背景介紹
1. Pb1是一個(gè)稻瘟病抗性基因酒繁，可以使水稻對(duì)稻瘟病表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性劝堪。
2. Pb1編碼一個(gè)CC-NBS-LRR蛋白，但是Pb1并沒有P-loop榴嗅，并且其他的幾個(gè)R蛋白保守的motif也發(fā)生退化拇惋，暗示Pb1可能有不同的機(jī)制周偎。
3. 有研究表明，一些R蛋白的核定位或者細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)其功能的行使非常重要撑帖。
4. SA在植物系統(tǒng)獲得性免疫過程中發(fā)揮重要作用蓉坎。在水稻SA信號(hào)通路中，WRKY45發(fā)揮重要作用胡嘿。
科學(xué)問題
本文對(duì)Pb1增強(qiáng)稻瘟病抗性的分子機(jī)制進(jìn)行了解析蛉艾，發(fā)現(xiàn)了Pb1和SA信號(hào)通路之間的crosstalk。
主要結(jié)論
1. Pb1的CC domain可以和WRKY45發(fā)生互作
1）之前有研究報(bào)道衷敌，R蛋白的CC domain可以和WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作勿侯。受此啟發(fā)，本文對(duì)Pb1和是否也能和WRKY蛋白家族成員互作進(jìn)行了檢測(cè)缴罗。
2）作者挑選了不同家族的WRKY轉(zhuǎn)錄因子助琐，通過酵母雙雜系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，只有WRKY45會(huì)和Pb1-CC發(fā)生互作面氓，并通過GST-pull down兵钮，Co-IP以及 split LUC系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證。
3）通過預(yù)測(cè)及定點(diǎn)突變舌界，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)疏水氨基酸影響Pb1-CC和WRKY45的互作掘譬。
新問題：Pb1-CC和WRKY45互作，對(duì)Pb1介導(dǎo)的稻瘟病抗性有什么影響呢呻拌？
2. Pb1介導(dǎo)的稻瘟病抗性依賴于WRKY45
1）WRKY45轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都和稻瘟病抗性正相關(guān)
2）在Pb1+或者Pb1OX背景下knock down WRKY45葱轩，會(huì)使稻瘟病抗性降低
3）過表達(dá)影響和WRKY45互作的位點(diǎn)突變的Pb1（Pb1-Quad），稻瘟病抗性增強(qiáng)效果減弱
3. Pb1的核定位是增加稻瘟病抗性必須的
1）GFP-Pb1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有定位柏锄，WRKY45-GFP定位在細(xì)胞核中酿箭。并通過核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)對(duì)Pb1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了驗(yàn)證。
2）Pb1的核定位對(duì)其功能是不是必須的趾娃？
構(gòu)建了HA-Pb1-NES載體，轉(zhuǎn)化植株發(fā)現(xiàn)缔御，稻瘟病抗性減弱
3）既然Pb1的核定位那么重要抬闷，稻瘟菌侵染會(huì)改變其亞細(xì)胞定位嗎？
并不會(huì)！
原文沒有回答的問題：Pb1的胞質(zhì)定位是不是也是其增強(qiáng)稻瘟病抗性所必須的笤成？
4.Pb1介導(dǎo)的稻瘟病抗性部分依賴于SA通路
WRKY45是SA通路中的重要組分评架，Pb1介導(dǎo)的稻瘟病抗性和SA有什么關(guān)系嗎？
在Pb1OX背景下過表達(dá)SA降解蛋白NahG炕泳，會(huì)降低稻瘟病抗性纵诞，說明Pb1介導(dǎo)的稻瘟病抗性部分依賴于SA通路。
5.Pb1抑制ubiquitin蛋白酶體對(duì)WRKY45的降解
1）在使用小麥胚芽提取物系統(tǒng)表達(dá)WRKY45蛋白時(shí)培遵，添加MG132增加WRKY45蛋白表達(dá)量浙芙，說明WRKY45會(huì)被ubiquitin蛋白酶體降解
2）WRKY45和Pb1共表達(dá)也會(huì)增加WRKY45蛋白含量，暗示Pb1可能會(huì)抑制UBQ對(duì)WRKY45的降解籽腕，增加其穩(wěn)定性嗡呼。由于小麥胚芽提取物是外源表達(dá)系統(tǒng)，在水稻中是不是也是這樣呢皇耗？
3）將WRKY45和Pb1在水稻原生質(zhì)體中共表達(dá)南窗，也會(huì)增加WRKY45的含量，并且隨著Pb1蛋白的增加郎楼，WRKY45也增加万伤。
問題：Pb1穩(wěn)定WRKY45是直接的還是間接的？和他倆互作有無關(guān)系呜袁？
4）Pb1-Quad和Pb1-NES對(duì)WRKY45的穩(wěn)定效果減弱敌买，說明Pb1通過和WRKY45互作直接穩(wěn)定WRKY45蛋白。
技術(shù)方法
水稻核質(zhì)分離
小麥胚芽提取物體外翻譯系統(tǒng)
體外Co-IP
Take Home Message
1）對(duì)于一些生物體內(nèi)容易降解或表達(dá)量低的蛋白傅寡，可以分別進(jìn)行體外翻譯放妈，得到純化蛋白后，再進(jìn)行體外的孵育和Co-IP實(shí)驗(yàn)荐操。
2）WRKY45一直有雙帶芜抒，和Pb1共表達(dá)時(shí)，下面的條帶變?nèi)跬衅簦恼虏]有對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行解釋宅倒。
3）R蛋白易降解，表達(dá)量低屯耸，不容易檢測(cè)到拐迁。把標(biāo)簽放在R蛋白的N端和C端對(duì)R蛋白的檢測(cè)及功能有沒有影響？
