摘要：

選擇性剪接(AS)在哺乳動(dòng)物基因組中普遍存在，但跨物種比較主要局限于成體組織，大多數(shù)AS事件的功能仍不清楚时呀。研究人員評(píng)估了六種哺乳動(dòng)物和一只鳥類的七個(gè)器官產(chǎn)前和產(chǎn)后發(fā)育中的AS模式诫尽。分析表明慈省，發(fā)育動(dòng)態(tài)AS事件,特別是在大腦中普遍存在区岗，實(shí)質(zhì)上比非動(dòng)態(tài)更加保守略板。在發(fā)育過程中，包含頻率增加的盒式外顯子顯示出最強(qiáng)的保守和調(diào)控AS信號(hào)慈缔。新近出現(xiàn)的盒式外顯子通常在睪丸發(fā)育的后期被整合叮称，但在進(jìn)化過程中保留的外顯子主要是大腦特異性的。本研究表明藐鹤，控制基因表達(dá)水平和選擇性剪切的程序之間復(fù)雜相互作用是器官發(fā)育的基礎(chǔ)瓤檐，特別是對(duì)大腦和心臟。在這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中娱节，選擇性剪切通過從廣泛表達(dá)的基因中產(chǎn)生組織特異性和時(shí)間特異性的亞型挠蛉，提供了基因的大量功能多樣化。

前言：

選擇性剪接是在前信使RNA中不同地選擇剪接位點(diǎn)以產(chǎn)生不同的RNA和蛋白質(zhì)異構(gòu)體的過程1肄满。選擇性剪接在哺乳動(dòng)物中普遍存在谴古，影響大多數(shù)多外顯子基因，并解釋了巨大的異構(gòu)體多樣性稠歉。許多可供選擇的剪接網(wǎng)絡(luò)和功能的調(diào)節(jié)方面已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)掰担。然而，大多數(shù)可供選擇的異構(gòu)體的功能相關(guān)性仍不清楚2怒炸〈ィ基因組規(guī)模的研究報(bào)告說，只有一小部分選擇性剪接事件表現(xiàn)出進(jìn)化上的保守性或具有其他廣泛的功能支持3-10阅羹。因此勺疼，有人認(rèn)為，選擇性剪接產(chǎn)生的大部分異構(gòu)體多樣性代表轉(zhuǎn)錄噪聲4,6-10灯蝴，盡管這種解釋一直有激烈的爭(zhēng)論8,9,11,12恢口。?

跨物種比較為全面評(píng)估選擇性剪接的功能孝宗、調(diào)控機(jī)制和進(jìn)化動(dòng)力學(xué)提供了一個(gè)強(qiáng)大的框架穷躁；例如，他們揭示了選擇性剪接事件在進(jìn)化過程中的總體快速更替因妇，并確定了祖先哺乳動(dòng)物的剪接調(diào)控因子和相關(guān)的結(jié)合基序5问潭，13。然而婚被，這項(xiàng)工作僅限于成體組織(除外2狡忙，14-17)，盡管選擇性剪接可能在器官發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用2址芯，17灾茁。

為了填補(bǔ)這一關(guān)鍵空白窜觉，我們基于廣泛的RNA測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)集18，生成了七個(gè)物種的七個(gè)器官的發(fā)育選擇性剪接圖譜(https://apps.kaessmannlab.org/alternative-splicing)北专。對(duì)這些圖譜的綜合比較分析揭示了哺乳動(dòng)物器官發(fā)育過程中選擇性剪接的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)和功能相關(guān)性禀挫。

