作者：堯小飛
審稿：童蒙
編輯：angelica

引言

在上一篇文章單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(Single cell RNA)概述
，我們對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了簡(jiǎn)單的介紹及其分析必備所需矩陣的獲得鸳玩。

此篇6000字干貨長(zhǎng)文在张，我們介紹常見(jiàn)的亞群分析內(nèi)容挑格。耐心看完收獲滿滿；或者收藏后慢慢看。

1.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組亞群常見(jiàn)分析內(nèi)容

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組亞群分析的內(nèi)容根據(jù)樣品數(shù)目多少懂版，可以分為單個(gè)樣品或者多個(gè)樣品萌狂。單個(gè)樣品主要可以進(jìn)行的分析內(nèi)容有：細(xì)胞亞群的鑒定档玻、亞群之間的差異以及發(fā)育軌跡分析。多個(gè)樣品分析內(nèi)容包括所有單個(gè)的分析內(nèi)容茫藏，并且在此基礎(chǔ)上還能進(jìn)行樣品的差異分析误趴。

這里樣品差異分析主要分兩個(gè)方面：
1.從宏觀上來(lái)說(shuō)，不同亞群中不同樣品的細(xì)胞數(shù)目的差異务傲，不同亞群細(xì)胞具有不同的功能冤留，因此亞群的差異對(duì)于研究異質(zhì)性具有十分重要的作用。
2.從單個(gè)亞群來(lái)說(shuō)树灶，可以研究不同樣品之間的差異纤怒，比如同樣是上皮細(xì)胞，我們可以研究上皮細(xì)胞中不同樣品之間的差異天通，基因表達(dá)或者代謝通路的差異泊窘，這是從機(jī)理上來(lái)解釋生物學(xué)問(wèn)題。

一般使用Seurat工具進(jìn)行細(xì)胞亞群分析。 鏈接：https://github.com/satijalab/seurat

2.數(shù) 據(jù) 質(zhì) 控

2.1空載細(xì)胞烘豹、雙細(xì)胞瓜贾、雙細(xì)胞數(shù)據(jù)質(zhì)控

如上圖A左圖所示，為每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)目小提琴圖携悯。一般對(duì)于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來(lái)說(shuō)祭芦，如果細(xì)胞表達(dá)的基因數(shù)目過(guò)少，可能是空載細(xì)胞（在細(xì)胞分篩的時(shí)候憔鬼，溶液可能含有的游離mRNA）龟劲；如果細(xì)胞基因數(shù)目表達(dá)過(guò)高，可能是雙細(xì)胞（2個(gè)以上的細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)目一般就會(huì)較高）轴或。

圖A右圖為每個(gè)細(xì)胞中線粒體基因（線粒體基因的名稱一般為mt開(kāi)頭昌跌，不同物種大小寫(xiě)可能不一樣）的表達(dá)UMI占比，除非特別的樣品或者組織（比如卵組織）照雁，一般細(xì)胞的線粒體基因表達(dá)占比較低蚕愤。不同文獻(xiàn)會(huì)有不同的閾值，5-40%都有饺蚊，因此在做此數(shù)據(jù)質(zhì)控的時(shí)候需要根據(jù)自己的研究樣品設(shè)定一個(gè)合適的閾值萍诱，通常可以設(shè)為20-25%污呼。

圖B為雙細(xì)胞檢測(cè)方法介紹砂沛，如果細(xì)胞基因的表達(dá)數(shù)目過(guò)高，可能對(duì)結(jié)果具有較大的影響（比如有時(shí)過(guò)渡態(tài)細(xì)胞可能不是過(guò)渡態(tài)細(xì)胞曙求，而是雙細(xì)胞）碍庵，因此一般需要注意雙細(xì)胞數(shù)目。一般來(lái)說(shuō)悟狱，10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)對(duì)雙細(xì)胞有一定的控制静浴，1000個(gè)細(xì)胞雙細(xì)胞率不超過(guò)0.9%，10000個(gè)細(xì)胞不超過(guò)7%挤渐。但是有時(shí)候由于實(shí)驗(yàn)因素苹享，可能會(huì)偏高，需要在分析的時(shí)候去掉雙細(xì)胞浴麻。

