Basic Information

• 英文標題： Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer
• 中文標題：人類結(jié)腸和直腸癌的綜合分子特征
• 發(fā)表日期：18 July 2012
• 文章類型：Article
• 所屬期刊：Nature
• 文章作者：The Cancer Genome Atlas Network
• 文章鏈接：https://www.nature.com/articles/nature11252

Abstract

1. 為了表征結(jié)直腸癌中的體細胞變異翎嫡，我們對276個樣本進行了全基因組規(guī)模的分析，包括外顯子序列如暖、DNA拷貝數(shù)废离、啟動子甲基化以及信使RNA和微RNA的表達廊勃。
2. 其中一部分樣本（97個）還進行了低覆蓋度的全基因組測序滑进。
3. 總體而言钢颂，16%的結(jié)直腸癌被發(fā)現(xiàn)具有高度突變：其中四分之三的樣本表現(xiàn)出預(yù)期的高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性钞它，通常伴有高甲基化和MLH1沉默，而剩余四分之一的樣本則存在體細胞錯配修復(fù)基因和聚合酶ε（POLE）突變殊鞭。
4. 排除高度突變的癌癥后遭垛，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和直腸癌具有相當(dāng)相似的基因組變異模式。
5. 共有24個基因顯著突變操灿，除了預(yù)期中的APC锯仪、TP53、SMAD4趾盐、PIK3CA和KRAS突變之外庶喜，我們還發(fā)現(xiàn)了ARID1A小腊、SOX9和FAM123B的頻繁突變。
6. 重復(fù)發(fā)生的拷貝數(shù)變異包括潛在可作為藥物靶點的ERBB2擴增和新發(fā)現(xiàn)的IGF2擴增久窟。
7. 重復(fù)發(fā)生的染色體易位包括NAV2與WNT信號通路成員TCF7L1的融合秩冈。
8. 綜合分析提示了侵襲性結(jié)直腸癌的新標志物，并表明MYC指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活和抑制具有重要作用斥扛。

Main

1. 癌癥基因組圖譜項目計劃對20種不同類型的癌癥進行基因組變化分析入问，并且迄今已發(fā)布了兩種癌癥的研究成果。
2. 現(xiàn)在我們展示對人類結(jié)直腸癌（CRC）進行多維度分析的結(jié)果稀颁。
3. CRC 是癌癥死亡率和發(fā)病率的重要因素芬失。
4. 結(jié)腸與直腸的區(qū)別主要基于解剖學(xué)，但它對治療管理和放射治療均有影響峻村，并可能影響預(yù)后麸折。
5. 大多數(shù)研究者從生物學(xué)角度將CRC分為微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI；主要位于右半結(jié)腸粘昨，常與CpG島甲基化表型（CIMP）和高突變率相關(guān)）和微衛(wèi)星穩(wěn)定但染色體不穩(wěn)定的兩種類型垢啼。
6. 一系列豐富的研究（有關(guān)綜述可參見參考文獻3）揭示了幾個在結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)生和發(fā)展中至關(guān)重要的基因和途徑。
7. 這些包括WNT张肾、RAS-MAPK芭析、PI3K、TGF-β吞瞪、P53和DNA錯配修復(fù)途徑馁启。
8. 大規(guī)模測序分析已經(jīng)鑒定出許多反復(fù)突變的基因和一種反復(fù)發(fā)生的染色體易位。
9. 盡管有了這些背景知識芍秆，我們尚未獲得關(guān)于遺傳和基因組變化及其對結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的意義的全面綜合理解惯疙。
10. 對這些變化的進一步了解可能會使我們更深入地理解CRC的病理生理學(xué)，并可能確定潛在的治療靶點妖啥。

Results

1. 腫瘤和正常樣本對通過不同平臺進行分析霉颠。具體通過每個平臺分析的樣本數(shù)量見補充表1。
2. 補充表1展示了通過各個平臺分析的具體樣本數(shù)量荆虱。

Exome-sequence analysis

外顯子序列分析

1. 為了定義突變譜蒿偎，我們對224對腫瘤和正常樣本進行了外顯子捕獲DNA測序（所有突變均列于補充表2中）。
2. 測序?qū)崿F(xiàn)了針對至少80%的目標外顯子超過20倍的覆蓋度怀读。
3. 體細胞突變率在樣本間變化很大诉位。
4. 一些樣本的突變率低于每106個堿基1個，而少數(shù)樣本的突變率高于每106個堿基100個菜枷。
5. 我們將突變率低于每106個堿基8.24個的病例（占84%）與突變率高于每106個堿基12個的病例分開苍糠，后者的平均總突變數(shù)為728，我們將其指定為高突變型（圖1）啤誊。

Figure 1: Mutation frequencies in human CRC.