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發(fā)育選擇性剪接圖譜。為了研究發(fā)育選擇性剪接的進(jìn)化拓颓，我們利用了一個(gè)包含1890個(gè)文庫(kù)的RNA-seq數(shù)據(jù)集语婴，該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了從早期器官發(fā)生(心臟的器官中期發(fā)生)到成年的7個(gè)器官(前腦/大腦、后腦/小腦驶睦、心臟砰左、腎臟、肝臟场航、卵巢和睪丸)的發(fā)育缠导，涉及6種哺乳動(dòng)物(人、獼猴溉痢、小鼠酬核、大鼠、兔子和負(fù)鼠)和一只鳥(雞)18只(圖1a适室；我們對(duì)所有物種的轉(zhuǎn)錄區(qū)域進(jìn)行了詳細(xì)的從頭注釋嫡意，包括剪接位點(diǎn)的精確定位(補(bǔ)充數(shù)據(jù)1-7)。這種從頭注釋防止了由于物種之間的基因組注釋質(zhì)量差異而在下游分析中產(chǎn)生的偏差捣辆，并檢測(cè)到新的剪接變體15蔬螟、19、20(補(bǔ)充圖1和方法)汽畴。我們將基因片段定義為兩個(gè)相鄰剪接位點(diǎn)之間的序列(補(bǔ)充圖2)旧巾。可選片段(即并不包括在所有轉(zhuǎn)錄本亞型中的片段)被分為四個(gè)主要的可供選擇剪接類別：可供選擇的盒外顯子忍些、可供選擇的供體片段鲁猩、可供選擇的受體片段和內(nèi)含子保留事件(圖1b)。使用已建立的程序15罢坝、19廓握、20(方法)測(cè)定每個(gè)備選片段和物種間1：1同源外顯子的包涵體頻率(剪接百分比(PSI))(補(bǔ)充數(shù)據(jù)8)。

我們從七個(gè)物種中確定了數(shù)千個(gè)主要編碼可供選擇的剪接事件嘁酿，用于七個(gè)物種的每個(gè)器官中的四個(gè)類別(圖1b隙券，補(bǔ)充表1和方法)。正如之前觀察到的那樣闹司，盒式磁帶外顯子和內(nèi)含子保留是最常見的兩類娱仔。在每個(gè)類別和物種內(nèi)，檢測(cè)到的AS事件的數(shù)量在各組織21之間是可比的(圖1b和補(bǔ)充圖3)游桩。相比之下牲迫，在包涵體頻率隨時(shí)間發(fā)生顯著變化的AS事件中(稱為“發(fā)育動(dòng)態(tài)選擇性剪接”(DevAS)方法)耐朴，腦組織和睪丸脫穎而出，其DevAS事件的數(shù)量和比例比其他器官要大得多(圖1c盹憎，補(bǔ)充圖3和補(bǔ)充數(shù)據(jù)9)隔箍。在性成熟過程中，睪丸的細(xì)胞成分發(fā)生了根本性的變化脚乡，生精細(xì)胞成為主要的22蜒滩、23細(xì)胞。這些細(xì)胞類型都有廣泛的開放染色質(zhì)奶稠，可以促進(jìn)各種類型的轉(zhuǎn)錄噪音俯艰，包括選擇性剪接23-26。我們一致地證明锌订，性成熟的睪丸驅(qū)使睪丸中所有類別的DevAS水平都很高(圖1c)竹握；也就是說，當(dāng)考慮到性成熟之前的發(fā)育階段時(shí)辆飘，睪丸中過量的DevAS就消失了(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)啦辐。因此，睪丸的DevAS信號(hào)可能反映了細(xì)胞成分蜈项，而不是發(fā)育中的選擇性剪接程序開關(guān)芹关。相比之下，當(dāng)分析局限于性成熟前階段時(shí)紧卒，大腦中過多的DevAS事件仍然存在侥衬。因此，大腦中明顯的DevAS信號(hào)可能反映了選擇性剪接對(duì)該器官發(fā)育的特殊重要性跑芳。

我們利用亞抽樣分析研究了不同物種發(fā)育采樣的差異如何解釋檢測(cè)到的選擇性剪接和DevAS事件數(shù)量的差異(圖1b轴总，c和補(bǔ)充圖3)。這些分析表明博个，當(dāng)采樣方案匹配時(shí)怀樟，獼猴中的選擇性剪接和DevAS事件的數(shù)量，我們?nèi)狈υ缙诋a(chǎn)前數(shù)據(jù)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1)盆佣，變得與人類相似(補(bǔ)充圖3)往堡。總之罪塔，我們的子抽樣分析表明投蝉，物種之間的主要差異是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中檢測(cè)到的選擇性剪接事件的數(shù)量多于其他物種(補(bǔ)充圖3)，這與成年后的選擇性剪接分析一致征堪。然而，靈長(zhǎng)類中DevAS事件的數(shù)量并不多這一事實(shí)表明关拒，靈長(zhǎng)類中檢測(cè)到的選擇性剪接事件的過量反映了靈長(zhǎng)類中近中性(輕度有害)的轉(zhuǎn)錄噪聲佃蚜，這與它們較低的有效種群數(shù)量(即較弱的凈化選擇)24庸娱，27有關(guān)。