過(guò)濾雙細(xì)胞的方法有很多種得问，一種比較直接粗暴的方法就是把細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)目超過(guò)一定閾值的細(xì)胞去掉（比如PBMC細(xì)胞，閾值為2500）软免，不過(guò)不同的樣品閾值不同宫纬；另外一種方式就是通過(guò)算法來(lái)去掉雙細(xì)胞，現(xiàn)在去掉雙細(xì)胞的工具有很多種膏萧，比如DoubletFinder(https://www.cell.com/cell-systems/fulltext/S2405-4712(19)30073-0)漓骚、scrublet(https://github.com/AllonKleinLab/scrublet)蝌衔、DoubletDecon(https://github.com/EDePasquale/DoubletDecon)、DoubletDetection(https://github.com/JonathanShor/DoubletDetection.git) 等等蝌蹂，python和R語(yǔ)言的工具都有噩斟，可以根據(jù)自己需要進(jìn)行工具選擇。

對(duì)于空載細(xì)胞分析孤个，一般cellranger流程已經(jīng)進(jìn)行處理過(guò)剃允。cellranger在進(jìn)行call cells的時(shí)候，會(huì)通過(guò)EmptyDrops工具根據(jù)其表達(dá)量與背景表達(dá)量的相似性進(jìn)行空載細(xì)胞的判斷齐鲤。鏈接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1662-y

當(dāng)然也會(huì)對(duì)基因進(jìn)行質(zhì)控斥废，一般會(huì)過(guò)濾掉基因表達(dá)細(xì)胞數(shù)目過(guò)低的基因，比如一般要求至少在3多個(gè)或者5個(gè)細(xì)胞表達(dá)的基因佳遂。

2.2特定細(xì)胞質(zhì)控

特定細(xì)胞的質(zhì)控营袜，這個(gè)一般需要通過(guò)特定的樣品進(jìn)行分析撒顿，比如PBMC細(xì)胞中不能含有血紅蛋白基因高表達(dá)的細(xì)胞丑罪，血紅蛋白基因高表達(dá)細(xì)胞一般是紅細(xì)胞，但是紅細(xì)胞對(duì)于我們的研究一般來(lái)說(shuō)沒(méi)有什么意義凤壁，因此一般需要過(guò)濾掉此類細(xì)胞吩屹，這個(gè)閾值不同的樣品設(shè)定的不一樣，比如可以設(shè)定閾值為5%拧抖。

其他特定細(xì)胞的質(zhì)控煤搜，比如我們經(jīng)過(guò)流式篩選的是T細(xì)胞，結(jié)果出現(xiàn)高表達(dá)B細(xì)胞唧席、巨噬細(xì)胞等其他細(xì)胞類型的marker基因擦盾，因此需要去掉此類細(xì)胞，一般此類細(xì)胞聚類都分離得比較開(kāi)淌哟，與其他細(xì)胞不一樣迹卢，比如下圖所示。

2.3降維可變基因和PCA數(shù)目選擇

如上圖所示徒仓，一般會(huì)選擇變化度較大的基因進(jìn)行后續(xù)降維聚類分析腐碱。一般選擇top1000或者2000基因進(jìn)行PCA降維。然后聚類時(shí)掉弛，一般是挑選特定的PCA數(shù)目進(jìn)行聚類症见，比如圖B所示的碎石圖，一般會(huì)選擇在拐點(diǎn)位置的PCA數(shù)目進(jìn)行后續(xù)分析殃饿。

2.4細(xì)胞周期質(zhì)控

上述圖A為沒(méi)有進(jìn)行細(xì)胞周期變異的排除谋作，圖B為進(jìn)行細(xì)胞周期變異的排除，圖C為S.Score-G2M.Score進(jìn)行變異的排除的結(jié)果乎芳。目前主要是人的物種有細(xì)胞周期基因瓷们，如果想對(duì)其他物種進(jìn)行細(xì)胞周期分析业栅，可以根據(jù)與人的同源基因比對(duì)后進(jìn)行。

