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導(dǎo)讀
在單細(xì)胞研究的大潮中买猖，新的測(cè)序方法層出不窮。不過(guò)，很少有人對(duì)這些方法進(jìn)行系統(tǒng)的比對(duì)郭卫。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enard最近領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)，在小鼠胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)研究中比較了一些常用的單細(xì)胞測(cè)序方法背稼，包括Smart-seq贰军、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq蟹肘。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個(gè)具有里程碑意義的重要技術(shù)词疼。實(shí)際上，能夠從單細(xì)胞生成全長(zhǎng)cDNA的測(cè)序方案并不多帘腹，Smart-seq就是其中之一贰盗。對(duì)于等位基因特異性表達(dá)或者剪接變體研究來(lái)說(shuō)，覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情阳欲。
Fluidigm C1單細(xì)胞制備系統(tǒng)能夠自動(dòng)完成Smart-seq步驟舵盈。你只需要將制備好的細(xì)胞懸液加進(jìn)去陋率，儀器就會(huì)分離并裂解細(xì)胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA秽晚，再對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增瓦糟。擴(kuò)增后的cDNA可以拿來(lái)測(cè)序，也可以進(jìn)行qPCR檢測(cè)赴蝇。
在Enard的比較研究中菩浙，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq最為靈敏，成本也最高句伶。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用劲蜻，不過(guò)這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實(shí)健康單細(xì)胞的存在考余。
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴(kuò)增的常用測(cè)序方法先嬉。線性擴(kuò)增的主要優(yōu)勢(shì)是錯(cuò)誤率比較低，不過(guò)線性擴(kuò)增和PCR都存在序列依賴性偏好楚堤。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年疫蔓，主要是分離單細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段钾军，給它們貼上代表其細(xì)胞來(lái)源的條碼鳄袍。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴(kuò)增方法生成文庫(kù)花費(fèi)的時(shí)間要稍微長(zhǎng)一點(diǎn)吏恭。不過(guò)拗小，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進(jìn)行混合，大大減少了手動(dòng)操作的時(shí)間樱哼。PCR是在最后階段使用的哀九，主要是為了連接正確的測(cè)序接頭，CEL-seq開發(fā)者紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到搅幅。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的阅束，大約兩天時(shí)間生成測(cè)序文庫(kù)和測(cè)序數(shù)據(jù)，Yanai指出茄唐。需要注意的是息裸，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的3’端沪编。Enard等人并沒有親自嘗試著一技術(shù)呼盆，只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項(xiàng)研究來(lái)看蚁廓，CEL-seq的重現(xiàn)性最好访圃。
GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學(xué)工具。Yanai研究團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)新版本CEL-seq2相嵌，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍腿时。
SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術(shù)采用的是PCR擴(kuò)增况脆。該技術(shù)需要結(jié)合流式細(xì)胞儀（FACS）或者其他細(xì)胞分選方法，把單細(xì)胞分配到微孔里去批糟。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似格了，只不過(guò)SCRB-seq會(huì)整合特異性的細(xì)胞條碼，以分辨擴(kuò)增分子的來(lái)源跃赚，更準(zhǔn)確的定量轉(zhuǎn)錄本笆搓。此外性湿，SCRB-seq并不生成全長(zhǎng)cDNA纬傲，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。
2014年肤频，開發(fā)者們將SCRB-seq技術(shù)提前發(fā)布在BioRXiv上叹括。隨后他們對(duì)這一技術(shù)進(jìn)行了更新，并將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”宵荒。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術(shù)服務(wù)汁雷，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺(tái)上。據(jù)說(shuō)Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案报咳。SCRB-seq目前是Enard最中意的測(cè)序方法侠讯，它不僅適用于單細(xì)胞RNA測(cè)序，還能支持大量細(xì)胞（bulk）的RNA測(cè)序暑刃∠徜觯可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測(cè)序流程與FACS對(duì)接起來(lái)岩臣。
DROP-seq和inDROP
哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)了以微滴為基礎(chǔ)的兩種獨(dú)立技術(shù)Drop-seq和inDrop溜嗜。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細(xì)胞一起裝入微小的液滴，建立了快速架谎、廉價(jià)炸宵、高通量的單細(xì)胞RNA-seq方法。這兩種技術(shù)將細(xì)胞隔離在微小的液滴中谷扣，裝上用于擴(kuò)增的條碼引物土全，由此檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的細(xì)胞。研究者們認(rèn)為会涎，Drop-seq和inDrop能夠幫助生物學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和分類人體細(xì)胞裹匙，繪制大腦等復(fù)雜組織的細(xì)胞多樣性圖譜，更好地了解干細(xì)胞分化在塔，獲得更多疾病的遺傳學(xué)信息幻件。
Enard及其同事發(fā)現(xiàn)，Drop-seq在單個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)的基因數(shù)還不到Smart-seq/C1蛔溃、CEL-seq和SCRB-seq的一半绰沥。不過(guò)篱蝇，在統(tǒng)計(jì)學(xué)水平上研究差異性表達(dá)的時(shí)候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最劃算的徽曲。哈佛醫(yī)學(xué)院Steve McCarroll實(shí)驗(yàn)室去年下半年根據(jù)用戶反饋零截，在自己網(wǎng)站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
參與開發(fā)SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平臺(tái)秃臣。Semrau從Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所搬到Leiden物理研究所的時(shí)候涧衙，發(fā)現(xiàn)自己用FACS已經(jīng)不那么方便了，于是他為新實(shí)驗(yàn)室選擇了Drop-seq奥此。建立微流體芯片和液滴系統(tǒng)是整個(gè)過(guò)程中最艱難的部分弧哎，不過(guò)Semrau實(shí)驗(yàn)室的一名微流體博士后僅用三周就搞定了這些問(wèn)題。Drop-seq文庫(kù)制備是任何分子生物學(xué)研究者都熟悉的標(biāo)準(zhǔn)操作稚虎。據(jù)Semrau估計(jì)撤嫩，搭建和優(yōu)化Drop-seq大概只需要六個(gè)月時(shí)間。