考慮到大量的DevAS盒式外顯子谐算，以及之前對(duì)這種選擇性剪接種類3熟尉、5、17洲脂、21的強(qiáng)烈關(guān)注斤儿，我們將所有后續(xù)的分析都集中在盒式外顯子上。

選擇性剪接在大腦和心臟發(fā)育中扮演著不成比例的角色恐锦。為了探索樣本之間的全球選擇性剪接關(guān)系往果，我們?cè)诿總€(gè)物種(方法)中進(jìn)行了多維縮放(MDS)分析。樣本按器官聚集一铅，對(duì)于心臟陕贮，特別是腦組織，樣本按發(fā)育階段排序(圖1d和補(bǔ)充圖4)潘飘。這種聚類表明肮之，在發(fā)育過程中，特別是在大腦和心臟的發(fā)育過程中卜录，不同的剪接程序會(huì)不斷分化戈擒。事實(shí)上，基于PSI相關(guān)性對(duì)發(fā)育選擇性剪接狀態(tài)與最早胚胎階段的比較表明艰毒，在發(fā)育過程中備選剪接模式有逐漸的分化峦甩，但大腦的比率要高得多(圖1e和補(bǔ)充圖4)。這與基因表達(dá)水平形成對(duì)比现喳，在基因表達(dá)水平中凯傲，大腦不是異常值(圖1e和補(bǔ)充圖4)。睪丸中選擇性剪接對(duì)性成熟的相關(guān)性突然下降也可見于基因表達(dá)水平嗦篱，這可能是由于具有廣泛轉(zhuǎn)錄噪聲23-26的主要生精細(xì)胞群體的出現(xiàn)(見上一節(jié))冰单。因此，這種下降并不代表功能性選擇性剪接程序的切換灸促，而是反映了由于細(xì)胞組成的根本變化诫欠，性成熟前后的選擇性剪接模式之間缺乏聯(lián)系。再加上腦組織中DevAS事件的較大比例(圖1c)浴栽，這些分析表明荒叼，替代剪接程序在大腦發(fā)育中扮演著不成比例的角色，在較小的程度上典鸡，心臟發(fā)育也是如此被廓。然而，心臟的DevAS模式不那么明顯萝玷，可能是因?yàn)樵谖覀冏钤绲牟蓸与A段嫁乘，心臟比大腦(和其他器官)更發(fā)達(dá)昆婿。

然后我們研究了DevAS的器官特異性。我們發(fā)現(xiàn)蜓斧，大多數(shù)DevAS事件(64-84%取決于物種)是特定于一個(gè)器官的仓蛆，這與成年后的觀察一致12。值得注意的是挎春，在多個(gè)器官中有DevAS的盒式磁帶外顯子中看疙，特定的器官對(duì)比其他器官更頻繁地被觀察到。選擇性剪接預(yù)計(jì)直奋，前腦/大腦和后腦/小腦是最常見的配對(duì)(P<10?34能庆，優(yōu)勢(shì)比(OR)=2.1-6.7，F(xiàn)isher‘s精確檢驗(yàn))帮碰，但令人驚訝的是相味，腎和肝臟對(duì)也過多(P<10?2 9，OR=3.0-7.7殉挽，F(xiàn)isher’s精確檢驗(yàn)鹃锈；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)扰路。這些結(jié)果表明涯保，選擇性剪接程序的調(diào)控在器官之間是共享的鹿响，并可能是協(xié)調(diào)的。值得注意的是傻唾，大多數(shù)DevAS事件(以及一般的選擇性剪接事件)發(fā)生在具有廣泛空間表達(dá)譜的基因中(圖1f)投慈，這一結(jié)果在具有不同外顯子數(shù)量的基因之間是一致的(補(bǔ)充圖5)。例如冠骄，人腦中75%的DevAS事件發(fā)生在具有廣泛空間表達(dá)的基因中(組織特異性<0.5伪煤；圖1f)。這些結(jié)果表明凛辣，DevAS可能允許在無處不在的表達(dá)基因中實(shí)現(xiàn)器官特異性發(fā)育功能抱既。