另外需要注意的是谬晕，不是所有的樣品都適合進(jìn)行細(xì)胞周期分析碘裕，如果是干細(xì)胞分化研究，這樣的話就可能有點(diǎn)不合適攒钳，使用兩者之間的差異進(jìn)行分析會(huì)更合適一些帮孔。具體情況需要根據(jù)樣品進(jìn)行分析（這樣會(huì)將細(xì)胞周期細(xì)胞與非周期細(xì)胞分隔開(kāi)）。

3.細(xì) 胞 亞 群 差 異

在進(jìn)行所有質(zhì)控后不撑，進(jìn)行降維聚類文兢，得到如上的聚類結(jié)果圖。現(xiàn)在降維可視化的方法主要有TSNE和UMAP焕檬。

一般來(lái)說(shuō)姆坚，TSNE為局部最優(yōu)的結(jié)果，邊界較為清晰实愚；UMAP可視化結(jié)果一般為全局最優(yōu)兼呵，但是邊界沒(méi)有TSNE清晰。但是聚類的結(jié)果與可視化的方法沒(méi)有任何關(guān)系腊敲，比如上圖击喂，雖然圖A和圖B圖形不一樣，但是其聚類結(jié)果完全一致碰辅。

4.亞 群 細(xì) 分 策 略

一般單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組很少能夠一次性得到符合預(yù)期的結(jié)果懂昂，需要對(duì)結(jié)果需要調(diào)整，比如需要對(duì)亞群數(shù)目進(jìn)行調(diào)整没宾。

如果使用Seurat(https://satijalab.org/seurat/)工具的話凌彬，可以通過(guò)調(diào)整FindClusters函數(shù)的resolution參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，一般可以設(shè)0.1-1之間循衰，這個(gè)值越高吉懊，得到亞群數(shù)目越多救斑，但是細(xì)胞亞群數(shù)目不能太多地技，不然后續(xù)分析比較耗費(fèi)精力朗鸠。

另外一種需要進(jìn)一步或者調(diào)整結(jié)果的是，對(duì)感興趣的細(xì)胞亞群進(jìn)行亞群細(xì)分顽素，可以把感興趣的一個(gè)亞群或者多個(gè)亞群提取出來(lái)咽弦，然后再進(jìn)行亞群細(xì)分。

亞群細(xì)分一般有兩種方式：第一種胁出，通過(guò)分辨率型型，可以使亞群數(shù)目增多。比如下圖的1亞群全蝶，可以看到1亞群和1亞群的細(xì)分的圖形一致闹蒜；第二種寺枉，將此亞群提取出來(lái)，然后再整體的按照之前分析的pipeline進(jìn)行重新分析绷落。因此其亞群細(xì)分的結(jié)果圖形會(huì)發(fā)生變化姥闪，比如下圖的7亞群細(xì)分。

5.亞 群 功 能 分 析

一般進(jìn)行簡(jiǎn)單細(xì)胞亞群分析后砌烁，會(huì)再對(duì)亞群進(jìn)行差異分析筐喳。進(jìn)行差異分析時(shí)，一般是選擇該亞群與除了該亞群以外所有的亞群進(jìn)行分析函喉，一般閾值有pct（亞群中某個(gè)基因表達(dá)的占比）和差異倍數(shù)（平均表達(dá)量）避归，對(duì)于Seurat工具來(lái)說(shuō)，差異倍數(shù)一般設(shè)為0.25管呵，pct閾值一般是該亞群和該亞群以外所有亞群至少一個(gè)的pct值大于0.1梳毙。通過(guò)此方法得到的差異基因，也認(rèn)為是marker基因捐下，即每個(gè)亞群特異的基因账锹。

根據(jù)上述方法得到的差異基因，進(jìn)行功能分析蔑担，了解每個(gè)亞群特異的功能牌废，一般會(huì)進(jìn)行GO和KEGG分析咽白，然后通過(guò)氣泡圖展示差異啤握，如下圖所示：

6.細(xì) 胞 亞 群 鑒 定

根據(jù)上述得到的marker基因，對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定晶框，這也是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析最重要的一步排抬，也是最關(guān)鍵的一步，通常需要花費(fèi)大量的精力進(jìn)行細(xì)胞亞群鑒定授段。