• 224名患者的每個腫瘤樣本中的突變頻率椿息。注意高度突變和非高度突變樣本的明顯分離歹袁。紅色表示MSI高、CIMP高或MLH1沉默寝优；淺藍色表示MSI低或CIMP低条舔；黑色表示直腸；白色表示結(jié)腸；灰色表示無數(shù)據(jù)。插圖顯示了高度突變樣本中的錯配修復(fù)基因和POLE的突變疫诽。樣本的順序與主圖相同。
• 高度突變和非高度突變腫瘤中顯著突變的基因凄硼。藍色條形代表通過MutSig算法識別出的基因，黑色條形代表通過手動檢查序列數(shù)據(jù)識別出的基因捷沸。

1. 為了評估顯著不同的突變率的基礎(chǔ)摊沉，我們評估了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI7）以及DNA錯配修復(fù)途徑基因MLH1、MLH3痒给、MSH2说墨、MSH3、MSH6和PMS2中的突變8,9,10苍柏。
2. 在擁有完整數(shù)據(jù)集的30個高突變腫瘤中尼斧，23個（77%）具有高水平的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）。
3. 其中包括19個具有MLH1甲基化的腫瘤试吁，其中17個具有CIMP棺棵。
4. 相比之下，其余七個高突變腫瘤熄捍，包括六個突變率最高的腫瘤烛恤，缺乏MSI-H、CIMP或MLH1甲基化余耽，但通常有一個或多個錯配修復(fù)基因的體細胞突變或POLΕ異常缚柏，而在非高突變腫瘤中這些異常很少見（圖1）。

Gene mutations

基因突變

1. 總體而言宾添，我們在高突變和非高突變癌癥中鑒定了32個體細胞反復(fù)突變基因（由MutSig11和人工策展定義）（圖1b）。
2. 去除未表達基因后柜裸，高突變和非高突變癌癥中分別剩下15和17個基因（圖1b缕陕；完整列表見補充表3）。
3. 在非高突變腫瘤中疙挺，突變頻率最高的八個基因是APC扛邑、TP53、KRAS铐然、PIK3CA蔬崩、FBXW7恶座、SMAD4、TCF7L2和NRAS沥阳。
4. 正如預(yù)期跨琳，突變的KRAS和NRAS基因通常具有致癌的第12和13密碼子或第61密碼子突變，而其余基因則具有失活突變桐罕。
5. CTNNB1脉让、SMAD2、FAM123B（也稱為WTX）和SOX9也被頻繁突變功炮。
6. FAM123B是一個X連鎖的WNT信號通路負調(diào)控因子溅潜，幾乎所有的突變都是功能喪失型。
7. SOX9是腸干細胞龕中細胞分化重要基因薪伏，其突變此前尚未與人類癌癥相關(guān)聯(lián)滚澜，但在非高突變CRC中的九個突變等位基因均為移碼或無義突變。
8. 抑癌基因ATM和ARID1A也有不成比例的高數(shù)量的移碼或無義突變嫁怀。
9. 最近有關(guān)ARID1A的突變已在CRC和其他多種癌癥中被報道设捐。
10. 在高突變腫瘤中，ACVR2A眶掌、APC挡育、TGFBR2、MSH3朴爬、MSH6即寒、SLC9A9和TCF7L2是突變的常見靶點（圖1b），大部分突變?yōu)锽RAF(V600E)召噩。
11. 然而母赵，在非高突變癌癥中頻繁突變的兩個基因，在高突變腫瘤中的突變頻率顯著降低：TP53（60%對比20%具滴，P < 0.0001）和APC（81%對比51%凹嘲，P = 0.0023；兩者均采用費舍精確檢驗）构韵。
12. 其他基因周蹭，包括TGFBR2，在高突變癌癥中反復(fù)發(fā)生突變疲恢，但在非高突變樣本中則沒有凶朗。
13. 這些發(fā)現(xiàn)表明，高突變與非高突變腫瘤通過不同的遺傳事件序列進展显拳。
14. 正如預(yù)期棚愤，具有 MLH1 基因沉默和高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）的高突變腫瘤在突變特征上顯示出額外的差異。
15. 當(dāng)我們特別檢查了含有長單核苷酸重復(fù)序列的 28 個基因時，我們發(fā)現(xiàn)框移突變率比沒有 MLH1 基因沉默的高突變腫瘤高出 3.6 倍宛畦，比非高甲基化腫瘤高出 50 倍瘸洛。（補充表 2）。

Mutation rate and methylation patterns

突變率和甲基化模式

1. 如上所述次和，結(jié)腸和直腸腫瘤患者的管理方式不同反肋，流行病學(xué)也突顯了這兩者之間的差異。
2. 對132例結(jié)腸和62例直腸腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)狀態(tài)斯够、體細胞拷貝數(shù)變異(SCNAs)囚玫、CIMP狀態(tài)及基因表達譜進行初步綜合分析，使我們能夠探究這兩個部位腫瘤可能存在的生物學(xué)差異读规。
3. 然而抓督，在非高度突變的腫瘤中，結(jié)腸癌和直腸癌之間在拷貝數(shù)變化束亏、CIMP铃在、mRNA和miRNA的整體模式上并無顯著區(qū)別（圖2）。
4. 基于這一結(jié)果碍遍，我們將兩者合并進行了后續(xù)所有分析定铜。

Figure 2: Integrative analysis of genomic changes in 195 CRCs.