高度保守的動(dòng)態(tài)發(fā)育選擇性剪接。接下來扁誓，我們描述了器官間選擇性剪接的進(jìn)化保守性防泵。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)(～65-81%)在所有物種中交替剪接的1：1的同源盒式外顯子在所有物種中至少在一個(gè)器官中顯示DevAS蝗敢，幾乎所有(97%)在至少一個(gè)物種中都顯示DevAS捷泞。相比之下，在每個(gè)物種中交替剪接的外顯子中寿谴，只有~31-38%的在至少一個(gè)器官中顯示出DevAS锁右。對(duì)1,441個(gè)同源盒式磁帶外顯子的

MDS分析(圖2a)反映了物種特異性的MDS分析(圖1和補(bǔ)充圖4)。樣本按器官聚集，對(duì)于心臟和腦組織骡湖，樣本按發(fā)育階段排序(圖2a)贱纠。器官主導(dǎo)的聚集性表明器官保存了DevAS信號(hào)峻厚。對(duì)盒式磁帶外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列(即潛在包含選擇性剪接順式調(diào)控序列28的序列)的分析進(jìn)一步支持了DevAS的強(qiáng)保守性响蕴，這表明DevAS的保守性比非DevAS事件高得多(圖2b；所有器官的P<10?10惠桃，Mann-Whitney U檢驗(yàn))浦夷，這與小鼠皮質(zhì)發(fā)育的結(jié)果一致。大腦中高度保守的DevAS事件的例子是DLG3的三個(gè)盒式外顯子辜王，它編碼一種與學(xué)習(xí)障礙有關(guān)的突觸相關(guān)蛋白29劈狐，30(圖2c)。

DevAS的保守性表明呐馆，DevAS的譜系豐富了主動(dòng)調(diào)節(jié)的功能選擇性剪接事件肥缔。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)在DevAS事件中保存閱讀框架的外顯子的比例比非DevAS事件高得多(圖2d汹来；對(duì)于所有器官续膳，P<10?10，比例測(cè)試)收班，這與小鼠皮層發(fā)育的工作一致16坟岔。此外，與其他選擇性剪接外顯子相比摔桦，DevAS外顯子顯著豐富了蛋白質(zhì)內(nèi)在無序區(qū)域的編碼潛力,即蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的潛在調(diào)節(jié)因子31(圖2e社付；除肝臟外，所有器官的P<0.005邻耕，比例檢驗(yàn))鸥咖。

早期發(fā)展與后期發(fā)展的對(duì)比。蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)水平在最早發(fā)育階段的各個(gè)器官中最為相似兄世，然后逐漸分化成不同的發(fā)育程序18啼辣。我們發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)育的推進(jìn)碘饼，選擇性剪接程序通過在器官之間逐漸分化熙兔，特別是對(duì)大腦(圖3a和補(bǔ)充圖6)，平行于這種表達(dá)模式的時(shí)間多樣化艾恼。睪丸中的不同剪接模式顯示出在性成熟方面

與其他器官的差異急劇增加住涉，這與我們之前的觀察(圖1e，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2和補(bǔ)充圖4)和報(bào)告的基因表達(dá)水平的模式18是一致的钠绍。我們的分析還表明舆声，在發(fā)育早期主要表達(dá)的基因顯示出比后期表達(dá)的基因更低的DevAS比率，特別是在大腦和睪丸中(圖3b)。這些觀察結(jié)果表明媳握，DevAS在器官分化過程中起著重要作用碱屁。?

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)化過程中蛾找，早期的Devas事件比晚期的Devas事件保存得更完好(圖3c和補(bǔ)充圖7)娩脾。這與編碼和非編碼基因表達(dá)18、32的差異模式是一致的打毛。因此柿赊，盡管在發(fā)育早期使用的基因中DEVA的比率較低(圖3b)，但在這段時(shí)間內(nèi)幻枉，DevAS受到了更強(qiáng)的選擇性限制碰声，理由是它在早期器官發(fā)生中的重要性。

