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標(biāo)題：Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry
期刊：NATURE IMMUNOLOGY
影響因子：23.53
日期：06 May 2019
通訊作者介紹
擔(dān)任數(shù)據(jù)科學(xué)中心（BWH，HMS）的主任扬卷，并被任命為Broad Institute的準(zhǔn)會(huì)員。此外酸钦，他還活躍于臨床怪得，并在布萊根婦女醫(yī)院關(guān)節(jié)炎中心看病人。在斯坦福大學(xué)獲得醫(yī)學(xué)博士學(xué)位之后卑硫，Raychaudhuri繼續(xù)從事內(nèi)科臨床培訓(xùn)徒恋，然后在布萊根婦女醫(yī)院接受了風(fēng)濕病專(zhuān)科培訓(xùn)。他同時(shí)與Mark Daly博士一起在Broad研究所完成了人類(lèi)遺傳學(xué)的博士后培訓(xùn)欢伏。自2010年加入哈佛醫(yī)學(xué)院以來(lái)入挣，他為了解類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和其他免疫介導(dǎo)的疾病的遺傳基礎(chǔ)做出了貢獻(xiàn)。他還一直在設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算方法的最前沿硝拧，以將遺傳關(guān)聯(lián)信號(hào)定位到因果變體径筏，并在功能信息的背景下解釋人類(lèi)遺傳數(shù)據(jù)葛假。他目前在結(jié)核病，I型糖尿病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人類(lèi)遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)方面擁有活躍的研究計(jì)劃滋恬，尤其專(zhuān)注于使用基因組策略來(lái)了解CD4 + T細(xì)胞生物學(xué)聊训。
研究背景
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種自身免疫性疾病，在關(guān)節(jié)組織的滑膜中具有慢性炎癥恢氯。這種炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞带斑，影響正常關(guān)節(jié)功能。但目前對(duì)關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞類(lèi)群狀態(tài)還是不夠明確的勋拟，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)可以在炎癥組織中尋找關(guān)鍵細(xì)胞亞群及其活化狀態(tài)這將為定義RA新治療靶標(biāo)提供必要的數(shù)據(jù)理論支持勋磕。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD4 + T細(xì)胞，B細(xì)胞敢靡，單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞已確定與RA發(fā)病機(jī)理相關(guān)挂滓。
樣本及測(cè)序簡(jiǎn)介
樣本來(lái)源:滑膜組織,作者招募了36名RA患者，15名OA患者啸胧，并從超聲引導(dǎo)下的活檢中或關(guān)節(jié)置換獲得滑膜組織.
實(shí)驗(yàn)手段包括質(zhì)譜流式杂彭、Bulk RNA-seq、scRNA-seq
Bulk RNA-seq
1.對(duì)流式分選的細(xì)胞（T cells, B cells, monocytes, and synovial fibroblasts）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序吓揪；工具：Illumina MiSeq ; 比對(duì)：Ensembl version 83 transcripts;
2.QC:（1）定義共同基因?yàn)樵?code>95%的樣品有至少一條reads支持；（2）共同基因占比少于
99%的樣本定義為低質(zhì)量樣本在后續(xù)分析中將被剔除所计；3.共獲得
167個(gè)高質(zhì)量樣本,包括45 fibroblast samples, 46 monocyte samples, 47 T cell samples, and 29 B cell samples;scRNA-seq
1.方法：CEL-Seq2; 工具：HiSeq 2500;Reads 通過(guò)STAR2.5.2b比對(duì)到
hg19柠辞；2.QC:作者發(fā)現(xiàn)由少量reads表示的分子更可能是來(lái)自其他細(xì)胞的污染物分子，所以開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單的算法來(lái)設(shè)置每分子最小讀數(shù)的閾值主胧。We used