• 高突變腫瘤具有近二倍體基因組，并且高度富集了高甲基化怕敬、CIMP表達表型以及BRAF(V600E)突變揣炕。
• 非高突變腫瘤來源于不同部位，根據(jù)它們的拷貝數(shù)改變模式东跪、DNA甲基化或基因表達模式畸陡，它們彼此之間幾乎無法區(qū)分。
• 22條常染色體的拷貝數(shù)變化以紅色色調(diào)表示拷貝數(shù)增加虽填，藍色色調(diào)表示拷貝數(shù)減少丁恭。
• PowerPoint幻燈片

1. 對236個結(jié)直腸腫瘤的啟動子DNA甲基化譜進行無監(jiān)督聚類分析，確定了四個亞組（補充圖1及補充方法）斋日。
2. 其中兩個聚類包含甲基化率升高的腫瘤牲览，根據(jù)之前的描述被分類為CIMP高和CIMP低。
3. 兩個非CIMP聚類主要來自非高度突變且來源于不同解剖位置的腫瘤恶守。
4. mRNA表達譜將結(jié)直腸腫瘤分為三個不同的聚類（補充圖2）第献。
5. 其中一個聚類與CIMP-高腫瘤顯著重疊（P = 3 × 10^-12），并且富含高度突變的腫瘤兔港，而另外兩個聚類在甲基化數(shù)據(jù)中沒有對應(yīng)任何一組庸毫。
6. 通過無監(jiān)督聚類分析miRNA表達（補充圖3）未能明確區(qū)分直腸癌與非高度甲基化的結(jié)腸癌

Chromosomal and sub-chromosomal changes

染色體和亞染色體變化

1. 總共使用阿法梅特里克斯 SNP 6.0 芯片對 257 個腫瘤進行了 SCNA 分析。
2. 其中 97 個腫瘤還通過低深度覆蓋（低通）全基因組測序進行了分析押框。
3. 正如預(yù)期的那樣岔绸，高度突變的腫瘤具有少得多的 SCNA（圖 2）理逊。
4. 微衛(wèi)星穩(wěn)定和不穩(wěn)定的高度突變腫瘤之間沒有發(fā)現(xiàn)差異（補充圖 4）橡伞。
5. 我們使用 GISTIC 算法來識別焦點改變的可能基因靶點盒揉。
6. 有幾個之前已經(jīng)明確界定的染色體臂變化，包括 1q兑徘、7p 和 q刚盈、8p 和 q、12q挂脑、13q藕漱、19q 以及 20p 和 q 的增益。
7. 顯著缺失的染色體臂包括含有 SMAD4 的 18p 和 q崭闲，在 66% 的腫瘤中發(fā)生肋联。
8. 另外顯著缺失的染色體臂還包括含有 TP53 的 17p 和 q，在 56% 的腫瘤中發(fā)生刁俭。
9. 其他顯著缺失的染色體臂還包括 1p橄仍、4q、5q牍戚、8p侮繁、14q、15q如孝、20p 和 22q宪哩。
10. 我們確定了28個復(fù)發(fā)性缺失峰（補充圖4和補充表4），包括位于潛在基因組脆弱位點的大基因足跡基因FHIT第晰、RBFOX1和WWOX锁孟，存在于近二倍體高突變腫瘤中。
11. 其他焦點缺失涉及腫瘤抑制基因但荤，如SMAD4罗岖、APC、PTEN和SMAD3腹躁。
12. 10p25.2的一個顯著焦點缺失跨越了四個基因桑包，其中包括TCF7L2，該基因在我們的數(shù)據(jù)集中也頻繁發(fā)生突變纺非。
13. 通過一個內(nèi)部缺失哑了，在3%的CRC中發(fā)現(xiàn)了相鄰基因VTI1A和TCF7L2之間的基因融合，并且這種易位對于攜帶該易位的CRC細胞的存活是必需的4烧颖。
14. 存在17個顯著的焦點擴增區(qū)域（補充表4）弱左。
15. 其中一些位于染色體臂的廣泛獲得之上，包括位于13q12.13附近的絲氨酸蛋白酶編碼基因USP12附近的峰值以及距離結(jié)直腸癌候選致癌基因CDK8約500 kb的另一個峰值炕淮；
16. 相鄰的13q12上的一個峰值拆火；
17. 包含KLF5的13q22.1上的一個峰值；
18. 以及位于HNF4A附近的20q13.12上的一個峰值。
19. 8號染色體上的峰值包括含有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因WHSC1L1的8p12（該基因鄰近FGFR1）以及含有MYC的8q24们镜。
20. 在4%的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的一個17q21.1擴增子包含七個基因币叹，其中包括酪氨酸激酶ERBB2。
21. ERBB2擴增已在結(jié)腸模狭、乳腺和食管-胃腫瘤中被描述颈抚。
22. 具有這些擴增的乳腺癌和胃癌已通過抗ERBB2抗體曲妥珠單抗得到有效治療。
23. 最常見的焦點擴增之一發(fā)生在約7%的腫瘤中嚼鹉，即染色體臂11p15.5上一個100-150kb區(qū)域的增益贩汉。這一區(qū)域包含編碼胰島素（INS）、類胰島素生長因子2（IGF2）和酪氨酸羥化酶（TH）的基因锚赤，以及嵌入IGF2中的miR-483（圖3a）匹舞。我們發(fā)現(xiàn)IGF2和miR-483的表達升高，而INS和TH則沒有（圖3b线脚、c）策菜。
24. 與擴增區(qū)域緊鄰的是ASCL2，這是一種在確定腸干細胞命運中活躍的轉(zhuǎn)錄因子酒贬。盡管先前的研究認為ASCL2可能是結(jié)直腸癌中擴增的目標又憨，但它始終位于擴增區(qū)域之外，并且其表達與拷貝數(shù)變化無關(guān)锭吨。
25. 這些觀察結(jié)果表明蠢莺，IGF2和miR-483是11p15.5擴增可能的功能性靶點。通過印記丟失導(dǎo)致的IGF2過度表達已被認為與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)零如。miR-483也可能在結(jié)直腸癌發(fā)病機制中發(fā)揮作用躏将。