通常細(xì)胞亞群鑒定的方式有如下四種：傳統(tǒng)經(jīng)典marker基因蹲蒲、自動(dòng)化鑒定工具、其他單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)映射侵贵、與bulk RNA相關(guān)性分析届搁。

6.1傳統(tǒng)經(jīng)典marker基因

根據(jù)已知的細(xì)胞類型的marker基因進(jìn)行細(xì)胞亞群鑒定。如上圖右上角小提琴圖窍育，可以明顯看出PF4基因在亞群7特異性表達(dá)卡睦，因此可以根據(jù)此基因?yàn)槟承┘?xì)胞類型marker基因進(jìn)行細(xì)胞亞群鑒定。

一般亞群鑒定不是單獨(dú)一個(gè)基因漱抓，可能需要多個(gè)基因表锻。說(shuō)到這里，我們需要知道傳統(tǒng)經(jīng)典的marker基因乞娄，這個(gè)表格從哪兒來(lái)呢瞬逊？

一般有如下兩個(gè)常用數(shù)據(jù)庫(kù)：
CellMarker：http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/
panglaodb：https://panglaodb.se/index.html

不過(guò)這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都只是提供了人和小鼠相關(guān)的數(shù)據(jù)显歧，沒(méi)有其他物種的，因此其他物種最好通過(guò)查詢相應(yīng)的文獻(xiàn)來(lái)確定确镊。

6.2自動(dòng)化鑒定工具

目前單細(xì)胞亞群鑒定的自動(dòng)化工具有很多種士骤，至少有20-30種，這些工具主要有兩種蕾域，一種是自動(dòng)化鑒定敦间，另外一種是半監(jiān)督的方式。

自動(dòng)化鑒定比較常見(jiàn)的singleR束铭，內(nèi)置了人和小鼠的數(shù)據(jù)廓块，其基本原理是通過(guò)計(jì)算單細(xì)胞與內(nèi)置數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)性來(lái)判斷細(xì)胞類型，也可以自己建數(shù)據(jù)庫(kù)契沫。地址為：https://github.com/dviraran/SingleR

優(yōu)點(diǎn)是不用自己提供細(xì)胞類型以及相應(yīng)的marker基因带猴，但是其缺點(diǎn)是只能鑒定出數(shù)據(jù)庫(kù)已有的細(xì)胞類型以及不能鑒定特別細(xì)的細(xì)胞亞群，特別細(xì)的細(xì)胞亞群比如CD4+T 細(xì)胞亞群再細(xì)分懈万，就沒(méi)法完成了拴清。

另外一種是半監(jiān)督的方式，需要自己提供細(xì)胞類型的marker基因会通，也就是只能鑒定自己提供的細(xì)胞類型口予，一是限制了細(xì)胞類型，另一方面則是可以鑒定任意感興趣的細(xì)胞類型涕侈，不過(guò)這種方式需要老師具有較深厚的生物學(xué)背景沪停。

比較常用的軟件有cellassign和Garnett，其中cellassign只要提供細(xì)胞類型以及對(duì)應(yīng)的基因裳涛，軟件根據(jù)TensorFlow機(jī)器學(xué)習(xí)的方法木张，對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行打分。Garnett是擬時(shí)間分析工具-monocle工具編寫(xiě)的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的一種細(xì)胞簡(jiǎn)單快速注釋細(xì)胞類型的工具端三。它不僅僅提供了根據(jù)基因鑒定細(xì)胞亞群舷礼，還可以通過(guò)設(shè)定基因表達(dá)量閾值、或者不含某個(gè)基因來(lái)篩選郊闯，而且官方提供了一定數(shù)目的細(xì)胞類型的marker基因list妻献。

cellassign地址：https://irrationone.github.io/cellassign/index.html
Garnett地址：https://cole-trapnell-lab.github.io/garnett/

6.3不同單細(xì)胞數(shù)據(jù)映射

其實(shí)現(xiàn)在很多人都會(huì)問(wèn)，現(xiàn)在已經(jīng)有那么多單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)团赁，為什么不可以利用已知的單細(xì)胞數(shù)據(jù)來(lái)鑒定未知單細(xì)胞數(shù)據(jù)育拨？