2 marker genes expected to be exclusively expressed in each of the four cell types: PDGFRA and ISLR for fibroblasts, CD2 and CD3D for T cells, CD79A and RALGPS2 for B cells, and CD14 and C1QA for monocytes. 然后計(jì)算這些基因在該表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型中的高于閾值的表達(dá)定義為真陽(yáng)性叭首，在不該表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型中的高于閾值的表達(dá)定義為假陽(yáng)性。遍歷表達(dá)閾值分別為1-20之間的數(shù)值踪栋，選取能夠最大化真陽(yáng)性/假陽(yáng)性比值的值為最終閾值焙格。然后作者進(jìn)行以下條件的篩選：（1）細(xì)胞檢測(cè)到的genes數(shù)>1000;(2)線粒體相關(guān)基因的表達(dá)占比少于25%；結(jié)合質(zhì)譜流式夷都，scRNA數(shù)據(jù)
1.作者收集6個(gè)富含白細(xì)胞眷唉、9個(gè)白細(xì)胞缺乏的RA和11個(gè)OA樣品用于質(zhì)譜流式分析；
2.雙門(mén)控通道選定活細(xì)胞：B細(xì)胞（CD45 + CD3-CD14-CD19 +）囤官，成纖維細(xì)胞（CD45-PDPN +）冬阳，單核細(xì)胞（CD45 + CD3-CD14 +）和T細(xì)胞（CD45 + CD3 + CD14-）；
3.作者基于CCA分析整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)党饮，開(kāi)發(fā)一種基于圖的無(wú)偏聚類(lèi)pipeline對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析肝陪；
下游數(shù)據(jù)分析策略
（1）細(xì)胞分群及數(shù)據(jù)整合；作者利用流式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群后刑顺，以bulk RNA-seq作為reference point氯窍，利用CCA找到大量RNA-seq樣品和scRNA-seq細(xì)胞的線性組合饲常，以創(chuàng)建最大相關(guān)的基因表達(dá)譜。作者使用來(lái)自scRNA-seq的最佳標(biāo)記基因與CCA結(jié)果關(guān)聯(lián)狼讨，以建立每個(gè)scRNA-seq簇與每個(gè)質(zhì)量細(xì)胞計(jì)數(shù)簇之間的關(guān)系贝淤；
（2）流式定義一部分RA滑膜組織中富含白細(xì)胞；組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的變化反映了源關(guān)節(jié)中的局部疾病活動(dòng)熊楼。作者計(jì)算了其它樣本與OA的馬氏距離（感謝微信公眾號(hào)生信寶典對(duì)馬氏距離的解釋?zhuān)厚R氏距離 (Mahalanobis distance)是由印度統(tǒng)計(jì)學(xué)家馬哈拉諾比斯 (P. C. Mahalanobis)提出的霹娄，表示數(shù)據(jù)的協(xié)方差距離。它是一種有效的計(jì)算兩個(gè)未知樣本集的相似度的方法鲫骗。與歐氏距離不同的是犬耻，它考慮到各種特性之間的聯(lián)系，并且是尺度無(wú)關(guān)的(scale-invariant)执泰，即獨(dú)立于測(cè)量尺度枕磁。），引入最大OA距離作為滑膜中富含白細(xì)胞的閾值（> 4.5）术吝；為了驗(yàn)證炎癥分類(lèi)的有效性计济，作者評(píng)估了組織學(xué)的炎癥狀態(tài)，并且通過(guò)Krenn inflammation score (一種炎癥評(píng)價(jià)指標(biāo)) 對(duì)切片上的炎癥狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估排苍；