Figure 3: Copy-number changes and structural aberrations in CRC.

• 11p15.5 焦點放大。顯示了來自單核苷酸多態(tài)性（SNP）陣列和低通全基因組測序（WGS）的分段DNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)考蕾。每一行代表一個患者祸憋；放大區(qū)域用紅色表示。
• IGF2 和 miR-483 的表達水平與拷貝數(shù)變化的相關(guān)性肖卧。
• IGF2 放大和過度表達與 PI3K 信號相關(guān)基因的改變是互斥的蚯窥。
• NAV2–TCF7L2 融合的反復(fù)出現(xiàn)。顯示了這兩個基因的結(jié)構(gòu)塞帐、導(dǎo)致轉(zhuǎn)位的斷裂點位置以及帶有融合的所有腫瘤的環(huán)狀重排表示拦赠。紅色線條代表 NAV2–TCF7L2 融合，黑色線條代表其他重排葵姥。內(nèi)環(huán)代表拷貝數(shù)變化（藍色表示丟失荷鼠，粉色表示增益）。

1. 一組沒有 IGF2 擴增的腫瘤（15%）也表現(xiàn)出顯著較高的 IGF2 基因表達水平（高達100倍的增加）榔幸，這一效應(yīng)不能歸因于 IGF2 啟動子處的甲基化變化允乐。
2. 為了評估 IGF2 擴增/過表達的背景矮嫉，我們使用 MEMo 方法系統(tǒng)地尋找相互排斥的基因組事件。
3. 我們發(fā)現(xiàn) IGF2 過表達與已知激活 PI3K 通路的基因組事件幾乎完全排他（校正后的 P 值小于 0.01）牍疏，這些事件包括 PIK3CA 和 PIK3R1 的突變或 PTEN 的缺失/突變（圖 3c 和補充表 5）敞临。
4. 編碼連接 IGF1R（IGF2 受體）與 PI3K 的蛋白質(zhì)的 IRS2 基因位于第 13 號染色體上，該染色體在結(jié)直腸癌中經(jīng)常獲得麸澜。
5. IGF2 過表達病例與 IRS2 表達最高的病例是相互排斥的（P = 0.04），并且這些病例也沒有 PI3K 通路中的突變（P = 0.0001奏黑；圖 3c）炊邦。
6. 這些結(jié)果強烈表明，在結(jié)直腸癌中熟史，IGF2-IGF1R-IRS2 軸向 PI3K 發(fā)送信號馁害，并暗示針對該通路的治療可能在這一患者亞群中阻止 PI3K 活性。

