方法分為主要有四種桂塞，并各自具有特點：ELISA夾心法凹蜂、競爭法（測定抗原），間接法（測定抗體）或競爭法（測定小分子化合物）阁危。

2.1 夾心法

夾心法的基本原理是將抗體（抗原）包被到酶標板上玛痊，加入待檢測樣品后，再加入HRP狂打、AP標記的檢測抗體擂煞，通過顯色反應(yīng)測定待測樣品中的特定抗原（抗體）含量。

夾心法

2.2 間接法

競爭ELISA法被廣泛的用于檢測小分子抗原趴乡，如抗生素对省，食品農(nóng)藥殘留等蝗拿。與其他幾種方法最大的區(qū)別是，在實際操作中樣品中待測物質(zhì)濃度越高蒿涎，顯色反應(yīng)越低蛹磺；反之，當待測物質(zhì)濃度越低同仆，顯色反應(yīng)程度越高萤捆。這是因為，將抗原固定在酶標板之后俗批，加入待測樣品和酶標檢測抗體俗或，樣品中游離的待測抗原會與酶標檢測抗體結(jié)合，導致酶標檢測抗體與酶標板固相抗原結(jié)合數(shù)量減少岁忘，最終顯色反應(yīng)水平光密度值減少辛慰。

競爭法

3. ELISA方法學開發(fā)-生物大分子定量

ELISA方法學開發(fā)需要遵循相應(yīng)的指導原則，比如9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則干像。如果一個ELISA方法需要達到精密帅腌，準確等驗證需求，在定量方法的開發(fā)過程中包被抗原的量要遠遠大于標準品（樣品）的量麻汰，這樣樣品能夠抵消抗原抗體可逆反應(yīng)的影響速客，使得近似所有的抗體樣品均被捕捉到，標準曲線如果做對數(shù)線性擬合能夠得到非常好的線性五鲫。

接下來介紹一個檢測小鼠血清中PD1方法開發(fā)驗證實例溺职。

3.1 實驗步驟

1. 將100 μL包被溶液加至酶標板的所有孔中，輕拍酶標板以混勻孔內(nèi)的液體位喂，轉(zhuǎn)移酶標板至4℃冰箱孵育過夜12-18小時浪耘。
2. 移除酶標板中的溶液，在平板紙（或同類物料）上輕拍酶標板以除盡剩余液體塑崖。加入260 μL洗滌液至酶標板所有孔中七冲，輕拍酶標板以混勻孔內(nèi)的液體，移除酶標板中的洗滌液规婆，在平板紙（或同類物料）上輕拍酶標板以除盡剩余液體澜躺。重復3次。
3. 轉(zhuǎn)移300 μL封閉液至酶標板所有孔中聋呢，輕拍酶標板以混勻孔內(nèi)的液體苗踪，將酶標板轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育1小時。
4. 孵育結(jié)束后削锰，重復步驟2通铲。對于要立即使用的酶標板，可放入4℃冰箱待用器贩，其他酶標板可放入-20℃保存待用颅夺。
5. 根據(jù)點樣方案朋截，在包被板中加入100 μL的稀釋好的樣本，輕拍酶標板以混勻孔內(nèi)的液體吧黄，將酶標板轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育1h部服。
6. 孵育結(jié)束后，重復步驟2拗慨。
7. 轉(zhuǎn)移100 μL 檢測抗體溶液至酶標板相應(yīng)的孔中廓八，輕拍酶標板以混勻孔內(nèi)的液體，將酶標板轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育30min赵抢。
8. 將TMB從4°C冰箱取出剧蹂，室溫放置5～10分鐘回溫。孵育結(jié)束后烦却，重復步驟2宠叼。
9. 將100 μL顯色工作液加至酶標板相應(yīng)的孔中，室溫孵育10±5分鐘其爵。
10. 將100 μL終止液加至酶標板相應(yīng)的孔中冒冬，終止顯色。
11. 終止顯色15分鐘內(nèi)使用酶標儀讀取光密度信號值摩渺，檢測波長選擇為450 nm简烤。

3.2 實驗試劑的準備

• 標準品
  標準品可以是商品化的已知濃度的蛋白分子，也可以是自制的证逻、已知濃度的純度較高的蛋白分子乐埠。標準品一般為7-8個濃度點，擬合成合適的濃度-信號劑量曲線作為標準曲線進行內(nèi)控品和樣品的定量囚企。此處選擇商品化的PD1蛋白。
• 包被抗原
  選擇商品化的PD-L1蛋白(his標簽)瑞眼，購自ACRO龙宏。
• 包被液
  根據(jù)包被抗原說明書，選擇合適的包被液及包被濃度伤疙。
  常用的包被液是PBS(pH 7.4)和碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液(pH 9.6)
• 封閉液
  3%BSA（w/v）
• 洗滌液
  PBST(0.1%(V/V) Tween-20 in PBS)
• 稀釋液
  1%BSA (W/V ) in PBST银酗。
• 檢測抗體
  可與PD1非PD-L1結(jié)合位點結(jié)合的HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗。
• 顯色液
  HRP標記的二抗選擇TMB顯色液(辣根過氧化物酶的常用底物)徒像，顯色時變?yōu)樗{色黍特。針對不同標記的二抗，選擇不同的顯色液锯蛀。
• 終止液
  加入顯色液等體積的1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)灭衷，孔中反應(yīng)液由藍色變?yōu)辄S色。