（3）單細(xì)胞分析揭示不同細(xì)胞亞型沦寂；在5,265個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)1,142 B cells, 1,844 fibroblasts, 750 monocytes and 1529 T cells (作者在這里說(shuō)明傳統(tǒng)基于PCA的分類(lèi)batch effect較為明顯，所以作者采用CCA-based clustering), 作者共分出來(lái)18 cell clusters; 成纖維細(xì)胞中淘衙，鑒定了四個(gè)亞群：CD34 +亞細(xì)胞成纖維細(xì)胞传藏，HLA-DRAhi成纖維細(xì)胞，DKK3 +成纖維細(xì)胞和CD55 +lining成纖維細(xì)胞; 在單核細(xì)胞中, 作者鑒定了IL1B +促炎單核細(xì)胞彤守，NUPR1 +單核細(xì)胞毯侦，C1QA +單核細(xì)胞和干擾素（IFN）活化的單核細(xì)胞；在T細(xì)胞中具垫，鑒定了三個(gè)CD4 +簇：CCR7 + T細(xì)胞侈离，F(xiàn)OXP3 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）和PDCD1 + TPH和TFH細(xì)胞;三個(gè)CD8 +簇：GZMK + T細(xì)胞，GNLY + GZMB +細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）和GZMK + GZMB + T細(xì)胞筝蚕。在B細(xì)胞內(nèi)卦碾，鑒定了四個(gè)細(xì)胞簇，包括幼稚IGHD + CD27-和IGHG3 + CD27 +記憶B細(xì)胞饰及，具有高表達(dá)ITGAX（也稱(chēng)為CD11c）的自身免疫相關(guān)B細(xì)胞（ABC）簇和具有高免疫球蛋白基因表達(dá)和XBP1的漿母細(xì)胞簇蔗坯；（作者的細(xì)胞分型是比較符合免疫分型的，大家也可以采用以上marker對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行亞分型燎含，不建議完全參照某一篇文章定義所有細(xì)胞分型）
（4）由細(xì)胞因子激活和MHC II表達(dá)定義不同的滑膜成纖維細(xì)胞宾濒；在Bulk seq中，與OA相比屏箍，leukocyte-rich RA中HLA-DRAhi細(xì)胞 HLA绘梦，IL6的表達(dá)情況更為明顯橘忱，且在GO富集中，與MHC classII提呈和干擾素信號(hào)通路有關(guān)卸奉；然后作者通過(guò)scRNA seq 驗(yàn)證了該觀點(diǎn)钝诚。
（5）激活狀態(tài)定義了滑膜單核細(xì)胞的異質(zhì)性；在來(lái)自患有白細(xì)胞豐富的RA和OA的個(gè)體的大量RNA-seq單核細(xì)胞樣品中榄棵，作者發(fā)現(xiàn)與IL1B +單核細(xì)胞相關(guān)的基因凝颇，包括NR4A2，HBEGF疹鳄，PLAUR和IFN激活的基因IFITM3顯著在富含白細(xì)胞的RA樣品中上調(diào)拧略。相反，與富含白細(xì)胞的RA相比瘪弓，與NUPR1 +單核細(xì)胞（SC-M2）相關(guān)的標(biāo)記基因下調(diào)垫蛆。作者取每個(gè)單核細(xì)胞scRNA-seq子集的top標(biāo)記基因（AUC> 0.7），并在bulk seq中測(cè)試gene在RA與OA RNA-seq數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)腺怯。
作者發(fā)現(xiàn)富含白細(xì)胞的RA滑膜與OA相比具有更大的IL1B +單核細(xì)胞和IFN激活的單細(xì)胞豐度袱饭，但更低NUPR1 +單核細(xì)胞的豐度。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞因子激活驅(qū)動(dòng)活動(dòng)性RA滑膜中獨(dú)特單核細(xì)胞群的擴(kuò)增呛占。利用基因組富集分析（GSEA）虑乖，作者測(cè)試了MSigDB（分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)）免疫基因組，發(fā)現(xiàn)IL1B +單核細(xì)胞（SC-M1）脂多糖反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平相對(duì)較高晾虑；（一句話决左，單核細(xì)胞異質(zhì)性較強(qiáng)）
（6）滑膜CD4和CD8T細(xì)胞的異質(zhì)性；作者在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)CD4 +和三個(gè)CD8 + T細(xì)胞亞群（其實(shí)作者分出的亞群CD4比較好分走贪，CD8多為exhausted T cell耗竭性基因的表達(dá)）鑒定了三個(gè)CD4+簇：CCR7 + T細(xì)胞，F(xiàn)OXP3 +調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）和PDCD1 + TPH和TFH細(xì)胞; 三個(gè)CD8 +簇：GZMK + T細(xì)胞惑芭，GNLY + GZMB +細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）和GZMK + GZMB + T細(xì)胞坠狡。與OA相比，CXCL13在富含白細(xì)胞的OA的TPH細(xì)胞中上調(diào)表達(dá); 作者通過(guò)質(zhì)譜流式遂跟，鑒定出9個(gè)T cell clusters, 并通過(guò)結(jié)合bulk seq發(fā)現(xiàn)CXCL13, TIGIT and CTLA4在CD4+PD-1ICOS+cluster中富集逃沿；