Translocations

移位

1. 為了識別新的染色體易位蹂匹，我們對97個帶有匹配正常樣本的腫瘤進行了低通碘菜、配對末端、全基因組測序限寞。
2. 每例樣本我們都達到了大約3到4倍的序列覆蓋度忍啸，相應(yīng)的物理覆蓋度為7.5到10倍。
3. 盡管基因組覆蓋率較低履植，但我們檢測到了250個候選的染色體間易位事件（范圍计雌，每個腫瘤0-10個）。
4. 其中玫霎，212個事件的一個或兩個斷裂點位于基因間區(qū)域凿滤，而剩下的38個事件將兩個基因的編碼區(qū)置于假定的融合事件中，其中18個被預(yù)測為框內(nèi)事件（補充表6）庶近。
5. 我們發(fā)現(xiàn)了三個獨立案例翁脆，在這些案例中，11號染色體上的NAV2基因的前兩個外顯子與2號染色體上的TCF7L1的3′編碼部分相連（補充圖5）鼻种。
6. TCF7L1編碼TCF3反番，TCF3是與核β-連環(huán)蛋白異二聚化的TCF/LEF類轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，能夠使β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為可能叉钥。
7. 有趣的是恬口，在所有這三個案例中，預(yù)測的NAV2-TCF7L1融合蛋白結(jié)構(gòu)缺少TCF3的β-連環(huán)蛋白結(jié)合域沼侣。
8. 這種易位類似于在結(jié)直腸癌中識別出的另一種復(fù)發(fā)性易位祖能，即VTI1A的氨基端與TCF4融合，TCF4由TCF7L2編碼蛾洛，TCF7L2是TCF7L1的同源物养铸，在12%的非高突變腫瘤中被刪除或突變4雁芙。
9. 我們還觀察到了涉及位于22號染色體上的TTC28的21個易位案例（補充表6）。
10. 所有這些融合事件均預(yù)測會導(dǎo)致TTC28失活钞螟，TTC28已被鑒定為P53的目標和腫瘤細胞生長的抑制劑30兔甘。
11. 通過獲得PCR產(chǎn)物或在某些情況下測序連接片段，驗證了19個基因-基因易位中的11個（58%）（補充圖5）鳞滨。

Altered pathways in CRC

CRC中的改變途徑

1. 對195個擁有完整數(shù)據(jù)的腫瘤進行突變洞焙、拷貝數(shù)和mRNA表達變化的綜合分析，加深了我們對一些明確定義的通路如何失調(diào)的理解拯啦。
2. 我們將樣本按高突變狀態(tài)分組澡匪，并發(fā)現(xiàn)了WNT、MAPK褒链、PI3K唁情、TGF-β和p53通路中的反復(fù)改變（圖4，補充圖6和補充表1）甫匹。

Figure 4: Diversity and frequency of genetic changes leading to deregulation of signalling pathways in CRC.

• 具有完整數(shù)據(jù)的非高突變（nHM甸鸟；n = 165）和高突變（HM；n = 30）樣本被分別分析兵迅。
• 變異由體細胞突變抢韭、純合缺失、高水平焦點擴增定義恍箭，并且在某些情況下篮绰，通過基因表達的顯著上調(diào)或下調(diào)（如 IGF2、FZD10季惯、SMAD4）來定義吠各。
• 變異頻率以所有案例的百分比形式表示。
• 紅色表示激活的基因勉抓，藍色表示失活的基因贾漏。
• 底部面板顯示了每個樣本中，在本圖描述的五條通路中是否至少有一個基因發(fā)生變異藕筋。
• PowerPoint 幻燈片