其實(shí)是可以的，而且這種操作的方法和工具還挺多的然痊，比較常用的是Seurat工具中有個(gè)TransferData 函數(shù)至朗，可以將別的數(shù)據(jù)標(biāo)簽映射到未知的數(shù)據(jù)，從而鑒定細(xì)胞類型剧浸，測(cè)試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性可達(dá)90%以上锹引。地址：https://satijalab.org/seurat/v3.1/integration.html

6.4與Bulk RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析

另外一種比較常見(jiàn)細(xì)胞亞群鑒定方式就是矗钟，用單細(xì)胞屬于相應(yīng)細(xì)胞類型的細(xì)胞系測(cè)序獲得的Bulk RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，得到相似性熱圖嫌变，判斷細(xì)胞類型吨艇，結(jié)果如下圖。

此方法是比較耗費(fèi)精力腾啥，需要收集相應(yīng)細(xì)胞類型的Bulk RNA數(shù)據(jù)东涡，另外單細(xì)胞數(shù)據(jù)表達(dá)的模式可能與Bulk RNA數(shù)據(jù)不太一致，因此此方法一般用于數(shù)據(jù)驗(yàn)證倘待，不作為鑒定結(jié)果疮跑。

最后說(shuō)一句，其實(shí)也有一些使用marker基因進(jìn)行細(xì)胞亞群鑒定的小工具凸舵。比如可以使用Y叔的Clusterprofle工具祖娘，通過(guò)對(duì)輸入的marker基因進(jìn)行富集，得到可能細(xì)胞亞群啊奄，不過(guò)有個(gè)缺點(diǎn)就是渐苏，對(duì)于一些通過(guò)流式得到的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比如某個(gè)細(xì)胞只有CD4+和CD8+細(xì)胞菇夸，可能CD4+和CD8+基因不是marker基因琼富，不在marker基因list中，因此鑒定會(huì)有些問(wèn)題庄新。

7.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣品差異分析

10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組一次可獲取10000個(gè)細(xì)胞鞠眉。在研究的時(shí)候，不能一個(gè)細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞研究摄咆，一般通過(guò)降維聚類凡蚜，將表達(dá)模式相同的細(xì)胞聚類在一起人断，即得到細(xì)胞亞群吭从，隨后的研究是基于細(xì)胞亞群進(jìn)行。

研究不同樣品恶迈、不同處理?xiàng)l件涩金、不同組織樣品的時(shí)候，一般是在同一個(gè)亞群之下進(jìn)行的研究暇仲，畢竟不同類型的細(xì)胞其表達(dá)模式肯定不一樣步做，這個(gè)可比性不太強(qiáng)。比如在使用某種藥物處理后奈附，想看看CD4+ naive T細(xì)胞有什么變化全度，然后挑取CD4+ naive T細(xì)胞亞群，直接比較兩個(gè)樣品的細(xì)胞基因表達(dá)差異斥滤，然后對(duì)此基因進(jìn)行功能注釋将鸵，了解哪些關(guān)鍵基因發(fā)生變化勉盅，代謝通路發(fā)生了變化。

由于10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)較smart-seq2的數(shù)據(jù)較低顶掉，因此一般進(jìn)行差異分析的時(shí)候草娜，其閾值不能直接按照smart-seq2的閾值設(shè)置，seurat一般設(shè)為差異倍數(shù)的log值為0.25痒筒。

我們也可以根據(jù)每個(gè)樣品在某個(gè)亞群中所有細(xì)胞基因的平均表達(dá)量作散點(diǎn)圖宰闰，這樣能更直觀地展示差異基因，比如下圖展示了top10基因簿透，一般越靠近y軸的基因移袍，就是STIM高表達(dá)，越靠近x軸老充，就是CTRL高表達(dá)咐容。下圖使用了不同的差異基因展示方式。