基因表達(dá)水平的變化率在發(fā)育過程中并不是恒定的熬甫。一個(gè)主要的變化期與早期發(fā)育中器官特性的建立有關(guān)胰挑，另一個(gè)主要變化期與向成熟的特定器官功能的過渡有關(guān)18，32椿肩。我們發(fā)現(xiàn)瞻颂，在所有物種的發(fā)育過程中，DevAS的PSI變化率和連續(xù)階段之間的基因表達(dá)水平高度相關(guān)(圖3d和補(bǔ)充圖8)覆旱。這種相關(guān)性意味著在發(fā)育過程中基因表達(dá)變化較大的時(shí)期(特別是所描述的兩個(gè)時(shí)期)也表現(xiàn)出較大的DevAS變化蘸朋。然而，我們發(fā)現(xiàn)扣唱，這主要是通過不同的一組基因發(fā)生的藕坯。在發(fā)育變化的兩個(gè)主要時(shí)期，只有~10%(范圍：0-55%)的有顯著變化的基因也表現(xiàn)出顯著的基因表達(dá)變化噪沙。盡管有這種有限的重疊炼彪，我們?nèi)匀慌既坏赜^察到兩種機(jī)制改變的基因比預(yù)期的要多(在105個(gè)比較中，有30個(gè)用Fisher‘s Exact test Benjamini-Hochberg調(diào)整P<0.05正歼；補(bǔ)充表2)辐马。總體而言局义，我們的分析表明喜爷，總體上，尤其是關(guān)鍵的個(gè)體發(fā)育期的發(fā)育是由控制基因表達(dá)水平和選擇性剪接的程序相互作用形成的萄唇。

外顯子在發(fā)育過程中的使用檩帐。為了研究DevAS的時(shí)間模式，我們將每個(gè)器官的外顯子分為四種主要模式(圖4a另萤，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4以及補(bǔ)充圖9和10)：在發(fā)育過程中包涵體頻率逐漸增加(稱為‘UP’)湃密，包涵體頻率逐漸降低(‘DOWN’)诅挑，先增加后減少(‘UP-DOWN’)，以及先減少再增加(‘DOWN-UP’)泛源。值得注意的是拔妥，在物種之間，大多數(shù)DevAS外顯子(59-95%)呈現(xiàn)上升或下降模式(分別為23-58%和24-58%达箍；圖4A没龙，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充圖10)。當(dāng)在整個(gè)開發(fā)過程中強(qiáng)制定期采樣時(shí)幻梯，我們獲得了類似的結(jié)果(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)兜畸∨停總體而言碘梢，UP模式傾向于在器官和物種中最普遍，這與之前對(duì)小鼠皮層16和心臟14發(fā)育的研究一致(圖4a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)伐蒂。此外煞躬，80%的病例在兩個(gè)器官出現(xiàn)上下模式時(shí)，時(shí)間變化的方向是相同的逸邦。這種一致性支持發(fā)育的AS調(diào)節(jié)在器官之間協(xié)調(diào)(與器官對(duì)的過度表達(dá)一致恩沛；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)，并涉及共同的調(diào)節(jié)因子(下圖)缕减。

這些特定的時(shí)間模式導(dǎo)致器官之間選擇性剪接的主要發(fā)育差異(圖4a和補(bǔ)充圖10)雷客；也就是說，特定器官中盒式磁帶外顯子的上下模式通常伴隨著這些外顯子在其他器官中的低且非發(fā)育動(dòng)態(tài)包含率桥狡。相反搅裙，向下和向下-向上模式通常伴隨著其余器官中這些外顯子的整體高/穩(wěn)定和非動(dòng)態(tài)包含率。這些時(shí)空模式可能與早期的選擇性剪接程序有關(guān)裹芝，這些程序在器官之間非常相似部逮，然后在發(fā)育過程中逐漸分化(圖3a)。

UP或DOWN盒式外顯子側(cè)翼內(nèi)含子的序列保守性和鄙┮祝框外

顯子的比例顯著高于UP或DOWN盒式外顯子(圖4b-d)兄朋。這些觀察表明，發(fā)育內(nèi)含物的增加比減少具有更大的功能相關(guān)性怜械，這可能更多地對(duì)應(yīng)于另一種剪接噪音颅和。我們始終在外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子序列中檢測(cè)到富集的內(nèi)含子剪接調(diào)控元件(ISRE)基序和其他六聚體序列(即潛在的內(nèi)含子剪接調(diào)控元件)數(shù)量顯著高于外顯子下方的內(nèi)含子序列(P<10?96，二項(xiàng)式檢驗(yàn)缕允；圖4e峡扩，f)，這一結(jié)果對(duì)外顯子下采樣具有很強(qiáng)的魯棒性(補(bǔ)充圖11和方法)灼芭。這進(jìn)一步支持了包裹體的漸進(jìn)性增加有额，構(gòu)成了一種比包含物減少更規(guī)范和更具功能相關(guān)性的DevAS形式。然而，這兩種類型的高度保守的實(shí)例都存在(圖2c：外顯子2是一種保守的向上情況巍佑，外顯子1和3是向下的外顯子)茴迁。在大腦和心臟中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)大的UP模式，進(jìn)一步支持了DevAS在這些器官中的重要作用萤衰。在睪丸中也發(fā)現(xiàn)了它們堕义，這可能表明性未成熟睪丸向成熟睪丸的轉(zhuǎn)變伴隨著新生生精細(xì)胞類型和/或體細(xì)胞支持細(xì)胞中外顯子的至少部分調(diào)節(jié)的PSI改變。

