Smart-seq2
Smart-seq是由路德維格癌癥研究所的 Rickard Sandberg實驗室所開發(fā)的一套在全轉錄組范圍進行單細胞RNA測序 (scRNA-seq) 的方法岛都。Smart-seq因為以全長mRNA建庫碰声，所以對轉錄本的測序覆蓋度也有所上升言缤。Smart-seq2是由Picelli等人從Smart-seq中改良而來(Picelli et al., 2013) (Picelli et al., 2014)。本文將從Smart-seq2的原理、優(yōu)點和缺點來為大家介紹這項scRNA-seq技術帽氓。
Smart-seq2建庫原理
Smart-seq2的建庫原理如下：
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單細胞分選：Smart-seq使用流式細胞儀進行細胞分選肛宋，一次最大分選細胞通量為96個。
Fluorescence Activated Cell Ssorting
- 細胞裂解：在細胞裂解液中進行細胞裂解纽门。
- 反轉錄（ 一鏈合成 ）：使用Oligo(dT) primer對帶有polyA尾的RNA( 主要是mRNA )進行反轉錄。由于使用了鼠源的反轉錄酶( Moloney Murine Leukemia Virus )進行反轉錄营罢，所以會在cDNA鏈3'端加上三個C
- 模板置換（ 二鏈合成 ）：該步使用TSO ( template-switching oligo ) 引物合成了cDNA的二鏈赏陵，從而置換了與一鏈cDNA互補的RNA。要注意的是TSO 3'端有三個G能與一鏈3'端的三個C互補饲漾，而最末端的+G是一個修飾過的G蝙搔，能增加TSO的熱穩(wěn)定性，以及其與一鏈cDNA游離的3’端的互補的能力考传。TSO 還帶有PCR所需的引物（圖中綠色的部分）吃型。
- PCR擴增：該步進行輕度的cDNA富集，將cDNA擴增至ng級即可僚楞。
- 標記：利用改造后的高活性Tn5轉座酶對DNA進行打斷的同時將接頭添加到cDNA的兩端勤晚。標記完成后的DNA片段通常在200-600bp
- PCR富集&上機測序：在進行最后一次PCR擴增后，即可上機測序泉褐。
Smart-seq2使用的測序儀為一般的Illumina 測序儀赐写，因其文庫最后都與一般的bulk RNA-seq相差無幾。
Smart-seq2建庫流程
優(yōu)缺點
優(yōu)點：
- 以全長mRNA建庫膜赃，對轉錄本覆蓋度很高挺邀，能夠知道每個外顯子的表達量，甚至可以獲取轉錄本剪接的信息
- （號稱）50pg RNA起始建庫
- 提高了可mapping reads的比例跳座，因為較少存在Drop-seq那種空液滴端铛，無細胞的情況
- mRNA sequence does not have to be known(?我覺得沒有幾種大規(guī)模測序需要提前知道序列吧)
缺點：
- 非鏈特異。無法區(qū)分正反鏈reads
- No early multiplexing（我的理解是建庫前期沒有加入UMI所以對單個細胞的分辨能力很低）
- 轉錄本長度偏好躺坟，對于大于4kb的轉錄本建庫效率較低
- 對于高豐度轉錄本的PCR偏好。在PCR過程中必然有豐度偏好性乳蓄，這也是現(xiàn)在許多使用了PCR進行文庫擴增的高通量測序protocol無法避免的”硬傷“咪橙。
- 潛在的鏈侵入偏好。Tn5轉座酶可能會偏好對某種特征的鏈進行更高效的鏈侵入虚倒。
- 使用流式細胞儀進行細胞分選美侦，效率較低，一次測序細胞通量不高魂奥。
完菠剩。
參考資料：
- https://www.illumina.com/science/sequencing-method-explorer/kits-and-arrays/smart-seq2.html
- Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2
- Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods
- http://cn.fluidigm.com/applications/single-cell-analysis
