RT-qPCR 基本原理

內(nèi)容目錄：

RT-qPCR簡介

起始材料：RNA
RT-qPCR的一步法與兩步法

RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄過程

總RNA與mRNA的選擇
逆轉(zhuǎn)錄引物
逆轉(zhuǎn)錄酶
逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性

RT-qPCR 的 qPCR 過程

引物設(shè)計
RT-qPCR 對照

RT-qPCR簡介

起始材料：RNA

定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法因苹。在該方法中底扳，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）均抽。隨后膨桥，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)目锭。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析瘸恼、RNA干擾驗(yàn)證奥吩、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測构拳、基因測試和疾病研究纵散。

RT-qPCR的一步法與兩步法

RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成（圖1、表1）隐圾。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起伍掀，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物暇藏。在兩步法RT-qPCR中蜜笤，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程是在兩個管中完成，使用不同的優(yōu)化的緩沖液盐碱、反應(yīng)條件把兔、以及引物設(shè)計策略。

圖 1瓮顽、一步法與兩步法RT-qPCR

表 1县好、一步法及兩步法RT-qPCR優(yōu)缺點(diǎn)比較

RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄過程

總RNA與mRNA的選擇

在設(shè)計RT-qPCR實(shí)驗(yàn)過程中，決定是否要使用總RNA或純化的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄十分重要暖混。盡管mRNA可能能夠提供略高的靈敏度缕贡，但總RNA仍經(jīng)常使用。其原因是總RNA作為起始材料具有較mRNA更重要的優(yōu)勢。首先晾咪，其過程需要較少的純化步驟收擦，這確保了更好的定量回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù)。其次谍倦，其避免了mRNA富集步驟塞赂，這能夠避免由于不同mRNA的回收率不同而帶來的結(jié)果偏移的可能性≈缰總的來說宴猾，由于在大多數(shù)的應(yīng)用中，目標(biāo)基因的相對定量比檢測的絕對靈敏度更為重要叼旋，因此在大多數(shù)情況下鳍置，總RNA更適用1。

逆轉(zhuǎn)錄引物

在兩步法中送淆，有三種不同的方法可用于引發(fā)cDNA反應(yīng)：oligo(dT) 引物、隨機(jī)引物怕轿、或序列特異性引物（圖2偷崩，表2）。通常情況下撞羽，是將 oligo(dT) 引物和隨機(jī)引物進(jìn)行混合使用阐斜。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個用于合成的起點(diǎn)位置诀紊。

圖2谒出、兩步法RT-qPCR中四種逆轉(zhuǎn)錄引發(fā)方法。

表2邻奠、RT-qPCR 的cDNA合成中的引物注意事項(xiàng)笤喳。結(jié)合使用隨機(jī)引物與錨定 oligo(dT) 引物可提高逆轉(zhuǎn)錄效率及 qPCR 的靈敏度。

逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶碌宴。一部分逆轉(zhuǎn)錄酶具有 RNA 酶活性杀狡，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈。如果其不具有 Rnase 酶活性贰镣，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率呜象。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）。對于 RT-qPCR 來說碑隆，理想的情況下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶恭陡，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進(jìn)行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的 RNA上煤，同時保持其在整個反應(yīng)過程中的全部活性休玩，從而得到更高的 cDNA 產(chǎn)量。

逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性

RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成哥捕。然而牧抽，當(dāng)使用長 mRNA 作為模板，RNA 可能被過早的降解遥赚，從而導(dǎo)致截短的 cDNA扬舒。因此，在 cDNA 克隆過程中凫佛，如果需要合成長的轉(zhuǎn)錄物時讲坎，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的。與此相反愧薛，擁有 RNase H 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶通常有利于 qPCR 的應(yīng)用晨炕，因?yàn)樗鼈兡軌蛟?PCR 的第一個循環(huán)中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解（圖3）。

圖3毫炉、逆轉(zhuǎn)錄酶中 RNase H 活性瓮栗。在 qPCR 中，使用具有 RNA 酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶瞄勾。

RT-qPCR 的 qPCR 過程

圖4费奸、qPCR過程

引物設(shè)計

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步驟的 PCR 引物最好應(yīng)設(shè)計成跨越一個外顯子-外顯子連接，其中一條擴(kuò)增引物可以潛在地跨越實(shí)際外顯子-內(nèi)含子邊界（圖4）进陡。由于含內(nèi)含子的基因組 DNA 序列不會被擴(kuò)增愿阐，因此這種設(shè)計可以減少從污染的基因組DNA中擴(kuò)增得到的假陽性的風(fēng)險。

如果引物不能被設(shè)計成能夠分離外顯子或外顯子-外顯子邊界趾疚，則有必要利用無 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶處理 RNA 樣品以除去基因組 DNA 污染缨历。

圖4、RT-qPCR 中 qPCR 步驟的引物設(shè)計糙麦。1）如果一個引物被設(shè)計為跨越外顯子-內(nèi)含子邊界辛孵，則可能造成污染的基因組 DNA 將不會被擴(kuò)增，其原因是引物不能退火至該基因組 DNA 模板赡磅。相反觉吭，cDNA 不含任何內(nèi)含子，能夠有效被引物識別并擴(kuò)增仆邓。2）當(dāng)引物側(cè)接一個長的內(nèi)含子（例如1 kb）鲜滩，擴(kuò)增反應(yīng)將不會發(fā)生，因?yàn)槎痰难由鞎r間僅夠用于擴(kuò)增短的 cDNA节值，卻不足以擴(kuò)增基因組靶基因徙硅。

RT-qPCR 對照

一個逆轉(zhuǎn)錄陰性對照（-RT對照）應(yīng)該包括在所有的 RT-qPCR 的實(shí)驗(yàn)中，以檢測 DNA 污染（如基因組 DNA 或來自之前反應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物）搞疗。這一對照包含除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有反應(yīng)組分嗓蘑。由于該對照不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄须肆，因此如果觀察到 PCR 擴(kuò)增，則極有可能來自 DNA 的污染桩皿。

參考文獻(xiàn)

Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/basic-principles-rt-qpcr.html