剪接因子(SFS)可以對(duì)外顯子的使用產(chǎn)生相反的影響脆栋，這取決于它們是結(jié)合到它們的基序上-還是在備選外顯子28的下游倦卖。為了尋找這樣的基序，我們檢查了具有向上或向下模式的DevAS事件的六聚體序列頻率椿争。對(duì)于大腦和心臟怕膛，我們偶然檢測(cè)到位于上外顯子上游和下外顯子下游的過度表達(dá)的六角體序列的數(shù)量比預(yù)期的要多得多(P<10?10，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)秦踪；補(bǔ)充圖12)褐捻。這些對(duì)比的基序定位表明，相應(yīng)的SFS在發(fā)育過程中促進(jìn)或抑制外顯子包含椅邓，這取決于六角體基序的內(nèi)含子位置及其發(fā)育活動(dòng)動(dòng)態(tài)柠逞，導(dǎo)致觀察到的向上和向下的發(fā)育包含模式。

我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)值得注意的案例景馁，即ISRE基序在器官之間存在潛在的相反極性效應(yīng)板壮。一個(gè)類似于AS調(diào)節(jié)因子的六聚體基序(ACTAAC)，顫抖同系物合住，KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合(QKI)绰精，在發(fā)育中的大腦和心臟33，34中具有關(guān)鍵功能聊疲，在大腦的上外顯子上游和下外顯子下游富含茬底，而在心臟中，它顯示出相反的模式(圖4G和補(bǔ)充圖13)获洲。當(dāng)結(jié)合在盒外顯子35的上游時(shí)阱表，QKI起到抑制子的作用，當(dāng)結(jié)合到盒外顯子35的下游時(shí)贡珊，QKI起到激活劑的作用最爬。我們的觀察表明，QKI靶向外顯子的發(fā)育動(dòng)力學(xué)不僅取決于QKI結(jié)合基序的定位门岔，還取決于其跨調(diào)控環(huán)境的器官特異性發(fā)育動(dòng)力學(xué)爱致，即QKI和/或它可能與之相互作用的一個(gè)或幾個(gè)SFs的發(fā)育表達(dá)/活動(dòng)模式(圖4g，右圖)寒随。

我們的結(jié)果表明糠悯，在大腦中帮坚，QKI和/或潛在的協(xié)同調(diào)節(jié)因子的活性隨著時(shí)間的推移而降低，導(dǎo)致具有上游QKI基序的外顯子的包含子頻率增加(向上模式)互艾，這是因?yàn)镼KI/協(xié)同調(diào)節(jié)因子對(duì)包涵體的抑制作用逐漸減弱试和。帶有下游QKI基序的外顯子表現(xiàn)出相反的行為。相反纫普，在心臟阅悍，QKI/協(xié)同調(diào)節(jié)活性可能隨著時(shí)間的推移而增加，導(dǎo)致上游QKI基序的外顯子的包含率降低(向下模式)昨稼，因?yàn)镼KI/協(xié)同調(diào)節(jié)因子對(duì)包含性的抑制逐漸增強(qiáng)节视。帶有下游QKI基序的外顯子顯示出相反的模式。