1. 我們發(fā)現(xiàn)93%的腫瘤中WNT信號通路發(fā)生了改變纵散，包括APC基因的雙等位基因失活（補充表7）或CTNNB1激活突變，約占80%的病例隐圾。
2. 還發(fā)現(xiàn)了SOX9突變伍掀，以及TCF7L2中的突變和缺失，此外還有DKK家族成員暇藏、AXIN2蜜笤、FBXW7（補充圖7）、ARID1A和FAM123B（后者是WNT-β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的負調(diào)控因子盐碱，在Wilms瘤中被發(fā)現(xiàn)突變）的突變把兔。
3. 之前在結(jié)直腸癌中已經(jīng)描述了FAM123B的一些突變沪伙。
4. 有人認為SOX9在癌癥中有一定作用，但在此之前尚未報道過其突變县好。
5. WNT受體frizzled（FZD10）在約17%的樣本中過度表達围橡，有時表達水平比正常高出100倍。
6. 總體而言缕贡，我們發(fā)現(xiàn)了16種不同的WNT通路基因改變翁授，證實了該通路在結(jié)直腸癌中的重要性。
7. 有趣的是晾咪，許多這些改變出現(xiàn)在攜帶APC突變的腫瘤中收擦，這表明影響WNT信號通路的多個病變賦予了選擇優(yōu)勢。
8. PI3K和RAS-MAPK途徑中的遺傳改變在結(jié)直腸癌中很常見禀酱。
9. 除了IGF2和IRS2的過度表達外，我們在非高度突變腫瘤中分別發(fā)現(xiàn)了2%的PIK3R1和15%的PIK3CA相互排斥的突變以及4%的PTEN缺失牧嫉。
10. 我們發(fā)現(xiàn)55%的非高度突變腫瘤中存在KRAS剂跟、NRAS或BRAF的改變，并且存在顯著的相互排斥模式酣藻。
11. 我們還評估了紅細胞白血病病毒致癌基因同源物（ERBB）家族受體中的突變曹洽，因為這類突變具有重要的轉(zhuǎn)化意義。
12. 在165例非高度突變病例中有22例（13%）和30例高度突變病例中有16例（53%）存在ERBB家族四個基因之一的突變或擴增辽剧。
13. 其中一些突變被列在COSMIC數(shù)據(jù)庫中送淆，表明它們具有功能性作用。
14. 有趣的是怕轿，在四例非高度突變病例中發(fā)現(xiàn)了重復(fù)的ERBB2(V842I)突變偷崩，而在兩例非高度突變病例中發(fā)現(xiàn)了ERBB3(V104M)突變。
15. ERBB2的突變和局灶性擴增（補充圖6）應(yīng)當(dāng)作為預(yù)測針對這些受體的藥物反應(yīng)的指標進行評估撞羽。
16. 我們在三分之一的腫瘤中觀察到RAS和PI3K途徑改變的同時發(fā)生（圖4阐斜；P=0.039，費希爾精確檢驗）诀紊。
17. 這些結(jié)果表明谒出，為了達到治療效果可能需要同時抑制RAS和PI3K途徑。
18. 已知TGF-β信號傳導(dǎo)途徑在結(jié)直腸癌和其他癌癥中失調(diào)34邻奠。
19. 我們發(fā)現(xiàn)非高度突變腫瘤中有27%笤喳，高度突變腫瘤中有87%存在TGFBR1、TGFBR2碌宴、ACVR2A杀狡、ACVR1B、SMAD2贰镣、SMAD3和SMAD4的基因組改變捣卤。
20. 我們也評估了p53途徑忍抽，在非高度突變病例中有59%發(fā)現(xiàn)了TP53的改變（主要是雙等位基因改變；補充表8）董朝。
21. 在7%的病例中發(fā)現(xiàn)ATM發(fā)生改變鸠项，ATM是一種激酶，在DNA損傷后磷酸化并激活P53子姜。
22. 這兩種基因的改變顯示出趨向于相互排斥的趨勢（P = 0.016）（圖4祟绊，補充圖6和補充表1）纸泡。
23. 我們利用PARADIGM軟件平臺整合了拷貝數(shù)衷恭、基因表達洋满、甲基化和通路數(shù)據(jù)闯估。
24. 分析顯示了CRC的一些新特征（圖5a）衷敌。
25. 例如交汤，盡管這些腫瘤在解剖起源或突變水平上存在多樣性毕籽，但幾乎100%的腫瘤都有MYC轉(zhuǎn)錄靶標的改變脐供，包括那些被MYC促進和抑制的靶標凫佛。
26. 這些發(fā)現(xiàn)與從遺傳改變中推斷出的模式一致讲坎，并提示MYC在CRC中發(fā)揮重要作用。
27. 分析還確定了幾種在所有腫瘤樣本中改變的基因網(wǎng)絡(luò)愧薛，以及在高突變與非高突變樣本中差異改變的基因網(wǎng)絡(luò)（補充表7晨炕，癌癥基因組圖譜出版網(wǎng)頁上的補充數(shù)據(jù)）。

Figure 5: Integrative analyses of multiple data sets.

• a, 通過 PARADIGM 分析推導(dǎo)出的結(jié)腸和直腸腫瘤中受影響的基因和通路的聚類毫炉。藍色表示相對于正常組織低表達瓮栗，紅色表示相對于正常組織高表達。通過這種方法推導(dǎo)出的一些通路顯示在右側(cè)瞄勾。NHEJ费奸，非同源末端連接。
• b, 與腫瘤侵襲性相關(guān)的基因表達特征和結(jié)構(gòu)拷貝數(shù)異常进陡。根據(jù)選定的臨床檢測方法（列）货邓，與腫瘤侵襲性具有統(tǒng)計學(xué)顯著關(guān)聯(lián)的分子特征（行）以顏色顯示，其中紅色表示腫瘤侵襲性的標志物四濒，藍色表示侵襲性較小的腫瘤的標志物换况。
• 顯著性基于加權(quán)費舍爾方法得出的綜合P值，并對多重檢驗進行了校正盗蟆。顏色強度和得分與個體臨床-分子關(guān)聯(lián)的強度一致戈二，并與該關(guān)聯(lián)的對數(shù)P值成比例，其中P是該關(guān)聯(lián)的P值喳资。
• 為了限制圖的垂直范圍觉吭，基因表達特征被限定在綜合P值小于10^{-9，而結(jié)構(gòu)拷貝數(shù)異常則限定在P值小于10}-7仆邓，且僅顯示在非MSI-H樣本子集中同樣顯著的特征（分析分別在完整數(shù)據(jù)以及MSI-H和非MSI-H子組上進行）鲜滩。