3.3 標準曲線的確定

本步驟需要確定的條件

3.4 最小稀釋倍數(shù)-MRD的確定

在實際樣本中，如血清掠械，其中含有許多物質(zhì)由缆，可能會對OD值有影響，所以ELISA檢查血清等生物組織中樣本含量需要探索一個最小稀釋倍數(shù)猾蒂。

最小稀釋倍數(shù)的確定需要根據(jù)預估樣本中的含量來設(shè)計均唉，如果樣本含量最高為1μg/mL，標曲范圍為：12-1 ng/mL婚夫，那MRD的設(shè)計不應(yīng)該超過1000浸卦，及標曲應(yīng)能檢測到大部分樣本。一般MRD范圍在10-100之間案糙，當然也可以設(shè)計的更低一些限嫌。

實驗方案基本是這樣：將未稀釋的標準品用目標動物的血清（檢測血清就用空白血清，若檢測組織时捌，用空白組織裂解液）稀釋至標曲的10倍怒医，100倍。

假設(shè)確定標曲范圍為：12-1 ng/mL

MRD10：用空白血清將標曲分別稀釋至120-10 ng/mL奢讨，再將其用assay buffer分別稀釋10倍稚叹，加入酶標板。

MRD100：用空白血清將標曲分別稀釋至1200-100 ng/mL拿诸，再將其用assay buffer分別稀釋100倍扒袖，加入酶標板。

然后按照確定的標曲條件反應(yīng)亩码，顯色季率，選取OD值與不添加血清的標曲最接近的作為最小稀釋倍數(shù)，可以調(diào)整標曲反應(yīng)條件以使得最小稀釋倍數(shù)在合適的范圍內(nèi)描沟。

3.5 精密度飒泻、準確度的確定

精密度(CV)和準確度(%RE)分為批內(nèi)精密度、準確度和批間精密度吏廉、準確度泞遗。計算方式無太大差別。
濃度水平覆蓋標準曲線范圍：定量下限席覆，在不高于定量下限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣品(LQC)史辙， 標準曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣品(MQC)，以及標準曲線范圍上限約 75%處的高濃度質(zhì)控樣品(HQC),每個濃度至少用 5 個樣品。
酶標板布局參考

3.6 稀釋線性、鉤狀效應(yīng)及前帶效應(yīng)

樣品稀釋不應(yīng)影響準確度和精密度方库。應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定量上限濃度结序，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少 5 個測定值），來證明稀釋的可靠性纵潦。準確度和精密度應(yīng)在±20%之內(nèi)徐鹤，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數(shù)。

之前確定的標準曲線定量限為1.28μg/ml-0.02μg/ml邀层，將標準品(12.8mg/ml)分別稀釋100返敬、1000、20000寥院、40000及70000倍劲赠，來考察稀釋可靠性。
酶標板布局參考

3.7 基質(zhì)效應(yīng)

用至少6批來自不同供體的空白基質(zhì)（本實驗中為空白小鼠血清）塑煎，將其分別稀釋100倍后，用來配制稀釋液（含1%空白血清的PBST）臭蚁，后續(xù)樣本稀釋均采用含基質(zhì)的稀釋液稀釋最铁。
酶標板布局參考

可接受標準：至少80%樣本測定值%RE不超過±20.0%。

3.8 穩(wěn)定性

采用LQC和HQC樣品垮兑，在預處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析冷尉。由新鮮制備的校正標樣獲得標準曲線，根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品系枪。

本實驗中僅檢測室溫放置4h的穩(wěn)定性网严。
酶標板布局參考

3.9 總結(jié)

• 標準曲線的值應(yīng)該在所使用酶標儀的檢測線性范圍內(nèi)，不然會放大信號檢測偏差怜庸〉狈福可通過酶標儀說明書確認其檢測線性范圍。
• 樣本%RE或%CV的可接受標準可根據(jù)實驗?zāi)康牟煌M行微調(diào)割疾，嚴格些的為15%嚎卫，一般不超過25%。
• 涉及到勾狀效應(yīng)的情形需要另外討論，不在本例討論范圍之內(nèi)拓诸。
• 基質(zhì)效應(yīng)中將基質(zhì)稀釋多少倍侵佃，本實驗的最小稀釋倍數(shù)即為該值，即所有檢測樣品最少稀釋該倍數(shù)奠支。
• 穩(wěn)定性中還可考慮凍融穩(wěn)定性馋辈，4℃穩(wěn)定性等條件。
• 確定標準曲線后即可同步進行后續(xù)驗證倍谜，酶標板布局可大致參考迈螟，只要滿足驗證條件，可多個驗證在同一塊酶標板上進行

THE END