微外顯子假栓。微外顯子是一類特殊的非常短(3-27nt)且主要是框架保存盒外顯子36寻行、37。我們發(fā)現(xiàn)但指，與其他器官相比寡痰，大腦中DEAS的微外顯子過多，從而擴(kuò)大了對(duì)成人大腦37的觀察(圖5a棋凳，b和補(bǔ)充圖14)。這種過剩明顯大于較長(zhǎng)的盒式磁帶外顯子(稱為“大外顯子”)(圖5B和補(bǔ)充圖14)连躏。然而剩岳，當(dāng)將分析限制在數(shù)量多得多的大外顯子(補(bǔ)充圖15)時(shí)，大腦中DevAS的總體過剩及其特定模式(圖1c和2a)仍然非常相似入热。雖然不那么明顯拍棕，但涉及微外顯子的DEAS事件過量也發(fā)生在大多數(shù)其他器官中(圖5b和補(bǔ)充圖14)。微外顯子中DEAS的富集是由微外顯子驅(qū)動(dòng)的勺良，在發(fā)育過程中PSI逐漸增加(向上模式)(圖5C和補(bǔ)充圖14)绰播。然而，對(duì)于大腦中的大多數(shù)UP微外顯子尚困，PSI的大部分增加發(fā)生在出生前(圖5d)蠢箩。UP大外顯子在大腦中顯示的產(chǎn)前變化比例明顯小于UP微外顯子(圖5d；所有物種的P<10?4事甜，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn))谬泌。總體而言逻谦，我們的觀察顯示掌实，微外顯子的包含率在發(fā)育過程中增加，這表明微外顯子在早期大腦發(fā)育中起著突出的作用邦马。后一種觀點(diǎn)與微外顯子是神經(jīng)元特異性的贱鼻，主要參與神經(jīng)發(fā)生37宴卖，38，以及與自閉癥相關(guān)的微外顯子調(diào)控失調(diào)是一致的邻悬，自閉癥37是一種與大腦發(fā)育早期主要表達(dá)的基因相關(guān)的紊亂嘱腥。

以往的研究表明，微外顯子比大外顯子37拘悦、38更保守齿兔，功能更相關(guān)。聚焦于Devas外顯子础米，我們發(fā)現(xiàn)確實(shí)分苇，微外顯子在其內(nèi)含

子側(cè)翼顯示出比大外顯子更高的序列保守性(圖5e)。此外屁桑，與Devas大外顯子相比医寿，含有Devas的微外顯子的比例更大(~90%)，從而保持了閱讀框架(圖5f)蘑斧。腦靖秩、心臟和肝/腎中具有高度保守的DevAS模式的微外顯子的例子分別存在于基因GDPD5、TMED2和PAPSS2中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5-7)竖瘾」低唬總之，我們的發(fā)現(xiàn)表明捕传，微外顯子構(gòu)成了一類高度選擇性地保存的可供選擇的外顯子惠拭，在早期發(fā)育，特別是大腦的發(fā)育中起著重要作用庸论。

新的外顯子誕生和外顯子交替职辅。在成人組織中，新的外顯子通常在進(jìn)化過程中以選擇性剪接盒外顯子5聂示，41域携，42的形式出現(xiàn)。因此鱼喉，我們?cè)谄鞴侔l(fā)育的背景下評(píng)估了新的(內(nèi)部)盒式磁帶外顯子的起源和進(jìn)化(圖6a秀鞭，補(bǔ)充數(shù)據(jù)10和方法)。我們發(fā)現(xiàn)蒲凶，新的替代外顯子(即在真核生物進(jìn)化過程中出現(xiàn)的外顯子)在發(fā)育后期比早期使用得更頻繁(圖6b)气筋。這種發(fā)展模式也可以在其他分子創(chuàng)新中觀察到，這可能是由于在促進(jìn)分子創(chuàng)新的發(fā)展過程中旋圆，功能約束逐漸減少所致宠默。我們發(fā)現(xiàn)，就像在成人睪丸43中觀察到的那樣灵巧，非常年輕的盒式磁帶外顯子(即物種特有的)主要合并到睪丸異構(gòu)體中搀矫，而年齡較大的新外顯子(即出現(xiàn)在真獸類的祖先中)主要用于大腦(圖6c)抹沪。值得注意的是，年齡越大的新外顯子也顯示出更高比例的DEAS瓤球、平均PSI融欧、幀保存和編碼潛力(圖6d-g)∝韵郏總體而言噪馏，我們的發(fā)現(xiàn)與對(duì)全新基因的出現(xiàn)和“睪丸外”情況的觀察結(jié)果相一致42，44绿饵。我們認(rèn)為欠肾，新的哺乳動(dòng)物外顯子的初始轉(zhuǎn)錄/剪接是由性成熟睪丸23、24中生殖細(xì)胞的允許轉(zhuǎn)錄環(huán)境促進(jìn)的拟赊。雖然這些新的外顯子中有許多仍然沒有功能刺桃，并最終消失了，但有一個(gè)子集在睪丸中進(jìn)化了功能角色吸祟。在更長(zhǎng)的進(jìn)化期內(nèi)瑟慈，這些新外顯子中的進(jìn)一步突變被固定，導(dǎo)致它們包含在其他器官中屋匕，并在其他器官中發(fā)揮功能葛碧，特別是大腦。