1. 因為本研究使用的大多數(shù)腫瘤樣本來自前瞻性收集伴鳖，所以沒有生存數(shù)據(jù)。
2. 但是徙硅，可以根據(jù)手術(shù)時的腫瘤分期榜聂、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移和血管侵犯將腫瘤分類為侵襲性或非侵襲性嗓蘑。
3. 我們發(fā)現(xiàn)了與腫瘤侵襲性相關(guān)的眾多分子特征须肆，其中一部分如圖5b所示。
4. 這些特征包括特定的焦點擴增和缺失桩皿，以及基因表達水平的變化豌汇，其中包括SCN5A，據(jù)報道它是結(jié)腸癌侵襲性的調(diào)節(jié)因子（參見補充表10和11獲取完整列表）泄隔。
5. 與腫瘤侵襲性相關(guān)的還有miRNA的表達變化和某些體細胞突變（APC拒贱、TP53、PIK3CA佛嬉、BRAF和FBXW7逻澳；補充圖8b）。
6. FBXW7的突變（38例）和遠處轉(zhuǎn)移（32例）從未同時發(fā)生（P = 0.0019）巷燥。
7. 有趣的是赡盘，一些基因組區(qū)域存在多個與腫瘤侵襲性相關(guān)的分子特征号枕，表現(xiàn)為臨床相關(guān)的基因組熱點缰揪。
8. 這方面的例子是20q13.12區(qū)域，它包含一個焦點擴增和多個與腫瘤侵襲性相關(guān)的基因葱淳，以及含有APOL6的22q12.3區(qū)域（補充圖8和9）

Discussion

1. 這項對224對結(jié)直腸腫瘤和正常樣本進行的綜合性整合分析為我們提供了關(guān)于CRC生物學(xué)的多個見解钝腺，并確定了潛在的治療靶點。
2. 為了識別結(jié)腸和直腸腫瘤可能存在的生物學(xué)差異赞厕，我們在非高度突變的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了相同類型的拷貝數(shù)變化艳狐、表達譜、DNA甲基化和miRNA變化皿桑，無論它們的解剖起源如何毫目。
3. 超過94%的樣本在一個或多個WNT信號通路成員中存在突變，主要發(fā)生在APC基因中诲侮。
4. 然而镀虐，在右側(cè)結(jié)腸和其他所有部位的腫瘤之間存在一些差異。
5. 右側(cè)結(jié)腸中的高甲基化更為常見沟绪，且三分之二的高突變樣本來自同一部位刮便，盡管并非所有樣本都有MSI（圖2）。
6. 為什么大多數(shù)高突變樣本來自右側(cè)結(jié)腸以及為什么該部位存在兩種類型的腫瘤尚不清楚绽慈。
7. 結(jié)腸來源于胚胎中期和后期腸道這一事實可能提供了解釋恨旱。
8. 由于高MSI相關(guān)癌癥患者的生存率更高，且這些癌癥是高度突變的搜贤，因此突變率可能是一個更好的預(yù)后指標谆沃。
9. 全外顯子組測序及基因組數(shù)據(jù)的綜合分析為我們進一步揭示了結(jié)直腸癌中失調(diào)的信號通路。
10. 我們發(fā)現(xiàn)入客，93%的非高度突變病例和97%的高度突變病例中WNT信號通路出現(xiàn)了失調(diào)控管毙。
11. 新的發(fā)現(xiàn)包括FAM123B、ARID1A和SOX9中的反復(fù)突變以及WNT配體受體基因FZD10的極高表達水平桌硫。
12. 據(jù)我們所知夭咬，SOX9此前未曾被報道為在任何人類癌癥中頻繁突變。
13. WNT信號傳導(dǎo)抑制SOX9的轉(zhuǎn)錄铆隘，并且SOX9蛋白已被證明能夠促進β-連環(huán)蛋白的降解卓舵。
14. ARID1A在婦科癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變，并且已證實它能抑制MYC的轉(zhuǎn)錄膀钠。
15. WNT信號傳導(dǎo)的激活和TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的失活已知會導(dǎo)致MYC的激活掏湾。
16. 我們的突變分析和綜合分析強調(diào)了MYC在結(jié)直腸癌中的關(guān)鍵作用。
17. 我們還將我們的結(jié)果與其他大規(guī)模分析進行了比較肿嘲，并發(fā)現(xiàn)了許多相似之處和少數(shù)差異融击，在突變基因方面（補充表3）。
18. 我們的綜合分析揭示了TCF/LEF編碼基因多樣性的變化雳窟，這表明TCF/LEF因子在結(jié)直腸癌中的作用不僅僅是作為β-連環(huán)蛋白的被動伴侶尊浪。
19. ,
20. 我們的數(shù)據(jù)提示了針對結(jié)直腸癌的多種治療途徑。
21. 其中包括 WNT 信號通路抑制劑和小分子 β-連環(huán)蛋白抑制劑封救，這些藥物已顯示出初步的前景拇涤。
22. 我們發(fā)現(xiàn) RTK-RAS 和 PI3K 通路中的多個蛋白質(zhì)，包括 IGF2誉结、IGFR鹅士、ERBB2、ERBB3惩坑、MEK掉盅、AKT 和 MTOR 可能是抑制的目標。
23. 我們的分析表明以舒，非高突變型結(jié)直腸腺癌在基因組水平上并無區(qū)別趾痘。
24. 然而，右側(cè)/升結(jié)腸的腫瘤更有可能發(fā)生高甲基化并且突變率高于其他結(jié)直腸癌稀轨。
25. 正如之前所認識到的那樣扼脐，WNT信號通路的激活和TGF-β信號通路的失活導(dǎo)致MYC活性增加，在結(jié)直腸癌中幾乎是普遍現(xiàn)象。
26. 基因組異常經(jīng)常靶向MAPK和PI3K途徑瓦侮，但較少靶向受體酪氨酸激酶艰赞。
27. 總之，這里提供的數(shù)據(jù)為理解這種致命疾病以及識別針對該病的有效治療方法提供了有用的資源肚吏。