8.基 因 集 富 集 分 析

除了對(duì)常規(guī)的差異基因或者marker基因的功能分析以外蚂维，還有一種就是對(duì)某個(gè)基因集進(jìn)行富集分析或者說(shuō)打分戳粒。這種分析方式不需要在不同樣品之間進(jìn)行比較，關(guān)注點(diǎn)是某個(gè)基因集在每個(gè)細(xì)胞虫啥、每個(gè)細(xì)胞亞群中的富集程度蔚约，其中這樣分析的內(nèi)容可就多了。

基因集可以根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置涂籽，比如關(guān)注T細(xì)胞激活的話苹祟，給定T細(xì)胞激活的基因集，就可以看到每個(gè)細(xì)胞的T細(xì)胞激活程度评雌∈鞣悖基因集分析比較常用的工具是GSVA（Gene Set Variation Analysis），鏈接如下：http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/GSVA.html

這里需要注意的是該工具盡量不要使用counts表達(dá)矩陣作為輸入數(shù)據(jù)景东，如果實(shí)在需要用counts表達(dá)矩陣作為輸入文件的話砂轻，需要修改GSVA的參數(shù)kcdf，設(shè)為Poisson斤吐，其默認(rèn)為Gaussian搔涝。但是使用Poisson的時(shí)候，其耗時(shí)巨大和措，因此不建議使用counts表達(dá)矩陣庄呈。

一般建議使用連續(xù)性值，比如log-CPMs, log-RPKMs or log-TPMs派阱，這樣分析速度快很多诬留，一般兩三萬(wàn)細(xì)胞的話，30個(gè)基因集以內(nèi)的，24小時(shí)內(nèi)就可以完成文兑。

至于基因集的設(shè)置傀广，一般可以使用GO Term、KEGG代謝通路彩届、reactome代謝通路伪冰、或者GSEA官方基因集、自己提供的基因集都可以樟蠕，下圖為GSVA結(jié)果展示贮聂。

9.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)育軌跡分析

發(fā)育軌跡分析即擬時(shí)間分析，就是根據(jù)細(xì)胞中基因的表達(dá)量寨辩，基于特定基因?qū)?xì)胞進(jìn)行排序的一個(gè)過(guò)程吓懈，其結(jié)果主要反映細(xì)胞發(fā)育的先后。

一般軟件得到的結(jié)果是沒(méi)法確定發(fā)育起始點(diǎn)靡狞，需要根據(jù)某些基因來(lái)判斷發(fā)育起始點(diǎn)耻警，這里特定基因可以是軟件自動(dòng)計(jì)算差異的基因，也可以是已知的跟發(fā)育相關(guān)的基因甸怕。其中最常用的發(fā)育軌跡的工具是monocle（http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/）

當(dāng)然發(fā)育軌跡分析的工具有很多甘穿，目前能做此類分析結(jié)果的工具至少有60+以上，比如dyno (https://github.com/dynverse/dynmethods)工具搜集了60+梢杭，做了一個(gè)所有擬時(shí)間分析的集合温兼，包括常用的monocle(http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/)、PAGA(https://github.com/theislab/paga)武契、pCreode(https://github.com/KenLauLab/pCreode)等等募判，不過(guò)此軟件是基于docker，因此需要系統(tǒng)有root權(quán)限咒唆。

不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有不同的特征届垫，可能某個(gè)軟件并不通用的。因此dyno工具通過(guò)其前期的表達(dá)特征全释，提供該數(shù)據(jù)對(duì)所有軟件的最優(yōu)適配的方案装处，可以選擇最優(yōu)的方案。

不過(guò)此工具也有局限性恨溜，比如工具不全符衔、工具的版本更新不及時(shí)（monocle現(xiàn)在為版本2）、某些功能的缺失糟袁、與其他工具的兼容性有待提升等等。因此沒(méi)有任何萬(wàn)能的工具躺盛，只能根據(jù)需要進(jìn)行挑選工具项戴。

這一篇中，介紹了常見(jiàn)的亞群分析的內(nèi)容和工具槽惫，下一篇我們會(huì)介紹詳細(xì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組其他高級(jí)分析過(guò)程和原理周叮，請(qǐng)大家繼續(xù)關(guān)注辩撑。

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