（7）通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq發(fā)現(xiàn)在RA滑膜中自身免疫相關(guān)B細(xì)胞增加；細(xì)胞分型為幼稚B細(xì)胞（SC-B1）幻锁，記憶B細(xì)胞（SC-B2）凯亮，ITGAX + ABC細(xì)胞（SC-B3）和漿母細(xì)胞（SC-B4）；SC-B3細(xì)胞表達(dá)高水平的ITGAX和TBX21（T-bet）哄尔，它們是自身免疫相關(guān)B細(xì)胞的標(biāo)志物假消，AICDA的高表達(dá)與最近報(bào)道的來(lái)自系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）樣品的外周血的CD11c + B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析一致。干擾素刺激的基因（GBP1和ISG15）也在ABCs（SC-B3）中表達(dá)并在富含白細(xì)胞的RA中上調(diào)岭接。質(zhì)譜流式分型劃分10個(gè)細(xì)胞clusters,進(jìn)一步分型發(fā)現(xiàn)CD11c +細(xì)胞內(nèi)的三個(gè)亞組：IgM-IgD-HLA-DR ++ CD20 + CD11c +富拗，CD38 + HLA-DR ++ CD20-CD11c +和IgM + IgD + CD11c +臼予。
（8）通過(guò)單細(xì)胞分析揭示炎癥途徑和效應(yīng)模塊; 為了確定與富含白細(xì)胞的RA相關(guān)的途徑，作者使用GO分析鑒定了I型干擾素反應(yīng)和炎癥反應(yīng)（單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）啃沪，F(xiàn)c受體信號(hào)傳導(dǎo)（單核細(xì)胞）粘拾，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo) （成纖維細(xì)胞）和干擾素γ（T細(xì)胞）。富含白細(xì)胞的RA樣本在成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞中具有顯著更高的基因表達(dá)：炎癥反應(yīng)基因（PTGS2创千，PTGER3和ICAM1）缰雇，干擾素應(yīng)答基因（IFIT2，RSAD2追驴，STAT1和XAF1）械哟，以及趨化因子或細(xì)胞因子基因（CCL2和CXCL9），與干擾素激活的協(xié)同趨化反應(yīng)一致氯檐。 T細(xì)胞具有干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）的上調(diào)戒良，包括IRF7和IRF9，并且單核細(xì)胞具有IRF7冠摄，IRF8和IRF9的上調(diào)糯崎。Toll樣受體信號(hào)通路富含白細(xì)胞豐富的RA組織中的B細(xì)胞和單核細(xì)胞。
在單細(xì)胞水平河泳，TLR10僅由活化的B細(xì)胞表達(dá)沃呢，表明TLR10在B細(xì)胞譜系中具有功能性作用。相反拆挥，TLR8在所有RA單核細(xì)胞亞群中升高薄霜。造血細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子IRF8在顯著部分的單核細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，其協(xié)同調(diào)節(jié)RA滑膜中單核細(xì)胞和活化B細(xì)胞的分化纸兔。 SLAMF7由促炎單核細(xì)胞（SC-M1）惰瓜，IFN激活的單核細(xì)胞（SC-M4），CD8 + T細(xì)胞和漿母細(xì)胞（SC-B4）高度表達(dá)汉矿。
臨床意義及借鑒點(diǎn)
（1）該篇文章強(qiáng)調(diào)可以將sublining fibroblast作為治療RA的潛在靶點(diǎn)崎坊；（a major source of proinflammatory cytokines）
（2）第一次在富含白細(xì)胞的RA中發(fā)現(xiàn)自身免疫相關(guān)性B細(xì)胞；
（3）多維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析洲拇，開(kāi)發(fā)基于CCA算法的流程奈揍，對(duì)每個(gè)細(xì)胞分群更為詳細(xì)。
（4）對(duì)其他免疫系統(tǒng)疾病可以采取類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案赋续，本篇文章具有重要借鑒意義男翰。
（5）代碼工具：https://github.com/immunogenomics/amp_phase1_ ra