Methods Summary

1. 腫瘤和正常樣本由兩個生物樣本核心資源之一進行處理方妖，純化的核酸樣本分裝后被送往基因組特征分析和測序中心（補充方法）。
2. 生物樣本核心資源分多個批次提供了樣本集罚攀。
3. 為了評估任何批次效應(yīng)党觅，我們使用聚類分析、增強主成分分析和方差分析的組合檢查了信使核糖核酸表達斋泄、微小核糖核酸表達和脫氧核糖核酸甲基化數(shù)據(jù)集（補充方法）杯瞻。
4. 盡管檢測到了一些批次間的差異，但我們沒有通過計算方式對其進行校正炫掐，因為這些差異通常較小魁莉，而且其中一些可能反映了生物學(xué)現(xiàn)象（補充方法）。
5. 我們使用了阿法梅特里克斯 SNP 6.0 微陣列來檢測拷貝數(shù)變異募胃。
6. 一部分樣本接受了低通（2–5倍）全基因組測序（illumina Hiseq）旗唁，部分目的是為了檢測染色體拷貝數(shù)異常和染色體易位。
7. 我們利用安捷倫微陣列和 RNA-Seq 生成了基因表達譜痹束。
8. DNA 甲基化數(shù)據(jù)是通過使用 illumina Infinium（HumanMethylation27）微陣列獲得的检疫。
9. 編碼區(qū)域的 DNA 測序是通過外顯子捕獲后，在 SOLiD 或 illumina Hiseq 平臺上進行測序完成的祷嘶。
10. 所用分析方法的詳細信息在補充方法中有描述屎媳。
11. 所有原始序列文件均已存入dbGap數(shù)據(jù)庫，其余所有數(shù)據(jù)均存放在數(shù)據(jù)中心(DCC)供公眾訪問（http://cancergenome.nih.gov/）抹蚀。
12. 數(shù)據(jù)矩陣和支持性數(shù)據(jù)可在以下網(wǎng)址找到：http://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/coadread_2012/剿牺。
13. 數(shù)據(jù)也可通過系統(tǒng)生物學(xué)研究所調(diào)控組學(xué)瀏覽器（http://explorer.cancerregulome.org/）企垦、下一代聚類熱圖（http://bioinformatics.mdanderson.org/main/TCGA/Supplements/NGCHM-CRC）和cBio癌癥基因組門戶（http://cbioportal.org）進行探索环壤。
14. 有關(guān)數(shù)據(jù)的描述可在此網(wǎng)址找到：https://wiki.nci.nih.gov/x/j5dXAg，并在補充方法部分中給出钞诡。

Accession codes

Data deposits

數(shù)據(jù)沉積

1. dbGaP 登錄號已在補充表 1 中提供郑现。

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