我們發(fā)現(xiàn)炒瘟，40-50%的物種特異性新外顯子與轉(zhuǎn)座元件(TES)重疊吹埠，特別是短穿插核元件和長(zhǎng)穿插核元件，這與以前的工作43疮装，45是一致的。我們還發(fā)現(xiàn)粘都，隨著外顯子進(jìn)化年齡的增加廓推，新外顯子與TES強(qiáng)烈重疊的百分比逐漸下降(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8)。我們的觀察表明翩隧，與來自獨(dú)特序列的外顯子相反樊展，TE衍生的外顯子大多沒有被選擇性地保留很長(zhǎng)的進(jìn)化期。然而堆生，也有可能TE衍生的外顯子的序列特征在更長(zhǎng)的進(jìn)化過程中發(fā)生了無法辨認(rèn)的變化专缠。基因APP中有一個(gè)新出現(xiàn)的替代外顯子的例子淑仆，它起源于真獸類的共同祖先(圖6a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)涝婉。這個(gè)外顯子的無義突變，主要包括在早期大腦發(fā)育中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9)蔗怠，導(dǎo)致人類大腦發(fā)育的嚴(yán)重?fù)p害46墩弯。我們還研究了新的可供選擇的外顯子的另一個(gè)進(jìn)化來源：構(gòu)成外顯子吩跋。

在我們稱之為“交替作用”(圖6a和補(bǔ)充數(shù)據(jù)11)的過程中，組成性外顯子在固定影響剪接的突變后進(jìn)化為盒外顯子47渔工。交替的外顯子顯示出與新外顯子的幾個(gè)相似之處：從睪丸偏向于腦的包涵體(圖6h)锌钮，以及隨著進(jìn)化年齡的增加(與成人組織中的工作一致)，DEAS(圖6d)和框架保存外顯子(圖6f)的比例增加引矩。然而梁丘，與交替外顯子起源于功能構(gòu)成外顯子的事實(shí)一致，并且與新的外顯子相反旺韭，幾乎所有的外顯子都有編碼能力(圖6g)氛谜，并且隨著進(jìn)化年齡的增加，平均PSI下降(圖6e)茂翔。這些觀察表明混蔼，較早的交替事件的更多實(shí)質(zhì)性和發(fā)育動(dòng)態(tài)的跳過可能具有功能相關(guān)性，而不頻繁地排除年輕的(通常是擾亂幀的)外顯子可能主要反映了轉(zhuǎn)錄噪聲珊燎。選擇性剪接舉個(gè)例子惭嚣，AMPD2基因中的一個(gè)外顯子只在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中有選擇性(圖6a和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)。這個(gè)外顯子的缺失悔政，在發(fā)育過程中逐漸排除晚吞，特別是在大腦中(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10)，與神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病48有關(guān)谋国。

討論

我們對(duì)7個(gè)物種的發(fā)育選擇性剪接圖譜的比較分析表明槽地，在進(jìn)化過程中，DevAS比更頻繁的非動(dòng)態(tài)選擇性剪接保存得更完整芦瘾。DEVAS還顯示了多個(gè)功能捌蚊，這些功能表明它總體上高度豐富了功能性的選擇性剪接事件，正如之前所建議的16近弟。然而缅糟，不同器官、不同發(fā)育時(shí)期祷愉、不同外顯子使用模式窗宦、不同外顯子年齡和不同類型的盒外顯子，DevAS的程度和選擇模式不同二鳄。我們的工作為脊椎動(dòng)物器官和物種間選擇性剪接的發(fā)育模式提供了一個(gè)全球視角赴涵。然而，它有一個(gè)重要限制订讼，即塊狀組織RNA-SEQ數(shù)據(jù)通常不允許評(píng)估細(xì)胞成分變化的相對(duì)貢獻(xiàn)髓窜。